The role of long non-coding RNAs in plants

Full Text

Некодирующие РНК (нкРНК) выполняют в геномах растений ряд важнейших функций, связанных с регуляцией экспрессии генов, гомеостазом физиологических параметров растений. Знание функциональных особенностей нкРНК позволяет целенаправленно улучшать различные свойства растений [1–3], что обусловливает интерес к изучению этих молекул. Некодирующие РНК можно разделить на две группы: cтруктурные некодирующие (рибосомные РНК, транспортные РНК, малые ядерные РНК, малые ядрышковые РНК) и регуляторные некодирующие (малые некодирующие РНК и длинные некодирующие РНК) [4]. Наименее изученными из всех перечисленных классов молекул являются длинные нкРНК [5, 6].

Длинные некодирующие РНК (днРНК) являются важным классом некодирующих РНК в живых организмах и представляют собой линейные или кольцевые молекулы РНК, содержащие более 200 нуклеотидов без открытых рамок считывания [4, 6]. Функции и структура днРНК слабо изучены в сравнении с белок-кодирующими генами и генами малых некодирующих РНК. Однако участие днРНК выявлено в регуляции экспрессии генов [7], формировании структуры макромолекулярных комплексов [8], во взаимодействии с белками [9], в патогенезе [10]. Наиболее активно днРНК изучаются экспериментально и биоинформатически у человека и других модельных видов (мышь, крыса, дрозофила и т. д.). Эти исследования позволяют идентифицировать последовательности днРНК в геномах и транскриптомах, расшифровать важные особенности их структуры, регуляции экспрессии и функционирования, классифицировать их по структуре и функциям. На сегодняшний день эти методы позволили идентифицировать большое количество последовательностей днРНК у животных. Так, согласно базе данных Gencode [11], в геноме мыши описано около 13000 генов днРНК. В геноме человека насчитывается более 18000 генов днРНК [12]. Изучение днРНК у животных позволило классифицировать их по молекулярному механизму функционирования (промоторные, энхансерные, теломерные, сигнальные и др.) [13–15], положению в геноме (межгенные, интронные, антисмысловые и др.) [7, 16–18]. Эти исследования приводят к созданию специализированных баз данных, посвященных днРНК и содержащих последовательности десятков тысяч днРНК и их структурно-функциональную аннотацию [19, 20]. Вследствие отсутствия у первичной структуры днРНК четко выраженных функциональных сегментов (как, например, домены у белковых последовательностей) на сегодняшний день предсказание функции днРНК на основе первичной структуры является сложной задачей [15, 21, 22].

Следует отметить, что получение экспериментальной информации о структуре и функции днРНК является трудоемким процессом и требует проведения дорогостоящих экспериментов. Поэтому для изучения этого класса РНК активно используются методы биоинформатики. В частности, они направлены на широкомасштабное распознавание последовательностей днРНК в геномах и транскриптомах [23–25], предсказание их взаимодействий с белками [26], с мРНК и другими некодирующими РНК [27], на регуляцию экспрессии [7], эволюцию [28, 29] и предсказание их структуры и функций [30].

днРНК также известны и у растений. Интересно отметить, что, несмотря на ряд специфических особенностей, функциональные и структурные характеристики днРНК животных и растений имеют много общего [31]. Известно, что у растений днРНК принимают участие в регуляции устойчивости к холодовому, солевому, тепловому стрессу [1–3], оказывают влияние на устойчивость к гипоксии [32], принимают участие в развитии плодов, корня и листьев [17, 33]. Тем не менее до сих пор наши знания о днРНК растений являются менее полными, чем о днРНК животных. Исследования [34, 35] показывают, что последовательности днРНК в процессе эволюции быстро накапливают замены, так что даже с последовательностями из близкородственных видов организмов они имеют слабую гомологию. Применение концепции пан-генома, которая подразумевает охват последовательностей, подверженных структурной вариации и, возможно, отсутствующих в референсной последовательности каждого представителя вида, позволит повысить эффективность исследования и общее количество предсказанных днРНК [36–40].

Настоящий обзор посвящен днРНК растений и включает описание их молекулярных и биологических функций, экспериментальных и биоинформатических методов идентификации, закономерностям эволюции, выявлению и анализу днРНК в масштабах пан-геномов и пан-транскриптомов.

Классификация днРНК по положению в геноме

днРНК классифицируют по многим параметрам, однако наиболее часто используют классификацию по положению в геноме относительно известных белок-кодирующих генов. Согласно этой классификации, днРНК делятся на четыре крупных класса [35], рис. 1:

1) интронные — перекрываются с интроном гена;

2) антисмысловые — ориентированы против направления транскрипции гена, кодирующего белок;

3) межгенные — расположены между двумя локусами генов;

4) смысловые — ориентированы в направлении транскрипции гена, кодирующего белок.

 

Рис. 1. Классификация днРНК на основе расположения и ориентации относительно ближайших или перекрывающихся генов, кодирующих белки.

 

Инициация транскрипции интронных днРНК происходит в направлении транскрипции гена мишени, терминация происходит в области перекрывания с экзоном гена мишени [41].

Транскрипция антисмысловых днРНК начинается на 3'-конце гена, кодирующего белок. Эти днРНК разделяют на две группы в зависимости от цис- и транс-геометрической изомерии. Транскрипция цис-изомеров антисмысловой днРНК (цис-днРНК) происходит с противоположного конца локуса белок-кодирующего гена, с которым данный транскрипт перекрывается. За счет этого днРНК имеет высокий уровень комплементарности с данным геном. Транскрипция транс-изомеров антисмысловой днРНК происходит с локуса соседнего белок-кодирующего гена, с которым перекрывается данный транскрипт. Таким образом, подобные транскрипты могут перекрываться с несколькими генами, но при этом имеют низкий уровень комплементарности с ними [42].

Длина межгенных днРНК превышает 200 нуклеотидов, данные транскрипты не перекрываются с кодирующими белки генами. Особенности транскриптов данного класса: высокая консервативность, выраженная тканеспецифичность, высокая стабильность. В работе [43] биоинформатическими методами было показано взаимодействие межгенных днРНК с мобильными элементами. Проведенное исследование предоставляет систематическую оценку вклада мобильных элементов в состав, эволюционное происхождение и регуляцию днРНК.

Смысловые днРНК транскрибируются в направлении транскрипции кодирующих белок генов. Это делает их выделение в отдельный класс днРНК или вообще идентификацию как днРНК достаточно противоречивым. Структурные характеристики таких РНК (длина, количество экзонов и интронов) могут совпадать со структурой гена, кодирующего белок. Например, в работе [17] предполагается, что транскрипты данного класса днРНК могут полностью перекрываться с генами, кодирующими белок. Однако в работе [41] описываются примеры днРНК, возникших за счет альтернативного сплайсинга или укорачивания первого либо последнего экзона генов. Авторы предполагают, что эти гены могут представлять изоформы белков, кодируемых этими генами, а не днРНК. Например, в работе [34, 41] РНК, перекрывающиеся с экзоном гена, кодирующего белок, не считаются днРНК. Для растений найдено мало данных транскриптов, и ни для одного из них нет функциональной аннотации [41].

Молекулярные функции днРНК

днРНК имеют несколько общих характеристик с генами, кодирующими белки, что затрудняет их идентификацию. Так, большинство днРНК транскрибируется с помощью РНК-полимеразы II. Они имеют сходные эпигенетические профили, наличие сигналов сплайсинга и полиаденилирования, а также сходные размеры экзонов и интронов [44, 45]. Кроме того, некоторые днРНК имеют длину, превышающую 1000 нуклеотидов. Таким образом, они могут содержать открытые рамки считывания (ОРС). Размеры подобных ОРС могут варьироваться, некоторые из них могут быть достаточно короткими. Например, в работе [46] упоминается, что днРНК в среднем могут содержать несколько транслируемых ОРС, имеющих длину 50 кодонов.

Отличительной особенностью днРНК является способность транскрибироваться РНК-полимеразой IV и V, в особенности у растений [47]. Большинство днРНК локализуются как в клеточном ядре, так и в цитоплазме [48]. Также днРНК демонстрируют низкий уровень экспрессии, при этом экспрессируются более специфично для определенных тканей [49]. Подобное наблюдается и при анализе консервативности структуры днРНК. Сравнение днРНК различных видов растений показало, что доля сходных последовательностей у разных видов мала. Однако днРНК одного вида демонстрируют достаточно высокий уровень консервативности первичной, вторичной и третичной структуры [15].

В работах [14, 15, 50] указывается, что на функционирование днРНК влияет и их внутриклеточная локализация. В работах [4, 15, 50, 51] выделяют пять основных функций днРНК, представленных на рис. 2.

 

Рис. 2. Молекулярные функции днРНК: а – сигнальные, днРНК получают сигнал для взаимодействия с ферментами, модифицирующими хроматин, для регуляции транскрипции; б – ловушки, связывают белки и препятствуют их присоединению к генам-мишеням; в – направляющие, направляют транскрипционные факторы к местам их функционирования, содействуют необходимому состоянию хроматина; г – каркасы, объединяют белки в комплексы и инициируют разные биологические процессы; д – энхансеры, могут транскрипционно активировать соседние гены.

 

Сигнальные днРНК

днРНК чаще всего экспрессируются в определенных тканях. В некоторых работах отмечается, что днРНК экспрессируется специфически в ответ на различные стимулы [4, 52–54]. В связи с этим можно предположить, что экспрессия некоторых днРНК находится под контролем транскрипционных факторов [55], осуществляется в определенный момент и в определенной ткани и может служить сигналом для запуска регуляторных процессов в клетке [55]. Такая специфическая экспрессия характерна для днРНК, которые называют сигнальными (рис. 2, а). Сигнальные днРНК могут выступать в качестве элементов регуляции. Известно, например, что сигнальные днРНК взаимодействуют с модифицирующими хроматин ферментами, такими как гистоновые метилтрансферазы, чтобы подавить экспрессию их генов-мишеней посредством образования гетерохроматина [56]. Такие взаимодействия и являются частью регуляторных и сигнальных функций данного типа днРНК.

днРНК-приманки или ловушки

днРНК-приманки связывают белки и тем самым препятствуют их взаимодействию с регуляторными районами генов-мишеней [55]. Эти днРНК косвенным образом репрессируют транскрипцию, блокируя микроРНК, модифицирующие комплексы (субъединицы хроматина), каталитические белки и факторы транскрипции [55, 57]. Также днРНК выступают в качестве ловушки для микроРНК, данный механизм взаимодействия подробно описан в подразделе “Механизмы взаимодействия днРНК и микроРНК”.

Направляющие днРНК

днРНК также выполняют функцию группировки/локализации факторов транскрипции в определенных геномных локусах. Такие днРНК называют направляющими, (рис. 2, в). днРНК направляют модификаторы хроматина и белковые комплексы или факторы транскрипции к определенным генам-мишеням. Они способствуют локализации регуляторных молекул в определенных локусах для осуществления транскрипционной регуляции [56]. днРНК имеют цис-, транс-геометрическую изомерию. Цис-изомеры направляют изменения хроматина, выступая в качестве комплементарных мишеней для малых РНК (таких как микроРНК, малые интерферирующие РНК) [55]. Транс-изомеры направляют ДНК-мишень посредством РНК–ДНК взаимодействий [58].

днРНК-каркасы

днРНК-каркасы (скаффолды) играют важную роль при сборке макромолекулярных белковых комплексов и инициации различных биологических процессов [59], (рис. 2, г). Подобные днРНК способны соединять несколько белков в один рибонуклеиновый комплекс, который позволяет подавлять или активировать транскрипцию в зависимости от наличия и природы вовлеченных днРНК и белков [55].

днРНК-энхансеры

днРНК, транскрипция которых осуществляется с энхансерных локусов, называются днРНК-энхансеры (рис. 2, д). Как и все днРНК, их последовательности считываются в одном направлении, имеют поли(А)-хвост и сплайсируются [60]. Их следует отличать от энхансерных РНК (эРНК), которые являются продуктом двунаправленной транскрипции, не сплайсированы и не имеют поли(А)-хвоста. Энхансерные днРНК на сегодняшний день довольно плохо изучены. Однако, согласно гипотезе [61], синтез энхансерных днРНК может служить способом поддержания открытого состояния хроматина в области энхансеров для облегчения их взаимодействия с промоторами посредством образования петель. Некоторые исследования показывают вовлеченность энхансерных днРНК в процесс активации экспрессии генов мишеней [62, 63]. Также в нескольких работах показано понижение экспрессии генов мишеней при нокдауне ближайшей к ним энхансерной днРНК [63, 64].

Механизмы взаимодействия днРНК и микроРНК

Особое внимание стоит уделить взаимодействию днРНК и микроРНК. В работе [65] указывается на участие данных взаимодействий в регуляции устойчивости к болезням, холодовому, тепловому, биотическому и абиотическому стрессу у растений.

МикроРНК — это малые некодирующие РНК длиной 18–25 нуклеотидов, транскрибируемые из интронов, некодирующих участков гена или межгенных спейсеров (участков ДНК между генами) [66]. На сегодняшний день выделяют четыре типа взаимодействия днРНК и микроРНК [67], (рис. 3). Более подробно разберем данные механизмы взаимодействия.

 

Рис. 3. Механизмы взаимодействия днРНК – микроРНК: а – деградация днРНК при встраивании микроРНК; б – днРНК выступает в качестве мишени (губки) для микроРНК; в – днРНК конкурирует с микроРНК для регуляции уровня экспрессии мРНК; г – днРНК выступает предшественником микроРНК (сплайсируется в микроРНК).

 

Деградация днРНК при встраивании микроРНК

МикроРНК функционируют в комплексе с белками семейства аргонавтов (AGO). Комплекс микроРНК–AGO встраивается в РНК-индуцируемый комплекс подавления экспрессии гена, либо блокируя синтез белка с мРНК, либо приводя к деградации мРНК [68]. Подобный механизм функционирования наблюдается и для днРНК. МикроРНК за счет РНК-связывающих белков встраивается в комплементарный участок днРНК, вызывая деградацию данных молекул [69, 70]. В этом случае днРНК выступает как конкурент мРНК и тем самым адсорбирует часть молекул микроРНК, снижая их воздействие на молекулы потенциальных мишеней (мРНК). Важно, что при этом происходит деградация и самой днРНК (рис. 3, а).

днРНК-мишени для микроРНК

Впервые днРНК-мишени с эффектом мимикрии, или конкурирующие эндогенные днРНК (competitive endogenous RNAs, ceRNAs), были обнаружены в геномах растений [71], (рис. 3, б). Механизм мимикрии (“эффект губки”) заключается в блокировании взаимодействия микроРНК с мРНК-мишенью за счет связывания данной микроРНК с днРНК-приманкой через частично комплементарные последовательности [72].

На сегодняшний день экспериментально подтверждено влияние эндогенных днРНК на регуляцию синтеза фосфатов в Arabidopsis thaliana [72], Zea mays [73] и Medicago truncatula [74] за счет связывания с микроРНК.

Конкуренция днРНК и микроРНК

Механизмы взаимодействия микроРНК с эндогенными и конкурирующими днРНК схожи. днРНК выполняет роль мишени и снижает концентрацию микроРНК, (рис. 3, в). Однако днРНК может конкурировать и с микроРНК. Этот механизм функционирования днРНК возникает в случае, когда за счет комплементарных оснований они связываются с мРНК, не давая возможности в этих районах мРНК взаимодействовать с микроРНК. Подобный механизм позволяет предотвратить деградацию мРНК, с которой связываются днРНК [75–77].

днРНК-предшественники микроРНК

Некоторые днРНК как первичные транскрипты могут служить предшественниками специфических микроРНК, (рис. 3, г). Малые РНК могут производиться за счет механизма сплайсинга и приводить к усилению посттранскрипционной регуляции соответствующих мРНК-мишеней [35]. Такой механизм функционирования днРНК был экспериментально подтвержден у человека [78]. Показано, что они отвечают за регуляцию развития и прогрессирования опухоли за счет контроля транскрипции микроРНК-супрессоров [79, 80]. Для растений днРНК-предшественники обнаружены биоинформатическими методами. В работах [81, 82] большинство выявленных микроРНК выравниваются на концевые участки последовательности днРНК, указывая на то, что эти днРНК являются их предшественниками.

Экспрессия днРНК

На сегодняшний день появляется все больше работ по анализу днРНК у различных организмов, в которых применяются методы исследования экспрессии для данных молекул. Общепринятым считается, что днРНК демонстрируют более низкий уровень экспрессии по сравнению с мРНК, при этом экспрессируются более специфично для определенных тканей [34]. Однако в последнее время начинают появляться работы, демонстрирующие днРНК с уровнями экспрессии, равными таковым для генов, кодирующих белки [16, 83]. Подобные случаи являются единичными, и их результаты требуют экспериментального подтверждения.

Выделяют три направления исследования экспрессии днРНК: анализ экспрессии днРНК в тканях и в ответ на определенный раздражитель; анализ дифференциальной экспрессии и ко-экспрессии с генами, кодирующими белки; анализ тканеспецифичности днРНК. Данные подходы применяются как для масштабного транскриптомного анализа, так и для анализа небольших выборок последовательностей.

Анализ экспрессии днРНК в тканях является наиболее распространенным направлением исследования. Большинство работ начинают свое исследование с данного направления, постепенно углубляясь в дифференциальную или ко-экспрессию.

Анализ тканеспецифичности днРНК является наименее исследованным, так как нет точного понимания, какой метод определения специфичности экспрессии гена в тканях наиболее точный [84]. Во многих работах специфичным считается ген, имеющий экспрессию только в одной ткани [16, 85, 86]. Одним из первых подходов является подсчет количества тканей, в которых данный ген экспрессируется [87]. Однако данный метод позволяет исследовать только гены с высокой экспрессией, что затрудняет выбор порога фильтрации последовательностей. Также существует проблема близкородственных тканей, таких как части стебля или мозга человека.

С развитием понимания о структуре и функциях днРНК стало появляться все больше подходов к решению данной задачи. Существующие методы делятся на две группы. В первой группе показателем специфичности является число, определяющее, насколько специфично экспрессируется исследуемый ген: 1 – если ген имеет специфическую экспрессию, 0 – если экспрессируется в нескольких тканях – Tau [88], Gini [89], tissue specificity index (TSI) [90]. Во второй группе специфичность экспрессии гена рассчитывается отдельно для каждой ткани – z-score, SPM [91], expression enrichment (EE) [92], при этом уровень специфичности варьируется между разными метриками.

В основном все метрики расчета специфичности экспрессии гена (Tau, EE score, TSI, Gini coefficient) похожи: для расчета используется уровень экспрессии гена в определенной ткани и количество экспериментов, которым данная ткань принадлежит. Например, формула для расчета Tau:

$\tau =\frac{\sum _{i=1}^n(1-\widehat{x_i})}{n-1}$;(1)

$\widehat{x_i}=\frac{x_i}{{\displaystyle \underset{1\mathit{\le }i\mathit{\le }n}{\max }}\left(x_i\right)}$, (2)

где x_i – экспрессия гена в ткани; n – количество экспериментов с тканью.

Встречаются работы, использующие, помимо перечисленных выше, метрики, основанные на энтропии Шеннона, Jensen-Shannon (JS) [93]:

$H_g=\sum _{1\le t\le N}-p_{t\overline{)g}}{\log }_2\left(p_{t\overline{)g}}\right)$; (3)

$p_{\overline{)t}g}=\frac{{\omega }_{g,t}}{\sum _{1\le t\le N}{\omega }_{g,t}}$, (4)

где $p_{t\overline{)g}}$ – распределение экспрессии гена в ткани и ${\omega }_{g,t}$ – экспрессия гена. Таким образом, $p_{t\overline{)g}}$ показывает отношение экспрессии гена в определенной ткани на сумму экспрессий этого гена во всех тканях.

$Q_{\overline{)g}t}=Hg-{\log }_2\left(p_{\overline{)g}t}\right),$ (5)

где $Hg$ – энтропия, показывает, насколько ген тканеспецифичный. Если значение энтропии близко или равно 0, то данный ген специфичен для определенной ткани. $Q_{\overline{)g}t}$ показывает энтропию экспрессии исследуемого гена в одной ткани. Чем выше значение энтропии, тем выше специфичность экспрессии гена в определенной ткани.

Биологическая роль днРНК у растений

Предыдущие разделы показали разнообразие и важность молекулярных функций днРНК у растений. днРНК могут выступать как генетические и эпигенетические регуляторы экспрессии генов. В зависимости от геометрической изомерии они могут функционировать как цис-регуляторные элементы, взаимодействуя с близко расположенными генами и воздействуя непосредственно на гены в одной цепи, или транс-регуляторные элементы, действуя вдали от места синтеза. днРНК могут препятствовать связыванию транскрипционных факторов с промоторной областью, выступая в качестве репрессоров транскрипции. В результате этих молекулярных процессов контролируются функции растений на более высоком уровне организации: тканей, органов и всего организма. Примеры процессов, которые затрагивает регуляция при помощи днРНК у растений, приведены на рис. 4. К ним относятся: устойчивость растений к различным видам стресса, развитие органов растений, яровизация, развитие плода.

 

Рис. 4. Биологическая роль днРНК у растений. днРНК принимают участие в регуляции генов, отвечающих за устойчивость растений к различным видам стресса (синий прямоугольник), также влияют на плодородие растений (красный прямоугольник), участвуют в развитии листа, корня (зеленый, фиолетовый прямоугольник) и в процессах яровизации (оранжевый прямоугольник).

 

днРНК в процессе яровизации

Цветение является одним из важнейших адаптивных признаков, обеспечивающих переход репродуктивного роста и развития, происходящий в благоприятных условиях в течение жизненного цикла растения. Яровизация является важным механизмом, контролирующим цветение у некоторых видов растений, которые растут в вегетативном состоянии в холодные зимние сезоны и начинают цвести весной [94]. Также яровизация является наиболее изученным регуляторным процессом у растений, в котором участвуют днРНК. Они также принимают участие в регуляции гена FLOWERING LOCUS C (FLC), отвечающего за устойчивость A. thaliana к холодовому стрессу [3]. На сегодняшний день в локусе FLC обнаружено два класса днРНК: COOLAIR – днРНК транскрибируется в антисмысловом направлении по отношению к промотору гена FLC; COLDAIR – днРНК транскрибируется с первого интрона гена FLC в смысловом направлении. днРНК COOLAIR связываются с локусом FLC в цис-положении и образуют R-петлю между промотором и первым интроном гена FLC, что приводит к подавлению экспрессии данного гена мишени. Данный процесс проходит как на автономном, так и в яровизированном пути [94].

днРНК и влияние на урожайность растений

Развитие нормального пыльцевого зерна имеет решающее значение для оплодотворения и развития семян. Пыльник действует как родительская ткань пыльцевого зерна и регулирует его развитие. Аномальное пыльцевое зерно может привести к развитию растений с мужской стерильностью [95]. Экспериментальные исследования [96, 97] показали вовлеченность днРНК в процесс контроля урожайности. Например, днРНК (LDMAR) риса (Oryza sativa japonica) вызывает запрограммированную гибель клеток пыльников в условиях длинного дня (LD, long day) за счет сплайсинга в микроРНК osa-smR5864. Однонуклеотидная мутация микроРНК osa-smR5864 приводит к мужской стерильности растения [96]. Снижение экспрессии днРНК (BcMF11) в Brassica campestris препятствует деградации тапетума и приводит к прерыванию образования пыльцевых зерен [97]. Также методами биоинформатики в работе [33] для пяти стадий развития пыльника Brassica rapa было выявлено 14 днРНК, ко-экспрессирующихся с 10 известными генами, кодирующими белки, которые играют решающую роль в развитии пыльцы. Как утверждают авторы, выявленные днРНК представляют интерес для дальнейших экспериментальных исследований вовлеченности днРНК в репродуктивные процессы растений.

днРНК в процессе фотоморфогенеза

Молекулярный сигнальный механизм фотоморфогенеза широко изучался у различных видов растений. Во время этого явления ряд белков ассоциируются в качестве первичных и вторичных сигнальных молекул. Среди них выделяют семейство транскрипционных факторов со структурой ДНК-связывающего домена спираль–петля–спираль [helix–loop–helix (bHLH)]. Среди членов семейства выделяют факторы взаимодействия с фитохромом (PIF), которые выполняют функцию подавления фотоморфогенеза проростков в темное время суток [98]. В работе [77] обнаружена днРНК (HID1), которая функционирует как транс-регуляторный элемент, взаимодействуя с промотором гена PIF3 (ключевая сигнальная молекула фотоморфогенеза, которая негативно регулирует реакции на красный свет), и ингибирует его транскрипцию. В результате наблюдается удлинение зародышевого стебля (гипокотиля) у саженцев A. thaliana.

днРНК в процессах устойчивости к различным видам стресса

В природе растения подвергаются действию различных стрессовых факторов, таких как соль, засуха, холод, тепло, а также различные вирусные инфекции. Это приводит к проблемам в росте и плодородии у растений. Чтобы адаптироваться и выжить в таких неблагоприятных условиях, растения используют множество механизмов регуляции генов для восстановления клеточного гомеостаза. Современные исследования демонстрируют немаловажную роль днРНК в регуляции экспрессии генов в ответ на стрессовые состояния [99].

Вовлеченность днРНК в процессы устойчивости к абиотическим видам стресса демонстрируется у A. thaliana [81], B. rapa [100], винограда (Cabernet Sauvignon) [101], O. sativa [102] и многих других растений. Например, у днРНК A. thaliana выделяют следующие механизмы регуляции устойчивости к холодовому стрессу: модуляция / реконструкция хроматина, например днРНК COOLAIR, описанная выше; альтернативный сплайсинг днРНК TAS1 приводит к образованию варианта транскрипта с нерасщепленным интроном, более устойчивого к холодовому стрессу, чем сплайсированный вариант данной днРНК [103]; транскрипционная регуляция генов, например днРНК SVALKA подавляет транскрипцию гена CBF1 (ответственного за запуск каскада реакций, направленных на увеличение устойчивости растений к низким температурам) за счет транскрипционной коллизии [104].

днРНК lncRNA973 у A. thaliana регулирует устойчивость растений к солевому стрессу путем модуляции экспрессии генов, ответственных за реактивные формы кислорода (SOD, CAT и POD), транскрипционные факторы (MYB5, WRKY46, NAC29 и ERF62) и ионный баланс (NHX7) [105].

Сверхэкспрессия днРНК At5NC056820 у A. thaliana повышает устойчивость растения к засухе [106]. днРНК TCONS_00021861 у O. sativa за счет эффекта губки взаимодействует с miR528-3p и предотвращает ее взаимодействие с геном-мишенью YUCCA-7 (который участвует в биосинтезе триптофан-зависимых ауксинов и повышает устойчивость к засухе), что активирует синтез индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), повышающей устойчивость к засухе [107].

Подобный механизм наблюдается для днРНК TCONS_00048391, которая является “губкой” для микроРНК bra-miR164a, подавляющей экспрессию гена-мишени NAC1 (ответственного за устойчивость к тепловому стрессу у B. rapa) [100].

Таким образом, даже внутри одного организма днРНК имеют различные механизмы регуляции устойчивости к абиотическим видам стресса.

Эволюция днРНК

Эволюционные процессы приводят к изменчивости структуры и функций днРНК. В области изучения эволюции днРНК существует несколько направлений активных исследований. Прежде всего это вопросы, связанные с возникновением новых днРНК в геномах организмов. Одним из таких механизмов является дупликация генов. Появление в геноме дополнительной копии гена открывает свободу для эволюции одной из копий гена. Мутации, возникающие в одной из двух копий и ослабляющие исходную функцию гена, не будут отсеиваться отбором, потому что вторая копия может сохранить прежнюю функциональность. Таким образом, за счет дупликации возникают “псевдогены” (неактивные участки), изоформы и транскрипты днРНК [28].

Существует несколько гипотез возникновения днРНК за счет дупликации. Первая основывается на потере одной из изоформ гена, кодирующего белок (в процессе дупликации), способности кодировать белок. Это объясняется наличием у днРНК регуляторных элементов, сайтов сплайсинга, последовательностей экзонов и последовательностей, имеющих поли(А)-хвост. Наиболее известный пример днРНК, возникшей за счет дупликации гена, кодирующего белок, – человеческая днРНК Xist [29]. Вторая гипотеза основана на дупликации некодирующих РНК. Однако подобные случаи встречаются не так часто, как дупликация генов, кодирующих белки, вследствие высокой эволюционной лабильности днРНК [108].

Также одна из гипотез возникновения днРНК связана со встраиванием мобильных элементов (МЭ) в последовательность транскрипта. Мобильные элементы могут способствовать регуляции экспрессии генов при развитии и адаптации, а также служить основными источниками генетических вариаций в эволюции геномов. МЭ присутствуют в экзонах, сайтах начала транскрипции, сайтах полиаденилирования (поли(А)-хвосты) или в некоторых комбинациях этих частей. Исследование, проведенное на восьми растениях (включающих A. thaliana, кукурузу, томат, тополь) [109], показало, что 59.7% днРНК, найденных во всех восьми организмах, имеют по крайней мере один экзон с частично встроенным МЭ. В исследовании [43] показано участие МЭ не только в появлении днРНК, но и в регуляции и вариабельности днРНК.

Для оценки консервативности днРНК между геномами различных организмов сравнивают их последовательности [110]. Например, при выравнивании 67 тыс. днРНК риса на 39 тыс. днРНК кукурузы доля совпадающих позиций гомологов днРНК равна 20% [111]. При сравнении днРНК для эволюционно более далеких видов, например A. thaliana и O. sativa, уровень сходства значительно падает вплоть до отсутствия гомологии [109]. Только небольшое количество последовательностей днРНК демонстрирует уровень консервативности, сравнимый с консервативностью генов, кодирующих белки [112]. Одной из таких днРНК является IPS, участвующая в гомеостазе фосфора (Pᵢ) у A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum и S. moellendorffii. IPS содержит консервативный мотив из 24 нуклеотидов в перечисленных видах, который служит мишенью для miR399. IPS первоначально появилась у S. moellendorffii, представителя древних споровых высших растений. За время эволюционного развития функция IPS не изменилась, что может указывать на роль данной днРНК в адаптации к суше в процессе миграции из водной среды.

Однако большинство днРНК показывают высокую вариабельность первичной структуры, что подтверждается в работе [113], посвященной анализу консервативности днРНК между 25 цветковыми растениями. Анализ показал, что только 6.79% днРНК консервативны у всех исследуемых растений. В работе [114] был проведен анализ консервативности днРНК (межгенных) риса относительно семи видов растений. В результате была показана низкая консервативность днРНК в сравнении с мРНК, однако более высокая в сравнении с мРНК, содержащими МЭ. Анализ консервативности структурных элементов днРНК показал высокую консервативность экзонов днРНК в сравнении с интронами. В данных исследованиях показана быстрая эволюция днРНК, которая приводит к низкой консервативности последовательностей. Также отмечается, что процент консервативных днРНК выше среди родственных видов (в пределах одного рода), при этом консервативность резко убывает по мере увеличения эволюционного расстояния [113].

Несмотря на существующие теории возникновения и эволюции днРНК, к ним следует относиться с соответствующим скептицизмом вследствие отсутствия экспериментального подтверждения.

днРНК в пан-геномах и пан-транскриптомах

В природе существует высокое геномное и морфологическое разнообразие у видов, вызванное структурными вариациями. Они включают в себя инсерцию, дупликацию, инверсию, транслокацию, а также вариации копийности генов и их наличия или отсутствия. Данные вариации способны влиять на сегменты ДНК длиной в несколько мегабаз и в некоторых случаях изменять количество хромосом. Вследствие этого один референсный геном не способен охватить все содержимое гена одного вида. Например, в референсных геномах растений отсутствует ряд важных для сельскохозяйственных исследований генов. Для решения данной проблемы используется пан-геном.

Концепция пан-генома подразумевает охват последовательностей, подверженных структурной вариации и, возможно, отсутствующих в референсной последовательности каждого представителя вида. На сегодняшний день существует несколько формулировок термина “пан-геном”, которые представлены в работах [36–40].

В данном обзоре под пан-геномом понимается полный неизбыточный набор генов, представленных в геноме хотя бы одной особи, относящейся к данной таксономической единице [115]. Отметим, что это понятие можно распространить на таксономические единицы любого порядка [116]. Так, была проведена попытка создать общий пан-геном бактерий на основе 573 секвенированных ранее геномов бактерий [117]. Однако в настоящее время понятие пан-геном чаще всего употребляют именно в отношении вида.

Гены “пан-генома” могут быть разделены на две группы.

1. Консервативные гены – присутствуют в геномах всех представителей таксономической единицы.
2. Вариабельные гены – присутствуют в геномах не всех представителей вида. В свою очередь делятся на две категории: гены, представленные в двух и более геномах, и уникальные гены, представленные только в одном индивидуальном геноме.

При увеличении количества вариабельных генов, включенных в какой-либо конкретный пан-геном, общее количество генов в этом пан-геноме будет увеличиваться, в то время как количество консервативных генов будет постепенно уменьшаться. Причем каждая из этих выборок рано или поздно выйдет на плато, после которого она не будет значимо изменяться с добавлением новых геномов. При этом отмечается, что вариабельные гены в среднем эволюционно более молодые, чем консервативные [36]. Этот результат кажется логичным в свете того, что большую часть консервативных составляют гены домашнего хозяйства. Функции консервативных и вариабельных генов различны. Функции консервативных связаны с важнейшими клеточными процессами, а вариабельных – с окружающей средой и защитными реакциями, рецепторной и антиоксидантной активностью, регуляцией генов и передачей сигнала.

При помощи консервативных и вариабельных генов можно подразделять пан-геномы на две категории – открытые и закрытые. Закрытыми принято считать пан-геномы, которые быстро выходят на плато по количеству генов, т. е. секвенирование геномов новых представителей исследуемого вида не привносит новых генов. Открытые, наоборот, увеличиваются в размере каждый раз при добавлении новых геномов в их состав.

Еще одним из методов анализа генного состава у нескольких представителей какого-либо таксона является анализ его транскриптомов. Нуклеотидные последовательности транскриптов позволяют оценить присутствие генов в геноме только в том случае, если они экспрессируются в какой-либо ткани или органе растения. Таким образом, определение пан-транскриптома можно сформулировать так: пан-транскриптом отражает совокупность всех молекул РНК, присутствующих в данном виде или особи, и состоит из консервативных и вариабельных транскриптов (уникальных для одного вида или особи).

Помимо однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и множественных структурных вариаций немаловажную роль играют днРНК. Например, полное секвенирование транскриптома показало, что транскрибируется чрезвычайно большая часть генов высших эукариот. Однако более 90% всех транскриптов не транслируются в белки [4, 44, 78, 118] и являются некодирующими последовательностями. Как было описано выше, днРНК выполняют важную роль во многих молекулярных и биологических процессах у растений. Однако, несмотря на растущее число посвященных структурно-функциональному анализу днРНК исследований, данный тип молекул по-прежнему остается малоизученным. Это связано со множеством факторов, которые нужно учитывать при идентификации днРНК. Размер днРНК схож с размером некоторых генов, кодирующих белки, что приводит к ошибкам перепредсказания. Также исследования показывают, что последовательности днРНК претерпевают быструю эволюцию, закономерности которой пока непонятны. Как правило, в процессе эволюции эти последовательности очень быстро накапливают замены, так что даже с последовательностями из близкородственных видов организмов они имеют слабую гомологию [113]. Таким образом, применение пан-геномов и пан-транскриптомов повысит эффективность исследования и общее количество предсказанных днРНК по сравнению с использованием генома одного представителя вида. Также применение пан-генома позволит повысить точность и полноту исследуемого набора данных, так как пан-геном является совокупностью всех кодирующих и некодирующих последовательностей всех представителей вида. Более того, предсказанные для разных представителей одного вида днРНК могут быть выровнены на один пан-геном данного вида, это позволит произвести дальнейшее исследование вариабельных генов, поможет определить точное количество, тип и функции днРНК, внесенных каждым представителем исследуемого вида. Данный подход также позволит избежать необходимости выравнивать, сопоставлять и объединять результаты для геномов разных представителей одного вида, что существенно сократит время, трудозатраты и вычислительные ресурсы, необходимые для данного исследования. Например, исследование пан-транскриптома люцерны (Medicago sativa L.) [119] в тканях листьев, стебля и корней выявило 11677 новых днРНК. Данное исследование позволило выявить 2105 высоко экспрессирующихся и 1894 низко экспрессирующихся днРНК, а анализ генов онтологии показал вовлеченность данных днРНК в процессы регуляции устойчивости люцерны к засухе и солевому стрессу. В работе [120] при анализе пан-транскриптома кукурузы (Zea mays) было выявлено 644 новых днРНК. Однако на сегодняшний день работы, посвященные исследованию пан-геномов и пан-транскриптомов, в основном направлены на выявление и исследование новых генов, кодирующих белки. Тогда как работ, посвященных исследованию днРНК в масштабах пан-геномов и пан-транскриптомов, не так много, в особенности для растений.

Экспериментальные методы идентификации днРНК

До недавнего времени идентификация днРНК считалась побочным результатом исследований, направленных на выявление генов, кодирующих белки. Однако за последнее десятилетие стало очевидно, как важна роль днРНК в молекулярных и биологических процессах у различных организмов. Это привело к развитию экспериментальных технологий, специально направленных на идентификацию днРНК. На сегодняшний день для выявления и аннотации днРНК широко используют следующие экспериментальные методы [121]:

1) анализ РНК-секвенирования – выявление новых транскриптов днРНК;

2) микрочипы, разработанные для днРНК;

3) SAGE, CAGE – идентификация новых днРНК;

4) PARS, SHAPE – предсказание структуры днРНК.

Однако перед началом эксперимента необходимо подготовить днРНК. Для этого применяются различные методы очистки РНК, такие как денатурация путем нагревания, что можетнегативно повлиять на структуру днРНК [122]. Таким образом, разработаны новые методы, позволяющие избежать денатурации РНК. В большинстве этих подходов используются аффинные метки, которые участвуют в иммобилизации целевых РНК и рибозимов, что обеспечивает более высокую специфичность во время элюции [123]. Метод, предложенный [124], позволяет выявить днРНК с помощью ультрафильтрации и гель-фильтрации. Этот протокол очистки позволяет анализировать днРНК с сохраненными паттернами ко-транскрипционной укладки, а также поддерживает потенциально функциональные структурные элементы [124].

Анализ РНК-секвенирования (RNA-seq) является наиболее распространенным методом идентификации и аннотирования новых днРНК [121]. РНК-секвенирование (1) не требует предварительного знания изучаемых последовательностей, а значит, может быть использовано для изучения транскриптомов немодельных организмов, (2) дает более точные оценки уровня экспрессии и (3) требует меньшего количества РНК для проведения эксперимента [125]. Модификации анализа РНК-секвенирования, такие как цепь-специфичное РНК-секвенирование, позволяют разделять смысловые и антисмысловые классы днРНК [95].

Микрочипы были разработаны для анализа транскриптома, а также количественного и сравнительного анализа экспрессии мРНК между одним или двумя образцами различного происхождения. Стандартные платформы для микрочипов не содержат аннотации днРНК и не подходят для их выявления и анализа. Однако благодаря новым достижениям в технологии микрочипов теперь стало возможным создавать индивидуальные олигонуклеотидные микрочипы [126]. Микрочипы, разработанные для днРНК, используются для исследования профиля экспрессии днРНК в клетках и тканях [121]. Например, в работе [127] применяли микрочип с содержанием 3478 межгенных и интронных последовательностей в геномах человека, мыши и крысы для поиска днРНК. Исследователи обнаружили 55 новых днРНК с высокой экспрессией, из которых экспрессия восьми была подтверждена в тканях мышей при помощи Нозерн-блот-анализа.

Оба молекулярно-генетических метода – серийный анализ генной экспрессии (SAGE) и кэп-анализ экспрессии генов (CAGE) – основаны на получении и прочтении коротких (обычно длиной 27 нуклеотидов) участков последовательности РНК. Это позволяет одновременно количественно и качественно охарактеризовать экспрессию тысяч различных генов путем анализа их транскриптов [128]. В отличие от аналогичного метода серийного анализа экспрессии генов (SAGE, superSAGE), в котором фрагменты происходят из других частей транскриптов, CAGE в основном используется для определения точного местоположения сайтов начала транскрипции в геноме. Эти знания в свою очередь позволяют исследователю определять структуру промотора, необходимую для экспрессии гена [128]. Например, метод SAGE был применен в работе [96], посвященной изучению молекулярного патогенеза и биомаркеров предраковых поражений полости рта. В работе были идентифицированы 10 дифференциально экспрессирующихся днРНК, среди которых наибольшую экспрессию имеет днРНК NEAT1, принимающая участие в метастазировании рака.

Методы SHAPE и PARS [129, 130] позволяют получать данные о способе действия и взаимодействиях РНК с другими регуляторными молекулами [121]. В основе метода SHAPE (выборочное ацилирование 2’-гидроксильной группы, анализируемое методом удлинения праймера) лежит использование ангидрида N-метилизатоиновой кислоты (NMIA) и его производных для исследования гибких регионов во вторичной структуре РНК. Метод SHAPE был применен для исследования вторичной структуры таких днРНК, как COOLAIR [131] и Braveheart [132]. В методе PARS применяются сразу две нуклеазы: S1 и V1. Первая нуклеаза (S1) расщепляет одноцепочечную ДНК или РНК, вторая (V1) – двухцепочечную. Таким образом, при проведении двух экспериментов параллельно можно получить информацию сразу и о неспаренных, и о спаренных нуклеотидах [130].

Несмотря на перечисленное разнообразие экспериментальных методов идентификации днРНК, данный тип молекул по-прежнему остается малоизученным. В первую очередь это связано с наличием общих характеристик днРНК с белок-кодирующими генами, описанных в разделе “Молекулярные функции днРНК”. Поэтому применение только экспериментальных методов для идентификации днРНК является неэффективным подходом для их исследования. Для массового их изучения в масштабах всего генома лучше применять биоинформатические методы в комбинации с экспериментальными.

Биоинформатические методы идентификации днРНК

Биоинформатические подходы основываются на решении следующих задач: предобработка данных, предсказание днРНК и структурно-функциональная аннотация [16, 24, 133]. Однако на сегодняшний день за счет применения технологий секвенирования нового поколения стремительно увеличивается количество экспериментов по тотальному секвенированию РНК (RNA-seq). Чтобы повысить эффективность анализа транскриптомов для большого количества обрабатываемых данных, активно разрабатываются вычислительные конвейеры, которые позволяют выполнять стандартизованные этапы обработки данных в режиме, не требующем контроля пользователем вплоть до получения конечного результата. Главными достоинствами существующих конвейеров являются возможность сборки транскриптома для исследуемого организма и анализ дифференциальной экспрессии днРНК. Более подробное сравнение функционала биоинформатических конвейеров представлено в таблице П1.

Биоинформатические конвейеры позволяют автоматизировать и ускорить этапы анализа днРНК, перечисленные выше. Таким образом, предобработка данных включает контроль качества прочтений с помощью стандартных программ и выравнивание на геном.

Предсказания днРНК осуществляются программами CPC2 [134], CPAT [135], PLEK [133]. Перечисленные программы основаны на использовании методов машинного обучения (метод опорных векторов) для определения кодирующего потенциала исследуемого транскрипта. Основными критериями, по которым происходит оценка кодирующего потенциала, являются признаки открытых рамок считывания (ОРС). Встречаются случаи сходства признаков ОРС днРНК с ОРС генов, кодирующих белки, однако покрытие или целостность ОРС обычно у днРНК хуже.

Аннотация днРНК включает анализ структурных особенностей (экзон-интронная структура, положение на хромосоме), экспрессии, ко-экспрессии, гомологичных последовательностей, консервативности. Анализ структурных особенностей днРНК в основном направлен на длину транскрипта, количество экзонов/интронов и расположение на хромосоме. Анализ консервативности днРНК в работах можно разделить на две группы: консервативность внутри одного организма и консервативность между разными организмами. Консервативными считаются днРНК с уровнем гомологии выше 50% с днРНК других организмов, неконсервативными – с отсутствием гомологии с другими организмами [134].

Однако несмотря на достоинства конвейеров, они имеют свои недостатки. Большинство конвейеров разработаны на основе транскриптомных данных модельных организмов (человека, мыши, мухи). Вследствие этого для исследования другого организма нужно или использовать уже имеющиеся модели, что может внести ошибки в предсказание днРНК, или дополнительно обучать модель предсказания для данного организма, а затем вносить эти данные в код конвейера, что может привести к неправильной работе программы.

Отметим, что, несмотря на общие черты, между структурой и функциями днРНК растений и животных существуют и отличия [31]. Например, в работе [136], посвященной анализу программ предсказания днРНК, было показано, что программы, разработанные для человека, плохо предсказывают днРНК растений и наоборот, что свидетельствует о различии структурных особенностей днРНК между человеком и растениями. Однако экспериментальных работ, направленных на сравнение структуры днРНК растений и животных, пока нет.

Поэтому для более точного выявления днРНК необходимы дополнительные фильтры последовательностей, не все конвейеры их предоставляют. На сегодняшний день современные биоинформатические конвейеры решают перечисленные выше недостатки. Так, ICAnnoLncRNA [137] и lncRNA-screen [138] позволяют обучать модель предсказания для любого исследуемого вида. Также ICAnnoLncRNA предоставляет несколько фильтров последовательностей (выравнивание на референсный геном, удаление мобильных элементов, фильтрация коротких изоформ и классификации), что позволяет получить наиболее точное количество выявленных днРНК.

При биоинформатическом анализе днРНК производится сравнение вновь секвенированных транскриптов с уже известными последовательностями днРНК. Источником информации об этих последовательностях служат базы данных. Для их пополнения используются различные источники: результаты биоинформатической обработки транскриптомных экспериментов и предсказания днРНК, экспериментальные результаты, полученные при анализе литературных источников, совместное использование как биоинформатических методов, так и литературных источников. Базы данных, которые описывают структуру и функции днРНК растений, приведены в таблице П2.

Заключение

На сегодняшний день различные исследования демонстрируют важность и незаменимость днРНК во многих клеточных процессах, таких как активация и подавление экспрессии генов, импринтинг и деметилирование ДНК, РНК-интерференция, ремоделирование хроматина и др. [139]. У растений днРНК участвуют в регуляции устойчивости к различным видам стресса [1–3], оказывают влияние на устойчивость к гипоксии [32], принимают участие в развитии плодов, корня и листьев. Таким образом, все больше повышается интерес к выявлению днРНК в различных видах. Для этого используют методы широкомасштабного распознавания последовательностей в геномах и транскриптомах. Особый интерес представляет выявление днРНК в пан-транскриптомах и пан-геномах. Во многих работах [119, 120, 140], посвященных исследованию пан-геномов, отмечается более полная и точная информация о выявленных последовательностях генов. Однако, несмотря на растущее количество исследований, посвященных днРНК, их выявление по-прежнему остается проблематичной задачей. Для решения данных задач разрабатывают различные экспериментальные и биоинформатические подходы.

Работа выполнена при поддержке бюджетного проекта FWNR-2022-0020.

Авторы не имеют финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта людей и животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

А. Y. Pronozin

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: pronozinartem95@gmail.com

Kurchatov Genomic Center

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

D. A. Afonnikov

Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; Novosibirsk National Research State University

Email: pronozinartem95@gmail.com

Kurchatov Genomic Center

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk; Novosibirsk

References

Supplementary files