Tetracycline Induction of Natural Drug Resistance to Bedaquiline in Mycobacterium smegmatis mc2 155

Full Text

Антибиотикорезистентность представляет собой глобальную проблему ВОЗ, связанную с передачей бактерий и генов антибиотикорезистентности между людьми, животными и окружающей средой, а также с накоплением антибиотиков в окружающей среде [1]. В последнее время появляется все больше данных о возможности индукции природной лекарственной устойчивости концентрациями антибиотиков значительно ниже известных МИК – минимальные селективные концентрации (МСК) [2–4]. Показано, что концентрации в несколько сот раз ниже значений МИК соответствующих антимикробных препаратов для бактерий могут вызывать изменения в фенотипе резистентности и индуцировать лекарственную устойчивость [5–7]. При этом появляются данные о накоплении в окружающей среде концентраций значительно выше МСК [8].

В предыдущей работе нами было показано, что низкие концентрации тетрациклина, канамицина и офлоксацина, не влияющие на рост микобактериальных клеток, могут активировать систему природного резистома, приводя к повышению устойчивости M. Smegmatis mc2 155 и увеличению экспрессии гена whiB – основного транскрипционного регулятора, вовлеченного в процесс формирования устойчивости M. Smegmatis mc2 155 и увеличению экспрессии гена whiB – основного транскрипционного регулятора, вовлеченного в процесс формирования устойчивости [9–11]. Также ранее нами была разработана тест-система для оценки выброса из клетки разрабатываемых новых антибиотиков клеточной помпой MmpS5-MmpL5 [12, 13]. Согласно литературным данным, данная система ответственна за выброс целого ряда антибиотиков из клетки, в частности, широко применяемого противотуберкулезного препарата второго ряда – бедаквилина, а ее активация приводит к повышению устойчивости у микобактерий к целому ряду антибиотиков [14].

Настоящая работа посвящена анализу индукции системы природной лекарственной устойчивости тетрациклином, офлоксацином и канамицином в концентрациях, не влияющих на рост клетки, на повышение уровня устойчивости к бедаквилину за счет активации клеточной помпы MmpS5-MmpL5.

 

Рис. 1. Диаметры зон ингибирования роста культуры M. smegmatis mc2 155 бедаквилином (0,01 нмоль/диск) при индукции офлоксацином, канамицином и тетрациклином. Зеленый столбец – контрольный образец без индукции. Столбцы представляют средние значения в мм. Стандартное отклонение рассчитано из трех независимых биологических повторов.

 

В работе использовался штамм бактерий M. smegmatis mc2 155. Культивирование бактерий проводили на агаризованной среде M290 (M290, Himedia, India) и в жидкой среде Middlebrook 7H9. Определение антибактериальной устойчивости M. smegmatis проводили с использованием бумажных дисков, как описано в [15], с модификациями: культуры M. smegmatis выращивались на протяжении ночи в среде Middlebrook 7H9 до начала экспоненциальной фазы (OD600 = 1.2), после чего разбавлялись в пропорции 1 : 9 : 10 (культура : вода : M290) и в количестве 5 мл наслаивались как верхний слой на чашки Петри со средой M290. При индукции устойчивости антибиотики тетрациклин (0,015 мкг/мл), офлоксацин (0,08 мкг/мл) и канамицин (0,03 мкг/мл), не влияющие на рост [9], добавлялись в жидкую среду и выращивались до той же фазы роста, что и контроль без индукции. После этого на агар наносили диски из фильтровальной бумаги с антимикобактериальными препаратами. Эксперимент проводился в трех независимых биологических повторностях.

Выделение РНК и измерение уровня экспрессии гена MSMEG_1380 и MSMEG_1382 с использованием РТ-ПЦР проводили по описанной ранее методологии без модификаций [9]. Метод оценки экспрессии (ΔΔCt), p-value ≤ 0.001. Используемая последовательность праймеров:

Для оценки скорости роста культуру M. Smegmatis разводили в среде Middlebrook 7H9 до OD600 = 0.1 (исследовался планктонный рост). Измерение оптической плотности клеточной суспензии проводили на приборе SmartSpec Plus (Bio-Rad) в течение 25,5 ч каждые 1.5 часа. При индукции в среду добавлялся тетрациклин в концентрации 0,015 мкг/мл. Бедаквилин добавлялся в концентрации 0,5 нМ (1/20 от МИК) и 1 нМ (1/10 от МИК). Эксперимент проведен в трех независимых повторах.

Ранее нами было показано, что индукция малыми концентрациями антибиотиков (тетрациклином, офлоксацином, стрептомицином и канамицином) может приводить к активации генов природного резистома и повышать уровень устойчивости к различным антибиотикам через активацию глобальных транскрипционных регуляторов [9]. Одними из наиболее распространенных в микобактериальной клетке являются TetR-зависимые транскрипционные регуляторы, которые могут регулировать широкий ряд генов, ответственных за формирование лекарственной устойчивости [16]. Одним из таких генов является клеточная мультисубстратная помпа mmpS5-mmpL5 [17], которая, как нами было показано ранее, напрямую регулируется транскрипционным регулятором MSMEG_1380 [12]. Сама же клеточная помпа MmpS5-MmpL5 (по литературным данным) вовлечена в процесс выброса широко применяемых в медицинской практике антибиотиков – клофазимина и бедаквилина [18, 19]. При этом стоит отметить, что в соответствии с нормами Агентства министерства здравоохранения США (FDA, USA) суточная доза для широко применяемого в сельском хозяйстве при производстве продуктов питания тетрациклина составляет 25 г/кг массы тела в сутки (FDA: Sec.556.720) [20]. На основании данного предположения нами была выдвинута гипотеза, что минимальные концентрации тетрациклина, которые не влияют на рост клетки, могут приводить к активации TetR-зависимых транскрипционных регуляторов и увеличению активности клеточной помпы MmpS5-MmpL5.

Для проверки данного предположения мы провели индукцию устойчивости штамма M. smegmatis mc2 155 тетрациклином, офлоксацином и канамицином в концентрациях, не влияющих на рост клеток. Было показано, что индукция офлоксацином и канамицином не приводит к изменению уровня устойчивости клеток к бедаквилину, тогда как индукция тетрациклином делает клетки более устойчивыми к бедаквилину (рис. 1). На основании полученных данных об индукции тетрациклином устойчивости к бедаквилину нами был проведен анализ изменения уровня экспрессии TetR-зависимого транскрипционного репрессора MSMEG_1380 и регулируемой им помпы MmpS5-MmpL5 (ген MSMEG_1382) при индукции клеток тетрациклином. Было показано, что концентрации, не влияющие на рост клеток, вызывают 4.78-кратное снижение экспрессии MSMEG_1380, что в свою очередь вызывает повышение уровня экспрессии гена MSMEG_1382 в 3.36 раза (рис. 2).

 

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии генов MSMEG_1380 и MSMEG_1382 в клетках M. smegmatis mc2 155, культивируемых в присутствии тетрациклина в концентрации, не влияющей на рост клеток. Экспрессия изучаемых генов при отсутствии антибиотиков принята за единицу; стандартное отклонение рассчитано из трех независимых биологических повторов.

 

На основании полученных данных далее провели анализ скорости роста M. smegmatis в среде с бедаквилином при индукции тетрациклином. Нами было проведено сравнение скорости роста штамма M. smegmatis mc2 155 в трех различных условиях: контроль (w.t.), штамм в присутствии индуктора (тетрациклина) и бедаквилина и штамм в присутствии бедаквилина без индукции. Концентрации бедаквилина составляли 1/20 МИК, 0.5 нМ и 1/10 от МИК, 1 нМ соответственно. Использование большей концентрации приводило к существенному замедлению роста штамма и невозможности оценки результатов (рис. 3).

 

Рис. 3. Кривая роста штамма M. smegmatis mc2 155 (w.t., желтый) в присутствии бедаквилина (Bd, зеленый), а также в присутствии бедаквилина и индуктора тетрациклина (Bd+tet, синий). Предел погрешности – стандартное отклонение. Опыт проводился в трех независимых повторах.

 

В результате проведенного исследования мы выявили, что штамм без обработки антибиотиками имеет более высокую скорость роста в отличие от штамма в присутствии бедаквилина в концентрациях 1/20 и 1/10 от МИК. При этом скорость роста штамма при добавлении в среду микроконцентрации тетрациклина увеличивалась. Данные результаты подтверждают предположение о влиянии минимальных селективных концентраций антибиотиков на скорость роста штаммов, что может приводить к отбору штаммов с индуцированными генами резистома [5].

В настоящей работе показано увеличение устойчивости культуры микобактерий M. smegmatis mc2 155 к бедаквилину при индукции тетрациклином. Оценка возможного механизма индукции выявила снижение экспрессии TetR-зависимого транскрипционного репрессора MSMEG_1380 и увеличение экспрессии регулируемой им помпы MmpS5-MmpL5 (ген MSMEG_1382), что может приводить к выбросу бедаквилина из клетки. Полученные далее результаты подтверждают разницу в скорости роста у M. smegmatis mc2 155 при индукции устойчивости природного резистома низкими концентрациями тетрациклина в присутствии бедаквилина, что подтверждает предположение о возможности отбора штаммов с индуцированной устойчивостью из-за разницы в скорости роста.

 

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

A. A. Vatlin

Peoples’ Friendship University of Russia; Vavilov Institute of General Genetics Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: vatlin_alexey123@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 117198; Moscow, 119991

D. A. Tsybizov

Peoples’ Friendship University of Russia

Email: vatlin_alexey123@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 117198

V. S. Letvinova

Vavilov Institute of General Genetics Russian Academy of Sciences

Email: vatlin_alexey123@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. N. Danilenko

Vavilov Institute of General Genetics Russian Academy of Sciences

Email: vatlin_alexey123@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files