Секвенирование и аннотация хлоропластного генома Triticum militinae – “естественного мутанта” тетраплоидной пшеницы Triticum timopheevii Zhuk

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Triticum militinae Zhuk. et Migusch. – тетраплоидная пшеница с геномом GAA, считается естественным голозерным мутантом Triticum timopheevii Zhuk. Ранее для этой пшеницы проводились эксперименты по изучению кариотипа и особенностей скрещивания. Для выяснения происхождения и родства T. militinae с другими представителями пшеницевых большой интерес представляет анализ ее хлоропластного генома, который оставался неизученным. Нами впервые было проведено секвенирование и аннотация полного хлоропластного генома T. militinae, размер которого оказался равным 135898 пн. В структуре пластома этой пшеницы имеются пара инвертированных повторов размером 21552 пн каждый, область маленькой единичной копии (SSC) – 12791 пн, и область большой единичной копии (LSC) – 80003 пн. В составе хлоропластного генома T. militinae аннотировано 132 структурных гена, из которых 85 белок-кодирующих, 31 ген тРНК и четыре гена рРНК.

Полный текст

Тетраплоидная пшеница Triticum militinae Zhuk. et Migusch. (пшеница Милитины) считается естественным мутантом тетраплоидной пшеницы Triticum timopheevii Zhuk. Процесс обнаружения пшеницы Милитины от момента «выщепления» в посевах T. timopheevii в 1950 г. некоего мутанта до опубликования в 1969 г. информации о новом виде, названном T. militinae Zhuk. et Migusch., занял почти два десятилетия [1]. Но происхождение этого вида оставалось загадочным, и проведя ранее научное исследование, мы пришли к заключению, что это вполне может быть некий гибрид пшениц персидской и Тимофеева [2]. Схожее предположение высказал ранее и Н.А. Наврузбеков, отметивший, что T. militinae обнаруживает сходство с T. persicum ssp. fuliginosum и при скрещивании последней с T. timopheevii в F1 образовывались черные плотные колосья, похожие на таковые у пшеницы Милитины [3]. Н.А. Наврузбеков заключил, что T. militinae представляет собой продукт интрогрессии части генома T. persicum в геном и цитоплазму T. timopheevii, при этом посчитал ее продуктом гибридизации этих видов. Но какой из этих видов выступил материнской формой T. militinae можно выяснить путем анализа последовательностей хлоропластного генома этих пшениц. Поскольку о пластоме T. militinae до сих пор не было никакой информации, цель настоящей работы – секвенирование и аннотация хлоропластного генома пшеницы Милитины.

Семена T. militinae var. albimilitinae k-59942 (Белоруссия) были предоставлены Федеральным исследовательским центром Всероссийский институт генетических ресурсов растений (ВИР, Санкт-Петербург). Растения проращивались в теплице при 21 °С в течение трех недель, затем было собрано около 20 г зеленых листьев. Далее эти листья были помещены на 48 ч в холод (+4 °С) и темноту для уменьшения содержания крахмала.

Для выделения хлоропластной ДНК из листьев использовали метод сахарозного градиента [4] с некоторыми модификациями, к примеру, на этапе выделения хлоропластной ДНК из интактных хлоропластов использовали 0.15%-ный Triton X-100 к конечному объему образцов и далее применяли метод фенольно-хлороформной экстракции [5]. Гомогенизацию листьев проводили при помощи ступки и пестика в жидком азоте.

 

Рис. 1. Представление в виде кольца хлоропластного генома T. militinae var. albimilitinae k-59942. Визуализация пластома проведена при помощи ресурса OGDRAW. Разными цветами отображены гены, участок серого круга посередине отображает уровень GC-участков. IRA – инвертированная область повтора A, IRB – инвертированная область повтора B. Гены, расположенные за пределами внешнего круга, транскрибируются по часовой стрелке, а расположенные внутри гены – против часовой стрелки.

 

На начальном этапе секвенирования был проведен контроль качества выделенной хлоропластной ДНК. Для этого концентрация ДНК была измерена на спектрофотометре NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США) и проведена оценка соотношений A260/280 и А260/230. Количество ДНК определяли флуориметрическим методом с использованием набора SpectraQ BR (Raissol, Россия) и флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Подготовка ДНК-библиотек проводилась методом shotgun при помощи набора SG GM Plus (Raissol). В работу по секвенированию брали 200 нг хлоропластной ДНК. На первом этапе подготовки проводилась ферментативная фрагментация хлоропластной ДНК до размера фрагментов 350 пн с одновременным восстановлением концов. На втором этапе проводились лигирование адаптеров и очистка продукта реакции на магнитных частицах Smart beads (Raissol, Россия). На третьем этапе проводились индексная ПЦР и очистка продукта реакции на магнитных частицах Smart beads (Raissol). Контроль качества полученной ДНК-библиотеки проводили при помощи биоаналайзера Qsep400 (Bioptic, Тайвань). Флуориметрическое измерение концентрации ДНК-библиотеки проводили с использованием набора SpectraQ BR (Raissol) и флуориметра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific). ДНК-библиотеки пулировали и проводили секвенирование при помощи набора FASTASeq 300 Sequencing Kit V1.0 100 M reads/flow cell на секвенаторе Genolab M (GeneMind, Китай). Режим секвенирования 2´-х 150 пн. Файлы формата base были демультиплексированы на приборе Genolab M с получением файлов с расширением fastq. В общей сложности было получено 13 млн чтений. Чистку чтений проводили при помощи программы Trimmomatic v0.22 [6]. Чтения, содержащие неопределенные нуклеотиды “N”, были удалены. Сборку пластома проводили при помощи программы NOVOwrap [7] с использованием последовательности хлоропластного генома T. timopheevii (KJ614408) в качестве референсного. Полный хлоропластный геном T. militinae был аннотирован при помощи ресурса Chloroplast Genome Annotation, Visualization, Analysis, and GenBank Submission 2 (CPGAVAS2) (http://47.96.249.172:16019/analyzer/home) [8]. Круговую карту хлоропластного генома визуализировали при помощи программы OGDRAW (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html) [9].

Размер хлоропластного генома T. militinae var. albimilitinae составил 135898 пн. Длина области инвертированных повторов – 21552 пн, области SSC – 12791 пн, области LSC – 80003 пн. Содержание GC-пар во всем пластидном геноме T. militinae – 38.3%, в области SSC оно составляет 32.19%, в области LSC – 36.28%. В области IR T. militinae GC-содержание достигает 43.91%.

У пшеницы Милитины было аннотировано 132 структурных гена, из которых 85 белок-кодирующих, 31 ген тРНК и четыре гена рРНК. Семь генов, кодирующих белки (rps19, rpl2, rpl23, ndhB, rps7, rps12, rps15), восемь генов тРНК (trnH-GUG, trnM-CAU, trnL-CAA, trnV-GAC, trnT-CGU, trnA-UGC, trnR-ACG, trnN-GUU), четыре гена рРНК (rRNA4.5, rRNA23, rRNA16 и rRNA5) были дублированы из-за того, что находятся в области повтора IR. При этом в SSC-области обнаружено девять белок-кодирующих генов и один ген тРНК, в LSC-области – 69 белок-кодирующих генов и 22 гена тРНК. Кроме того, из 132 генов 14 имеют по одному интрону (trnK-UUU, rps16, trnS-CGA, atpF, trnV-UAC, petB, petD, rpl16, rpl2, ndhB, trnI-GAU, trnA-UGC, ndhA, trnL-UAA) и один ген (ycf3) – два интрона. Самый крупный интрон (2558 пн) находится в гене trnK-UUU, внутри которого располагается другой ген – matK. Также в хлоропластном геноме T. militinae присутствует транс-сплайсируемый ген rps12. Все полученные результаты представлены на рис. 1 в виде кольцевой структуры, полученной при помощи программы OGDRAW. Различные цветовые блоки отображают принадлежность генов к тем или иным функциональным группам.

Представляет большой интерес происхождение пшеницы Милитины, чаще всего она считается мутантом пшеницы Тимофеева. Но секвенирование хлоропластного генома этого вида и его сравнение с другими подобными геномами пшениц показывает, что T. militinae, скорее всего, не мутант, а гибрид, чему мы уделили отдельное внимание в нашей предыдущей публикации [2]. Однако для окончательных выводов требуются еще дополнительные исследования хлоропластных геномов других пшениц, в особенности T. persicum. Нуклеотидная последовательность хлоропластного генома T. militinae была депонирована в GenBank и доступна по номеру OR936057.

 

Авторы выражают искреннюю признательность коллективу Отдела пшениц Всероссийского института генетических ресурсов растений (ВИР, Санкт-Петербург) за предоставление семенного материала для исследований.

Работа выполнена в рамках государственного контракта по проекту РНФ № 23-24-00275 “Филогенетические взаимоотношения отдельных видов пшенично-эгилопсного комплекса разных уровней плоидности через призму их полных хлоропластных геномов с прицелом на происхождение B- и G-субгеномов полиплоидных форм пшениц линий turgidum–aestivum и timopheevii–zhukovskyi”.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объектов животных и людей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Об авторах

А. Р. Кулуев

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: kuluev.azat91@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Р. Т. Матниязов

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: kuluev.azat91@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Б. Р. Кулуев

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: kuluev.azat91@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Л. Ю. Привалов

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: kuluev.azat91@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

А. В. Чемерис

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: kuluev.azat91@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Список литературы

  1. Жуковский П.М., Мигушова Э.Ф. Наиболее высокоиммунный эндемичный генофонд для выведения устойчивых сортов пшеницы путем отдаленной гибридизации // Вестник с.-х. наук. 1969. № 2. С. 9–20.
  2. Кулуев А.Р., Матниязов Р.Т., Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Triticum militinae Zhuk. et Migusch. – точно не мутант T. timopheevii Zhuk., как считалось долгие годы // Biomics. 2023. V. 15. № 3. P. 213–217. https://doi.org/10.31301/2221-6197.bmcs.2023-19
  3. Наврузбеков Н.А. К происхождению Triticum militinae Zhuk. et Migusch. // Ботанические и генетические ресурсы флоры Дагестана. Махачкала: Даг. фил. АН СССР, 1981. С. 121–122.
  4. Shi C., Hu N., Huang H. et al. An improved chloroplast DNA extraction procedure for whole plastid genome sequencing // PLoS One. 2012. V. 7. № 2. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0031468
  5. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms of large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. V. 78. P. 673–678.
  6. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data // Bioinformatics. 2014. V. 30. P. 2114–2120. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
  7. Wu P., Xu C., Chen H. et al. NOVOWrap: An automated solution for plastid genome assembly and structure standardization // Mol. Ecol. Res. 2021. V. 21(6). P. 2177–2186. https://doi.org/10.1111/1755-0998.13410
  8. Shi L., Chen H., Jiang M. et al. CPGAVAS2, an integrated plastome sequence annotator and analyzer // Nucl. Acids Res. 2019. V. 47. P. W65–W73. https://doi.org/10.1093/nar/gkz345
  9. Greiner S., Lehwark P., Bock R. Organellar Genome DRAW (OGDRAW) version 1.3.1: expanded toolkit for the graphical visualization of organellar genomes // Nucl. Acids. Res. 2019. V. 47. P. W59–W64.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Представление в виде кольца хлоропластного генома T. militinae var. albimilitinae k-59942. Визуализация пластома проведена при помощи ресурса OGDRAW. Разными цветами отображены гены, участок серого круга посередине отображает уровень GC-участков. IRA – инвертированная область повтора A, IRB – инвертированная область повтора B. Гены, расположенные за пределами внешнего круга, транскрибируются по часовой стрелке, а расположенные внутри гены – против часовой стрелки.

Скачать (498KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».