Genetic polymorphism of Siberian larch ((Larix sibirica Ledeb.) in contrasting ecotopes of the Republic of Khakassia

Full Text

Лиственница сибирская (Larix sibirica Ledeb.) относится к числу основных лесообразующих видов бореальной зоны Евразии. На территории России леса с участием лиственницы (Larix Mill.) занимают около 264 млн га, или 38% всей лесопокрытой площади. В пределах области своего распространения лиственница сибирская образует широкий спектр морфологической изменчивости, проявляющийся в наличии внутривидовых форм и морфотипов деревьев, адаптированных к различным условиям произрастания [1]. При исследовании генетической изменчивости популяций L. sibirica севера Красноярского края, Урала, Алтая и Тывы установлено отсутствие тесной взаимосвязи между географическим положением выборок и степенью их генетической подразделенности при высоком уровне внутрипопуляционного генетического разнообразия [2, 3]. Тем самым диагностирована важная особенность L. sibirica: основной пул генетической изменчивости вида сосредоточен на внутрипопуляционном (ценопопуляционном) уровне, доля межпопуляционной (географической) компоненты значительно меньше. Оценка генетического разнообразия ряда видов хвойных, в том числе L. sibirica, на ценопопуляционном уровне позволила выявить адаптивную составляющую их внутривидовой дифференциации [4–7]. При выборе экспериментальных объектов для подобного рода исследований целесообразно фокусировать внимание на тех частях ареалов, где в целом оптимальные для вида условия произрастания характеризуются значительной почвенно-гидрологической и фитоценотической неоднородностью, наличием орографических и фенологических межпопуляционных барьеров [8].

Таким критериям соответствует южносибирская часть ареала L. sibirica в пределах Республики Хакасия, где на относительно небольшой площади сосредоточены степные, лесные, луговые и болотные фитоценозы, сложно структурированные по высотным поясам гор, экспозициям невысоких кряжей, межгорным речным долинам и приозерным котловинам со свойственными для данных ландшафтов мозаичностью и резкими градиентами факторов среды [9]. Здесь широко представлены чистые и смешанные древостои L. sibirica горнотаежного, лесостепного и пойменно-болотного рядов развития, различающиеся по своей морфотипической, возрастной и пространственной структуре, по уровню и характеру антропогенной трансформации [10–12].

Цель настоящей работы – диагностика генетического разнообразия, структуры и внутривидовой дифференциации ценопопуляций лиственницы сибирской, произрастающих в Республике Хакасия.

Материалы и методы

Объектами исследования послужили пять ценопопуляций L. sibirica из различных экотопов Республики Хакасия. Информация о местоположении пунктов сбора материала, об особенностях фитоценозов и морфологии деревьев представлена в табл. 1 и на рис. 1. Отбор экспериментальных материалов (образцов хвои) проводился в июле 2020 г. Общее количество отобранных деревьев составило 150 шт., количество образцов в каждой выборке – 30.

 

Таблица 1. Биоэкологическая характеристика ценопопуляций L. sibirica в Ширинском и Орджоникидзевском районах Республики Хакасия

Код ценопопуляционной выборки, географические координаты	Орографические и фитоценотические условия, таксационные характеристики насаждений
TNZh 54°16’ с. ш., 89°38’ в. д.	Лиственничное редколесье (13–15 экз./га) высокотравно-луговое полидоминантное (свыше 140 видов травянистых растений) на темно-серых и дерново-подзолистых почвах пологих склонов долины р. Тунгужуль (правый приток р. Белый Июс). 600–640 м над ур. моря. Возраст деревьев – 180–360 лет, высота – 18–34 м, диаметр – 58–92 см. Большое разнообразие крупномерных морфотипов деревьев: низкоросло-кряжистые крупносуковатые; с уплощенно-шатровыми, широко раскидистыми, куполообразными и даже сдвоенными формами крон; сильно сбежистыми, многосучковатыми и толстокорыми стволами и др.
KR 54°24’ с. ш., 89°59’ в. д.	Лиственничное редколесье (6–17 экз./га) остепненно-разнотравное на сухих примитивных почвах разрушающихся глыбистых останцев, их каменистых россыпей скального обрамления поймы р. Карыш (бассейн оз. Итколь). 500–520 м над ур. моря. Возраст деревьев – 90–140 лет, высота – 5–8 м, диаметр – 13–16 см. Одиночно стоящие деревья представлены различными формами: кривоствольными, мелкосуковатыми, нередко суховершинными; в группах преобладают прямоствольные, сильно сбежистые, крупносуковатые, низкорослые деревья с этажно-асимметричными, либо уплощенными, флагообразными и иными формами крон
AG-s 54°58’ с. ш., 89°15’ в. д.	Редкостойный лиственничник (40–60 экз./га) на сухих и свежих минеральных почвах по южному склону в долине оз. Агаскыр – бассейн р. Печище (левый приток р. Черный Июс). 540–555 м над ур. моря. Возраст деревьев – 130–185 лет, высота – 19–23 м, диаметр – 44–56 см. Большую часть крупномерных деревьев характеризуют низкие, раскидистые, суковатые кроны однобоко-шатровой формы, возможно, сформировавшиеся под влиянием системного ветрового воздействия
AG-b 54°58’ с. ш., 89°16’ в. д.	Болотный лиственничник с елью на пятнисто-мерзлотных, среднемощных (до 120 см), избыточно влажных торфяных почвах эутрофного ряда водно-минерального питания в долине оз. Агаскыр – бассейн р. Печище (левый приток р. Черный Июс). 540 м над ур. моря. Выборка сформирована тонкомерным подростом (2–2.5 тыс. экз./га, возраст – 50–70 лет, высота – 4–6 м, диаметр – 8–11 см)
FRK 54°30’ с. ш., 89°46’ в. д.	Лиственничное редколесье паркового типа (8-9 экз./га), низкоросло-разнотравное с кустарниками на остепненных лугах южной оконечности долины оз. Фыркал (правобережная пойма р. Белый Июс). 540 м над ур. моря. Возраст деревьев – 160–200 лет, высота – 12–14 м, диаметр – 50–60 см. Низкорослые, поодиночке рассеянные деревья с сильно сбежистыми стволами и крупными скелетными ветвями, формирующие флагообразные, зонтиковидные, конусообразные, асимметрично-шатровые, разветвленные, щитовидные и другие формы крон

 

Рис. 1. Карта расположения изученных ценопопуляций L. sibirica в Ширинском и Орджоникидзевском районах Республики Хакасия (кодировка ценопопуляционных выборок соответствует табл. 1).

 

Для проведения генетического анализа в выборках лиственницы сибирской были использованы ядерные микросателлитные маркеры, разработанные ранее сотрудниками лаборатории лесной геномики СФУ для L. sibirica, а также японскими исследователями K. Isoda и A. Watanabe для лиственницы Кемпфера (Larix kaempferi (Lamb.) Carriѐre) [13, 14].

Отбор праймеров осуществляли путем подбора и оптимизации условий амплификации программы ПЦР. По результатам данного тестирования были отобраны полиморфные локусы, демонстрирующие хорошо интерпретируемые электрофореграммы. Отобранные полиморфные микросателлитные локусы для дальнейшего исследования выборок из популяций L. sibirica представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Отобранные ядерные микросателлитные локусы для L. sibirica

Локус	Мотив	Последовательности праймеров	Длина фрагмента, п.н.	Источник литературы
bcLK232	(AG)19	F: TGTTGCTGGGTTGTTGTTAGA R: GGGTAATAGTTCCAGTCTTTG	142–178	[14]
bcLK224	(AG)17	F: GGAGAGGCCACTACTATTATTAC R: ATGCGTTCCTTCATTCCTCT	152–168
bcLK066	(TG)12	F: GCAACCGACAATGATTACATAG R: CCTAAAACTGAACTTTGCTCAAT	155–172
Ls_954234	(ATT)15	F: TGGCGTTTGGCTAAGTTGTAA R: GGTTGATTTATGTGTGTGTATGTGG	171–204	[13]
Ls_752897	(AAG)15	F: GCAGATGTTGATACAGTGGAGG R: CAGCTTCATTTCGTGGCTAAT	216–264
Ls_417667	(AAT)16	F: CAGAGGATCTCATTCCTGTTGA R: CTCGAAGGCCAATTAGGATAAA	207–243
Ls_2672894	(TTTG)11	F: CAAAGGATGGAATGTGTCTCAA R: GTTGGTATGGTTTCCCAGAGTG	152–164
Ls_2552367	(CTAT)10	F: AAAGGTGCAATCACGTAAAGAC R: ATCGAAGCGGAAAATGTGTA	184–196
Ls_1008427	(ATAG)13	F: CACCCCTATCCCACAAATCTTA R: ATTTATCTTTGGCCCTCATGC	152–174
Ls_305132	(GTCGGA)7	F: GCAGAGCCGTTATTCGATCTAT R: CCCTCGTTTCCTCTTCTGACTA	210–240

 

Препараты тотальной ДНК были выделены модифицированным методом с применением цетилтриметиламмониумбромида (СТАВ) из образцов тканей хвои, высушенной при помощи силикагеля [15].

Для проведения ПЦР использовали готовые реакционные смеси для амплификации ДНК “GenePak PCR Core” производства ООО “Лаборатория Изоген”, содержащие ингибированную для “горячего старта” Taq-ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния. Программа амплификации включала первичную денатурацию в течение 1 мин при 94°С, затем девять циклов “touchdown” c понижением на 1°С, каждый цикл: 30 с при 94°С, 30 с при 63°С, 1 мин при 72°С; далее 24 цикла без “touchdown”: 30 с при 94°С, 30 с при 53°С, 30 с при 72°С; финальная элонгация составляла 10 мин при 72°С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле с использованием Трис-EDTA-боратного электродного буфера в камерах для вертикального фореза. Окраску геля проводили в растворе бромистого этидия. В качестве маркера стандартных длин использовали ДНК плазмиды pBR322 E. coli, обработанную рестриктазой HpaII.

Расчет основных показателей для выборок пяти ценопопуляций лиственницы сибирской был проведен при помощи программы GenAlEx 6.51b2 [16]. Ошибки генотипирования, возникшие из-за null-аллелей, были идентифицированы и скорректированы с помощью программы MICRO-CHECKER [17]. Для построения филогенетического дерева использовались пакеты adegenet и poppr в R, построение производилось методом невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA). Филогенетическое дерево было сгенерировано на основе стандартного генетического расстояния М. Нея [18]. Визуализация дерева осуществлялась с помощью онлайн-инструмента iTOL, версия 6 [19].

Результаты и обсуждение

В процессе исследования 10 ядерных микросателлитных локусов в пяти выборках лиственницы сибирской из Республики Хакасия было выявлено 45 аллельных вариантов, 29 (около 64 %) из которых оказались общими. У изученных нами ценопопуляций идентифицированные микросателлитные локусы частично различались по составу и частотам встречаемости выявленных аллелей. Наибольшее количество аллелей выявлено в следующих выборках: болотный лиственничник в долине оз. Агаскыр (AG-b) – 40 (из них 7 редких, частота встречаемости которых менее 5%); лиственничное редколесье в долине оз. Фыркал (FRK) – 39 (9 редкие); лиственничное редколесье, остепненное в пойме р. Карыш (KR) – 38 (8 редкие). У ценопопуляции из долины р. Тунгужуль (TNZh) – наиболее возрастного и крупномерного насаждения, напротив, отмечается наименьшее число аллельных вариантов – 33 (из них 3 редких). Самый высокий уровень аллельного разнообразия в исследованных выборках лиственницы имеет локус bcLK232, в котором выявлено восемь аллелей. Локус Ls_2672894 в ценопопуляции FRK оказался мономорфным.

Анализ генетического разнообразия L. sibirica в исследованных насаждениях Республики Хакасия показал (табл. 3), что наиболее высокие значения среднего числа аллелей на локус были выявлены в выборках AG-s (3.9 ± 0.348) – облесенных суходольных склонов в долине оз. Агаскыр и FRK (3.9 ± 0.458) – остепненных лугов долины оз. Фыркал, а эффективного числа аллелей на локус – в выборке AG-s (2.302 ± 0.283). Самые большие показатели наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности также выявлены в лесной выборке AG-s (H_O = 0.487 ± 0.074, H_E = 0.492 ± 0.070). В трех (AG-s, AG-b, FRK) из пяти выборок L. sibirica выявлен дефицит гетерозиготных генотипов. Высокое значение индекса фиксации Райта найдено для популяции AG-b на торфянистых почвах заболоченной долины оз. Агаскыр (0.054 ± 0.043).

 

Таблица 3. Показатели генетической изменчивости, рассчитанные для пяти выборок L. sibirica по результатам SSR-анализа

Ценопопуляционные выборки	NA	NE	HO	HE	F
TNZh	3.3 ± 0.260	2.03 ± 0.224	0.487 ± 0.060	0.454 ± 0.058	–0.083 ± 0.053
KR	3.8 ± 0.416	2.04 ± 0.172	0.467 ± 0.056	0.469 ± 0.056	–0.008 ± 0.055
AG-s	3.9 ± 0.348	2.30 ± 0.283	0.487 ± 0.074	0.492 ± 0.070	0.012 ± 0.053
AG-b	3.6 ± 0.340	1.87 ± 0.174	0.390 ± 0.057	0.419 ± 0.059	0.054 ± 0.043
FRK	3.9 ± 0.458	2.21 ± 0.248	0.473 ± 0.073	0.483 ± 0.068	0.030 ± 0.047
В среднем для всех исследованных ценопопуляций	3.7 ± 0.162	2.09 ± 0.098	0.461 ± 0.028	0.463 ± 0.027	0.0004 ± 0.023

Примечание. N_A – среднее число аллелей на локус, N_E – эффективное число аллелей на локус, H_O – наблюдаемая гетерозиготность, H_E – ожидаемая гетерозиготность, F – индекс фиксации; ± – стандартная ошибка.

 

Анализ данных по генетическому полиморфизму исследованных выборок показал, что в целом значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (H_O = 0.461, H_E = 0.463) сопоставимы с аналогичными показателями, приведенными для L. sibirica из других местопроизрастаний [3, 20–22]. Однако выявленное пониженное аллельное разнообразие (N_A = 3.7; N_E = 2.09), возможно, связано с небольшими размерами и орографической изоляцией между собой хотя и территориально близких, но растущих в контрастных экотопах ценопопуляций L. sibirica.

Стоит также отметить, что повышенные значения основных показателей генетической изменчивости, полученные другими авторами, связаны еще и с разными наборами микросателлитных локусов, используемых в исследованиях. Для анализа популяционно-генетической изменчивости лиственницы сибирской ранее в основном использовались наиболее высоко вариабельные динуклеотидные микросателлитные локусы [3, 20–22]. В настоящей работе мы также использовали динуклеотидные локусы, но основная доля приходилась на три-, тетра- и гексануклеотидные локусы (7 из 10 локусов).

В трех (AG-s, AG-b, FRK) из пяти выборок L. sibirica выявлен дефицит гетерозиготных генотипов, наибольший наблюдается в популяции из болотного лиственничника долины оз. Агаскыр (F = 0.054). Это указывает на вероятное близкородственное скрещивание в популяции, сформированной на момент отбора образцов главным образом молодыми деревьями – потомством небольшого числа деревьев, сохранившихся после интенсивных рубок, которые проводились в лиственничниках Хакасии в середине ХХ в. Ближе всего к равновесному состоянию (F = –0.008) находится популяция из долины р. Карыш – антропогенно наименее нарушенное насаждение лиственницы в данном исследовании. Дефицит гетерозиготных генотипов ранее также был выявлен при изучении генетического разнообразия природных популяций лиственницы сибирской с Урала [3, 22].

Анализ популяционной структуры и степени генетической подразделенности ценопопуляций лиственницы сибирской (табл. 4) [23] показал, что в изучаемых выборках наблюдается 0.8%-ный избыток гетерозиготных генотипов относительно популяции (F_IS = –0.008 ± 0.031) и 3.4%-ный дефицит гетерозиготных генотипов (F_IT = 0.034 ± 0.034) относительно вида. Полокусные значения показывают, что наиболее значимый дефицит гетерозигот наблюдается в локусах Ls_1008427 и Ls_954234. Коэффициент инбридинга популяции относительно вида в целом (F_ST), отражающий степень подразделенности популяций, варьирует от 0.013 (Ls_2672894) до 0.091 (bcLK232), составляя в среднем 0.043 ± 0.007. Это свидетельствует о том, что только около 4.3% выявленной генетической изменчивости у изученных выборок лиственницы сибирской распределяется между популяциями. Внутри популяций сосредоточено около 95.7% всего генетического разнообразия. Наибольший вклад в дифференциацию изученных популяций вносят локусы bcLK232 и bcLK224 (см. табл. 4).

 

Таблица 4. Значение показателей F-статистик Райта для L. sibirica

Локус	N	χ2	FIS	FIT	FST
bcLK232	8	63.751 (1.32 · 10^–4)***	0.020	0.109	0.091
bcLK224	4	49.813 (5.125 · 10^–9)***	0.053	0.117	0.068
bcLK066	4	58.437 (9.344 · 10^–11)***	–0.093	–0.048	0.041
Ls_954234	5	157.324 (1.155 · 10^–28)***	0.092	0.118	0.028
Ls_752897	5	50.711 (1.974 · 10^–7)***	–0.043	0.000	0.041
Ls_417667	3	94.971 (1.873 · 10^–20)***	–0.191	–0.170	0.018
Ls_2672894	2	0.086 (0.770)ns	–0.037	–0.024	0.013
Ls_2552367	5	150.415 (3.063 · 10^–8)***	–0.005	0.039	0.044
Ls_1008427	5	56.307 (1.798 · 10^–8)***	0.156	0.201	0.053
Ls_305132	4	63.819 (7.514 · 10^–12)***	–0.027	0.002	0.029
Среднее			–0.008 ±0.031	0.034 ±0.034	0.043 ±0.007

Примечание. N – число аллелей; χ² – тест на гетерогенность, уровень значимости ns – not significant, *** – P < 0.001; F_IS – коэффициент инбридинга особи относительно популяции; F_IT – коэффициент инбридинга особи относительно вида; F_ST – коэффициент межпопуляционной дифференциации; ± – стандартная ошибка.

 

Анализ гетерогенности аллельных частот с помощью критерия χ² показал, что у одного (Ls_2672894) из десяти исследованных локусов наблюдаемые различия статистически недостоверны. У остальных локусов различия по частотам аллелей высоко достоверны (P < 0.001) (см. табл. 4).

Результаты теста распределения генетической изменчивости (AMOVA) с учетом иерархических уровней показали, что наибольшее генетическое разнообразие было найдено внутри особей (94 из 100%). Генетическое разнообразие между особями, составляющее 2 и 4%, приходится на межпопуляционную составляющую.

Оценка генетической дифференциации между исследованными популяциями лиственницы сибирской была проведена с использованием стандартного генетического расстояния (D_N) М. Нея [18] на основании частот аллелей десяти микросателлитных локусов. Наименьшее генетическое расстояние (0.036) было выявлено между экотопически максимально сходными (лесными) ценопопуляциями TNZh и AG-s (табл. 5). Наибольшее генетическое расстояние (0.077), напротив, было диагностировано между экотопически контрастными ценопопуляциями – болотной AG-b и остепненной FRK.

 

Таблица 5. Попарные генетические расстояния Нея для ценопопуляционных выборок L. sibirica

Ценопопуляционные выборки	TNZh	KR	AG-s	AG-b	FRK
TNZh	0.000
KR	0.038
AG-s	0.036	0.060
AG-b	0.061	0.052	0.041
FRK	0.046	0.042	0.072	0.077	0.000

 

Выявленный уровень генетической дифференциации в пяти выборках лиственницы сибирской наглядно показывает расположение ценопопуляций на плоскости двух координат (рис. 2).

 

Рис. 2. Проекция изученных ценопопуляционных выборок L. sibirica на плоскости двух координат по данным PCA-анализа матрицы генетических расстояний (кодировка ценопопуляционных выборок соответствует табл. 1).

 

Результаты теста Мантела (R = 0.479, P = 0.100) свидетельствуют об отсутствии корреляции между матрицами генетического и географического расстояния в исследованном регионе [24].

Филогенетическое дерево для пяти выборок лиственницы сибирской из разных экотопов Республики Хакасия, построенное методом невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA), сгенерированное на основе стандартного генетического расстояния М. Нея [18] с оценкой бутстреп-поддержки узлов ветвления, иллюстрирует группировку ценопопуляций (рис. 3).

 

Рис. 3. Филогенетическое дерево пяти ценопопуляций L. sibirica (кодировка ценопопуляционных выборок соответствует табл. 1).

 

На дендрограмме четко выделяются две группы с бутстреп-поддержкой в 100%. В первую со значением бутстрепа 65.36 вошли выборки из долины р. Карыш (KR) и из долины оз. Фыркал (FRK) (F_ST = 0.019, D_N = 0.042). Данные ценопопуляции – ландшафтные изоляты на крайнем пределе распространения древесной растительности в Ширинской степи – максимально близки между собой по экологическим условиям и таксационным характеристикам относительно других выборок. Второй кластер объединил лесные выборки лиственницы из восточных отрогов Кузнецкого Алатау: долин р. Тунжугуль и оз. Агаскыр (F_ST = 0.024, D_N = 0.046). Образующие данные выборки ценопопуляции лиственницы (болотный и суходольный лиственничники) экотопически поливариантны по условиям водно-минерального питания, почвенным характеристикам и фитоценотической структуре. Весьма вероятно, что совокупность этих факторов определяет крайне низкие для данного кластера значения бутстреп-поддержки, а следовательно, и сомнительную достоверность его топологии.

В целом на основании данного филогенетического дерева с низкими значениями бутстрепа внутри полученных кластеров – “степного” и “лесного” – можно сказать о том, что ценопопуляции лиственницы в пределах каждого из этих двух контрастных экотопов Республики Хакассия генетически неоднородны и слабо дифференцированы. Вероятными причинами этого являются внутрипопуляционная гетерогенность условий произрастания и слабая репродуктивная изоляция территориально смежных в пределах той или иной межгорной долины ценопопуляций лиственницы сибирской.

Авторы благодарят Яну Викторовну Стенину, выпускницу магистерской программы “Геномика и биоинформатика” кафедры геномики и биоинформатики ИФБ и БТ СФУ, за участие в лабораторных исследованиях и помощь в обработке полученных данных.

Работа выполнена в рамках Государственного задания ФИЦ КНЦ СО РАН по теме “Биоразнообразие лесов Сибири: эколого-динамический, генетико-селекционный, физико-химический и ресурсно-технологический аспекты” № FWES-2024-0028.

Эта статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

N. V. Oreshkova

Sukachev Institute of Forest – a separate division of the Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences”; Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences”; Siberian Federal University

Author for correspondence.
Email: oreshkova@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk; Krasnoyarsk; Krasnoyarsk

A. V. Pimenov

Sukachev Institute of Forest – a separate division of the Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences”

Email: oreshkova@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk

T. S. Sedel’nikova

Sukachev Institute of Forest – a separate division of the Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences”

Email: oreshkova@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk

S. P. Efremov

Sukachev Institute of Forest – a separate division of the Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences”

Email: oreshkova@ksc.krasn.ru
Russian Federation, Krasnoyarsk

References

Supplementary files