Polymorphisms in the transit peptide of phytoene synthase ZmPSY1 link to the white color of grain endosperm in maize inbred lines

Full Text

Вариабельность растительного генома – это не только инструмент эволюционной адаптации и возникновения новых видов, но и значимый фактор влияния при селекции сельскохозяйственных растений. Среди наиболее важных признаков, по которым ведется селекция культурных растений, находятся характеристики, ассоциированные со стрессоустойчивостью, урожайностью и качеством продукции. Часто признаки разной направленности взаимосвязаны. Особенно это касается содержания различных метаболитов, определяющих вкусовые, питательные и/или диетические свойства продукта и одновременно являющихся средствами защиты растения от стрессовых факторов.

Все известные хозяйственно-ценные признаки определяются генетически, и их экспрессивность связана с вариабельностью конкретных геномных локусов и/или генов. Определение аллельных вариантов генов и доноров этих аллелей способствует значительному ускорению процесса селекции улучшенных сортов агрокультур.

В качестве примера можно привести работы по поиску генов/локусов, сцепленных с хозяйственно-ценными признаками, с дальнейшей разработкой молекулярных маркеров на значимые аллельные варианты у важнейшей злаковой культуры – кукурузы Zea mays L. [1, 2]. Эта культура имеет самый высокий генетический потенциал урожайности среди зерновых и выращивается в различных агроэкологических регионах мира как на зерно, так и на силос. Зерно кукурузы является источником крахмала (65–70%), белка (16.5%), масел (3–5%), клетчатки (3%), растворимых сахаров (до 2%), а также каротиноидов (провитамина А и других каротиноидов) [1, 2]. Кукуруза – теплолюбивое растение преимущественно короткого дня и подвержена негативному влиянию различных стрессовых факторов [3–5]. Соответственно ведется поиск геномных локусов, мутаций и аллелей, которые сцеплены с качественными характеристиками зерна (включая содержание каротиноидов (в том числе провитамина А), зеинов, масел, амилопектинового крахмала и др.) и устойчивостью к патогенам и абиотическим стрессовым факторам.

На основе получаемых данных разрабатываются и используются в селекции молекулярные маркеры, ассоциированные с целевыми признаками у кукурузы. Так, выявлены аллельные варианты генов метаболизма крахмала waxy, amylose extender1 и sugary1, которые приводят к значительному увеличению содержания амилозы в составе крахмала [6]. Охарактеризован плейотропный эффект мутантного аллеля opaque2 (o2), присутствие которого увеличивает содержание незаменимых аминокислот лизина и триптофана в белковой фракции эндосперма зерна, однако снижает урожайность и повышает восприимчивость к болезням [1, 2]. В рамках работ по стрессоустойчивости разработаны маркеры признаков резистентности к фузариозной гнили початков (Fusarium verticillioides) и стеблей (F. graminearum) [3, 4]. Определена дифференциальная экспрессия генов транскрипционных факторов семейства DREB2 у растения кукурузы в ответ на воздействие различных абиотических факторов [5].

Другое современное направление в селекции кукурузы – увеличение содержания в эндосперме зерна каротиноидов, в том числе провитамина А (α-каротин, β-каротин и β-криптоксантин), количество которого у большинства желтозерных сортов/линий кукурузы в 10 раз меньше по сравнению с целевым уровнем (в рамках существующей программы биофортификации) [1, 2]. Выявлены аллельные варианты генов ликопин-ε-циклазы (LCYE) и β-каротингидроксилазы 1 (crtRB1), влияющие на концентрацию β-каротина. Маркеры, сцепленные с такими аллелями, способствуют выявлению доноров среди образцов кукурузы и ускорению селекции на повышенное содержание провитамина А в зерне. Более того, известны успешные попытки пирамидирования – объединения при отборе признаков увеличения количества провитамина А и незаменимых аминокислот лизина и триптофана в зерне [1, 2].

От присутствия и состава каротиноидов зависит окраска зерна. Обогащение эндосперма зерна зеаксантином или лютеином приводит соответственно к оранжевой или желтой окраске, в то время как отсутствие каротиноидов или только цветных каротиноидов – к белой окраске [7–9]. Хотя из-за дефицита каротиноидов в зерне пищевая ценность сортов белозерной кукурузы считается ниже, чем желтозерной, по другим качествам различий практически не выявлено. При этом именно мука и крупа белозерных сортов являются необходимым компонентом некоторых продуктов (чипсы, лепешки) и основой многих национальных блюд, особенно американской, мексиканской и кавказской кухни.

В связи с этим наметилась тенденция к увеличению сортимента и селекции сортов с различным содержанием каротиноидов (и соответственно различной окраской зерна). Для этого проводится анализ вариабельности генов каротиногенеза. Синтез каротиноидов начинается с активации гена фитоинсинтазы PSY и образования предшественника всех каротиноидов – 15-цис-фитоина [10]. Показано, что белая окраска зерна связана с различными мутациями в последовательности геномного локуса, содержащего ген ZmPSY1, которые приводят к дефициту каротиноидов в эндосперме, но не в зародыше [7, 11, 12]. К примеру, рецессивный мутантный аллель гена ZmPSY1 – yellow endosperm 1 (y1) оказывает упомянутый эффект на зерно, будучи и в гетерозиготном состоянии: эндосперм накапливает каротиноиды, но в незначительном количестве в сравнении с желтым и оранжевым зерном [9, 12, 13].

В настоящей работе были идентифицированы последовательности гомологов гена ZmPSY1 у четырех инбредных линий кукурузы отечественной селекции, контрастных по окраске зерна (белая и желтая). Проведенное структурное сравнение выявило полиморфный участок в экзоне I, различающий белозерные и желтозерные образцы. Соответствие аллельных вариантов окраске зерна было протестировано на 44 инбредных линиях кукурузы, включающих белозерные и желтозерные образцы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для работы использовали образцы 44 инбредных линий кукурузы отечественной селекции (ООО ИПА “Отбор”, Институт сельского хозяйства (ИСХ) КБНЦ РАН (КБР), ВИР (С.-Петербург)), 22 из которых белозерные и 22 – желтозерные (табл. 1). Зерна урожая 2020 г. (все 44 образца) проращивали в увлажненной почве и растили до стадии 3–4 листа в условиях экспериментальной установки искусственного климата (ЭУИК, ФИЦ Биотехнологии РАН; день/ночь – 16 ч/8 ч, 22 °С/16 °С; освещенность 190 мкМ/(м²с)).

 

Таблица 1. Инбредные линии кукурузы, использованные в работе

№	Линия	Окраска эндосперма зерна	Аллель ZmPSY1 дикого типа	Аллель ZmPSY1 мутантного типа
1	МБК*	Белая		+
2	КБЗ*	Белая		+
3	5740*	Белая с красными полосками	+
4	5254-1***	Белая		+
5	6614-1***	Белая	+
6	6063-1***	Белая		+
7	6758-1***	Белая	+
8	6349-1***	Белая	+
9	5320-3***	Белая		+
10	6038-1***	Белая	+
11	5138-1***	Белая	+
12	5254-3***	Белая		+
13	5320-2***	Белая		+
14	6097-1***	Белая		+
15	5320-4***	Белая		+
16	К-5933**	Белая	+
17	К-6734**	Белая	+
18	К-6705**	Белая	+
19	К-6696**	Белая	+
20	К-6709**	Белая	+
21	К-5935**	Белая	+
22	К-5914**	Белая	+
23	5676*	Светло-желтая	+
24	1616*	Светло-желтая	+
25	5675*	Светло-желтая	+
26	5666*	Матовая светло-желтая	+
27	5739*	Матово-желтая	+
28	5692*	Матово-желтая	+
29	5696*	Желтая	+
№	Линия	Окраска эндосперма зерна	Аллель ZmPSY1 дикого типа	Аллель ZmPSY1 мутантного типа
30	5683*	Желтая	+
31	5684*	Желтая	+
32	5694*	Желтая	+
33	5674*	Желтая	+
34	5580-1***	Желтая	+
35	2452-2***	Желтая с красным кончиком	+
36	1543*	Насыщенно-желтая	+
37	5690*	Насыщенно-желтая	+
38	6339-1***	Ярко-желтая	+
39	5671*	Темно-желтая	+
40	5677*	Оранжевая	+
41	5681*	Оранжевая	+
42	5272-6***	Оранжевая	+
43	2138***	Оранжевая	+
44	5687*	Оранжевая	+

Примечание. Окраска зерна определялась оригинаторами инбредных линий: *ООО ИПА «Отбор»; **ВИР им. Н.И. Вавилова; ***ИСХ КБНЦ РАН.

 

Из 50–100 мг листовой ткани проростков, предварительно растертой в жидком азоте, выделяли суммарную РНК (RNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Германия) с последующей очисткой от примесей геномной ДНК (RNase free DNasy set, QIAGEN, Германия). Полученные препараты РНК использовали для синтеза кДНК (GoScript^тм Reverse Transcription System, Promega, США). Качество РНК проверяли методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Концентрацию РНК и кДНК определяли на флуориметре Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) с помощью соответствующих реактивов (Qubit RNA HS Assay Kit и Qubit DS DNA HS Assay Kit, Invitrogen, США).

Кодирующие последовательности гена ZmPSY1 амплифицировали с помощью ПЦР на препаратах кДНК двух белозерных и двух желтозерных образцов. Специфичные праймеры (forward 5´-tgttctgctgactggtctca-3´; reverse 5´-aacaacaattcaccaggttgtc-3´) подбирали на основе данных Генбанков NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и MaizeGDB (https://maizegdb.org/). ПЦР проводили в следующих условиях: предварительная денатурация (95°С – 5 мин), амплификация в течение 35 циклов (95°С – 60 с, 60°С – 60 с, 72°С – 90 с), финальная достройка фрагментов (72°С – 5 мин). Ампликоны (ожидаемый размер 1419 пн) секвенировали с использованием тех же праймеров на ABI Prism 3730 DNA Analyzer (ЦКП Биоинженерия, ФИЦ Биотехнологии РАН).

Для ПЦР-амплификации полиморфного участка последовательности кДНК ZmPSY1 с разработанными праймерами использовали следующую программу: предварительная денатурация (15 мин при 95°C), 35 циклов (99°C – 45 с, 62°C – 45 с, 72°C – 45 с) и финальная достройка фрагментов (72°C – 2 мин).

Сравнительное выравнивание последовательностей проводили в программе MEGA 7.0.26 (https://www.megasoftware.net/). Транзитный и сигнальный пептиды, консервативные домены и мотивы в белках определяли с помощью SignalP-5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/), NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/), UniProt (https://www.uniprot.org/), а также литературных данных. Влияние замещений аминокислот на структуру белка предсказывали, используя PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php; default threshold – –2.5).

Суммарное количество каротиноидов (мкг/г сырого веса) определяли спектрофотометрически в хлороформ-метанольных экстрактах, полученных из ~0.5 г предварительно измельченной в жидком азоте ткани эндосперма зерна белозерного и желтозерного образцов, согласно [14]. Спектры поглощения регистрировали с помощью Eppendorf BioSpectrometer® basic (Eppendorf, Германия).

Часть оборудования для данного исследования была обеспечена Программой развития МГУ им. М. В. Ломоносова (ПРМ-10) (комплект оборудования для геномных исследований).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выявления возможных SNP в последовательности гена ZmPSY1, связанных с биосинтезом каротиноидов в эндосперме зерна, в работе были использованы инбредные линии кукурузы с белой и желтой/оранжевой окрасками зерна (табл. 1).

Поскольку желтый и оранжевый эндосперм накапливает в 5–100 раз больше каротиноидов, чем белый [8, 9], мы предварительно сравнили содержание каротиноидов в эндосперме желтого (образец 2452-2) и белого (6097-1) зерна. В результате было подтверждено почти полное отсутствие каротиноидов у белозерного образца и в то же время их присутствие в количестве 34.6 ± 2.4 мкг/г сырого веса у желтозерного образца.

Идентификация и структурный анализ кодирующей последовательности гена ZmPSY1 у белозерных и желтозерных инбредных линий кукурузы

С использованием доступных геномных данных кукурузы Z. mays spp. mays var. B73 была извлечена последовательность гена фитоинсинтазы ZmPSY1 (другие названия y1, pb1; идентификаторы – LOC100136882, GRMZM2G300348, Zm00001eb271860). Ген локализован на хромосоме 6 в позиции 91643180..91646525 (по текущей версии сборки генома Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0; NCBI) или 82179486..82185345/85060410..85065755 (предыдущие версии сборки; MaizeGDB). На основе последовательности мРНК гена были подобраны праймеры для амплификации и секвенирования полной кДНК.

Кодирующая последовательность ZmPSY1 была определена у двух желтозерных (2452-2, 5580-1) и двух белозерных (5254-3, 6097-1) инбредных линий кукурузы. Было показано, что кДНК гена у всех четырех образцов одинакова по длине (1233 пн). Последовательности кодируемых белков-гомологов (410 ао) содержат N-концевой транзитный пептид (в положении 1–62 ао, с сайтом отщепления V61/Y62, согласно UniProt), ответственный за пластидную локализацию фитоинсинтазы, а также консервативный домен head-to-head (HH)-IPPS (в положении 69–402 или 63–410 ао, согласно NCBI-CDD или UniProt). Присутствие сигнального пептида, определяющего транслокацию белка в пластиды и отщепляемого после прохождения мембраны органелл, было маловероятно (согласно SignalPeptide). Однако по версии [15] сигнальный пептид соответствует участку 1–19 ао на N-конце фермента и инвариантен между образцами (рис. 1).

 

Рис. 1. Выравнивание участка кДНК ZmPSY1 (а) и аминокислотной последовательности гомологов ZmPSY1 (б) у двух желтозерных (2452-2, 5580-1) и двух белозерных (5254-3, 6097-1) инбредных линий кукурузы в сравнении с референсом Z. mays var. B73 (LOC100136882; MN128624.1). Стрелкой указан участок нуклеотидной последовательности, выбранный для прямого праймера (на анализ аллельного варианта гена ZmPSY1). В аминокислотной последовательности выделен рамкой полиморфный участок транзитного пептида, содержащий замещения ао L47I, W52S, E53D и A54V, подчеркнуты консенсусы SQS и PSY (сплошными линиями) и участки YAKTF и RAYV, ограничивающие каталитически активный сайт (двойными линиями), а также указаны радикальные замещения ао (стрелками).

 

В последовательности гомологов ZmPSY1 были также идентифицированы два высоко консервативных консенсуса – скваленсинтазный (SQS) и фитоинсинтазный (PSY) (по [15]), подтверждающих функциональную принадлежность анализируемых белков. У четырех тестируемых образцов кукурузы консенсус SQS (CYYVAGTVGLMSVPVM, положение 238–253 ао) содержал одно замещение ао – G243A (у желтозерного образца 2452-2), а PSY (GIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQ, положение 274–299 ао) имел один полиморфизм – G274R (у белозерного образца 6097-1). Участки YAKTF (129–133 ао) и RAYV (379–382 ао), ограничивающие каталитически активный сайт, у гомологов были идентичны (рис. 1, б).

Выравнивание идентифицированных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей в сравнении с кДНК ZmPSY1 и соответствующим белком Z. mays var. B73 выявило высокий уровень консерватизма. Всего было обнаружено 19 SNPs, восемь из которых были специфичны для обоих белозерных образцов (g114→a, c139→a, g155→c, c161→t, t162→c, t168→c, с183→a, a798→g) (рис. 1, а). Оставшиеся SNPs были характерны для индивидуальных образцов: 6097-1 (с529→a, t753→a, a769→t, g819→a, g852→t), 2452-2 (g728→c), 5254-3 (a769→c, t811→c, g820→a, g852→c) и 2452-2/5580-1 (c1031→a).

В результате несинонимичных SNPs в последовательности кодируемых гомологов ZmPSY1 произошло замещение остатков восьми аминокислот (рис. 1, б). Четыре нейтральных (согласно PROVEAN) замещения L47I, W52S, E53D и A54V присутствовали только у анализируемых белозерных образцов кукурузы. Другие замещения были специфичны для одной желтозерной линии 2452-2 (G243A; радикальное), белозерного образца 5254-3 (нейтральное T257P и радикальное G274R) и двух желтозерных линий 2452-2 и 5580-1 (T344N; нейтральное). Радикальное замещение G243A в середине консенсуса SQS (рис. 1, б), судя по сохранению желтой окраски зерна, не повлияло на синтез каротиноидов.

Несмотря на нейтральный статус замещения треонина на пролин T257P у белозерного образца 5254-3 (рис. 1, б), данный полиморфизм (или его вариант T257S) ранее охарактеризован как сцепленный с внутриклеточной локализацией ZmPSY1 у 70% тестируемых белозерных линий [16]. Присутствие Pro-257 в сочетании с Asn-168 меняет не только локализацию ZmPSY1, но и морфологию 30% пластид [16]. Аллель Y1, который связывают с желтой окраской эндосперма, в 99% кодирует белок с Thr-257 в сочетании с Asn-168 [7, 15]. Можно предположить, что присутствие Pro-257/Asn-168 в последовательности ZmPSY1 в нашем исследовании может быть связано с белой окраской эндосперма у образца 5254-3. Интересно, что данный образец содержал и специфичное ему радикальное замещение G274R, которое соответствовало первому остатку консенсуса PSY (рис. 1, б). Ранее данный полиморфизм описан не был, но также может быть связан с белой окраской зерна у линии 5254-3.

Заметим, что в работе [16] авторами также обнаружены различия в последовательности транзитного пептида в положениях с 52 по 55. Однако данные в статье не приведены, поскольку транзитный пептид процессируется после импорта в хлоропласты и не должен влиять на активность фермента [16]. По всей вероятности, речь шла о замещениях W52S, E53D и A54V, которые были обнаружены нами в гомологах ZmPSY1 обоих анализируемых белозерных образцов (рис. 1, б).

Мы предположили, что замещения L47I, W52S, E53D и A54V могут быть сцеплены с белой окраской эндосперма зерна, хотя их нейтральный статус не предполагает каких-либо существенных нарушений фолдинга белка. Однако локализация замещений в С-концевой части транзитного пептида могла повлиять на корректность пластидной локализации фермента, а именно на его связывание с белками, узнающими транзитный пептид и участвующими в переносе фитоинсинтазы в пластиды.

При каротиногенезе происходит транслокация фитоинсинтазы в пластоглобулы пластид с помощью транзитного пептида, что показано на примере анализа работы транзитного пептида изофермента PSY2 в хлоропластах риса (Oryza sativa L.) [17]. В запасающих органах происходит преобразование хлоропластов в хромопласты и значительное увеличение количества белка PSY1 в пластоглобулах, что показано на примере плодов томата (Solanum lycopersicum L.) [18]. Поэтому отсутствие ZmPSY1 в пластоглобулах эндосперма зерна из-за замещений ао в транзитном пептиде может привести к отсутствию каротиноидов. При этом в фотосинтезирующей ткани или зародыше зерна данный эффект может нивелироваться активностью хлоропласт-специфичного изофермента ZmPSY2, геномный локус которого не содержит известных замещений ао, сцепленных с различиями (белый vs. желтый) в окраске эндосперма [7].

Разработка и тестирование праймеров на присутствие аллельных вариантов ZmPSY1 дикого и мутантного типов

С учетом замещений ао, специфичных для белозерных образцов кукурузы, была разработана система из трех праймеров. Последовательность обратного праймера (PSY155R: 5´-gccgctcctctgtcatcaac-3´, положение 512–531 в последовательности гена) была общей для аллеля дикого типа (желтозерные образцы) и мутантного аллеля (белозерные образцы). Последовательности двух прямых праймеров основывались на полиморфном участке кДНК PSY1 желтозерных (PSY155FG: 5´-ccttggcctccacccgtg-3´, положение 138–155 в последовательности гена) и белозерных (PSY155FC: 5´-cattggcctccacccgtc-3´, 138–155) образцов (рис. 1, а). Ожидаемый размер ПЦР-фрагмента – 394 пн. При амплификации с парами праймеров PSY155R/PSY155FG и PSY155R/PSY155FC на геномной ДНК растений кукурузы будет нарабатываться фрагмент, соответствующий аллелю дикого типа или мутантному аллелю ZmPSY1 соответственно.

Анализ аллельных вариантов с использованием разработанных праймеров проводили на образцах 44 линий (22 белозерных и 22 желтозерных) кукурузы (табл. 1). В результате было показано, что фрагмент, соответствующий мутантному аллелю, нарабатывается у девяти образцов из 22 тестируемых белозерных линий; остальные 13 показывают присутствие в геноме аллеля дикого типа (рис. 2, а). У всех тестируемых желтозерных линий амплифицировался фрагмент аллеля дикого типа (рис. 2, б). Секвенирование ампликонов подтвердило, что амплифицируются ожидаемые варианты последовательности ZmPSY1.

 

Рис. 2. Электрофорез в 2.5%-ном агарозном геле продуктов (394 пн) ПЦР-амплификации на геномной ДНК 44 инбредных линий кукурузы с праймерами, разработанными для аллелей дикого (PSY155R/PSY155FG; верх каждого геля) и мутантного (PSY155R/PSY155FC; низ каждого геля) типа. а – белозерные линии (1–22). У девяти образцов обнаружен аллель ZmPSY1 дикого типа, и 13 образцов содержали мутантный аллель; б – желтозерные линии (23–44). У всех 22 образцов показано присутствие аллельного варианта ZmPSY1 дикого типа. Нанесение образцов соответствует порядковым номерам линий в таб. 1; М – маркер длин ДНК GeneRuler Low Range (первые четыре полосы сверху вниз: 700, 500, 400, 300 пн).

 

Отдельно отметим, что белок ZmPSY1 белозерного образца 5254-3, который содержит выше дискутируемые замещения T257P и G274R (рис. 1, б), ассоциированные согласно [16] с белой окраской эндосперма, одновременно характеризуется мутантным типом аллеля (рис. 2, а). В связи с этим белая окраска зерна линии 5254-3 может быть связана как с тестируемыми нами замещениями ао в транзитном пептиде, так и с замещениями T257P и G274R.

Таким образом, идентифицированный и рассматриваемый в настоящем исследовании ранее не описанный мутантный аллель ZmPSY1 был характерен только для белозерных линий кукурузы, что свидетельствует о его возможной связи с дефицитом каротиноидов в эндосперме зерна. Присутствие аллеля дикого (по целевому участку кДНК/транзитному пептиду) типа у половины тестируемых белозерных линий может объясняться наличием в геномном локусе ZmPSY1 данных образцов других замещений ао, сцепленных с дефицитом каротиноидов в зерне [7, 16].

Работа выполнена при финансовой поддержке подпрограммы ФНТП «Развитие селекции и семеноводства кукурузы».

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

D. K. Arkhestova

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences; Institute of Agriculture - branch of the Kabardino-Balkarian Scientific Center of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: shchennikova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow 119071; Nalchik 360004

A. D. Khaudov

Institute of Agriculture - branch of the Kabardino-Balkarian Scientific Center of the Russian Academy of Sciences

Email: shchennikova@yandex.ru
Russian Federation, Nalchik 360004

A. V. Shchennikova

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: shchennikova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow 119071

E. Z. Kochieva

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Email: shchennikova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow 119071; Moscow, 119234

References

Supplementary files