Structure of subopopulations of Aireshire, Holstin and Jersey cattle in the Southern Regions of Russia by CSN2 (rs43703011), CSN3 (rs43703016) and microsatellite locuses (BM1818, BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, INRA023, SPS115, TGLA126, TGLA122, TGLA227, TGLA53)

Full Text

Микросателли́ты – участки ДНК, состоящие из тандемно повторяющихся мономеров. Генотипирование по микросателлитным локусам используется в генетических исследованиях и для подтверждения происхождения животных, так STR-маркеры BM1818, BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, INRA023, SPS115, TGLA126, TGLA122, TGLA227, TGLA53 рекомендованы для этой цели ISAG (International Society for Animal Genetics)[1–5].

Из описанных в литературных источниках генетических вариантов каппа-казеина крупного рогатого скота наиболее распространенными являются аллели А и В (rs43703016). Установлено, что аллель А в большинстве исследованных групп встречается значительно чаще аллеля В [6, 7]. Установлено, что молочные системы, полученные из молока животных CSN3BB, имеют самую короткую продолжительность коагуляции, лучшие значения прочности сгустка и повышенный выход по сравнению с молоком от коров CSN3 AA [8].

Для гена β-казеина (CSN2) описано 13 полиморфных вариантов. В зависимости от кодона, кодирующего аминокислоту в позиции 67β-казеина (гистидин или пролин), животные производят молоко двух типов: А1 и А2 и имеют генотипы А1А1, А1А2, А2А2[9].

Исследования, проведенные в ряде стран, показали, что существует связь между потреблением β-казеина типа А1 (rs43703011) и различными заболеваниями. При расщеплении ферментами ЖКТ молока, содержащего фракцию ß-казеина А1, образуется пептид ß-казоформин 7 (BCM-7) в значительно большем количестве, чем при соответствующем расщеплении молока, содержащего фракцию ß-казеина А2 (полученного от коров с генотипом А2А2).

Вероятно, опиоидный пептид BCM-7 имеет более высокое сродство, по сравнению с иными метаболитами, к ряду рецепторов мозговой ткани, иммунных клеток и клеток кишечника и запускает реакции воспаления, особенно у детей и людей с нарушениями функции пищеварения [9, 10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе исследований с использованием молекулярно-биологических методов проанализировано 3000 образцов крови коров айрширской породы (n = 1000) (АО “Агрокомплекс Павловский” Павловского района, ООО “ПЗ “Дружба” Калининского района, ПАО “ПЗ им. В.И. Чапаева” Динского района Краснодарского края); голштинской породы (n = 1000) (АО “Родина” Каневского района, ОАО Агрофирма племзавод “Победа” Каневского района, АО “Рассвет” Усть-Лабинского района Краснодарского края) и джерсейской породы (n = 1000) (ООО “Агроальянс Инвест” Александровского района Ставропольского края). Анализировались животные с подтвержденным по матери и отцу происхождением.

ДНК выделяли из цельной крови с антикоагулянтом (ЭДТА) при помощи ПЦР-совместимого реагента для проведения быстрого лизиса CorDIS Sprint. ПЦР проводили с использованием набора CorDIS Cattle (ООО “Гордиз”, Россия). Продукты амплификации анализировали с применением генетического анализатора Applied Biosystems 3500 Series Genetic Analyzer. Учитывались следующие STR-маркеры: BM1818, BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, INRA023, SPS115, TGLA126, TGLA122, TGLA227, TGLA53.

Для амплификации участка локуса CSN2 использовали разработанные нами праймеры следующей последовательности [11]:

BK1 5'-AGG GAT GTT TTG TGG GAG GCT CTT-3';

BK2 5'-ATA AAA TCC ACC CCT TTG CCC AGA-3'.

и наборы реагентов Gene Pak PCR Core (ООО Лаборатория “Изоген”, г. Москва). Фрагменты, амплифицированные с участка гена ß-казеина (температура отжига 63 ̊С), расщеплялись эндонуклеазой BstDEI (№ Е227, НПО “СибЭнзим”) в случае наличия аллеля А2 на два фрагмента: 64 и 22 пн Фрагмент, амплифицированный с аллеля А1, сайта рестрикции не имел (размер его составлял 86 пн). Результаты рестрикции оценивали в 2.5%-ном агарозном геле.

Для амплификации участка локуса CSN3 использовали следующие праймеры [12]:

KKAZ 1 5'-TGT GCT GAG TAG GTA TCC TAG TTA TGG-3';

KKAZ 2 5'-GCG TTG TCT TCT TTG ATG TCT CCT TAG-3'

Условия амплификации: 94°С — 3.5 мин; 94°С — 30 с, 62°С — 30 с, 72°С — 30 с — 32 цикла; 72°С — 3 мин. В результате фрагменты, которые амплифицировались с участка гена каппа-казеина варианта А, расщеплялись эндонуклеазой HinfI (№ Е076, НПО “СибЭнзим”) на три фрагмента: 326, 100 и 27 пн. Фрагмент, амплифицированный с аллеля В, расщеплялся на 2 фрагмента: 426 и 27 пн. Результаты рестрикции оценивали в 2.0%-ном агарозном геле.

Фактические частоты встречаемости отдельных генотипов определяли путем соотношения количества особей носителей генотипа к общему количеству особей в анализируемой группе.

Для подсчета частот аллелей использовали формулу

P = (2N1+N2)/2n,

где N1 – число гомозигот по исследуемому аллелю, а N2 – число гетерозигот, n – объем выборки.

Наблюдаемую и ожидаемую гетерозиготность, индекс фиксации Райта рассчитывали следующим образом:

H_о = h_j/n,

где H_о – наблюдаемая гетерозиготность по одному локусу, h_j – количество гетерозиготных генотипов в локусе, n – общее количество генотипов в локусе;

H_e = 1 – ∑р_i²,

где H_e – ожидаемая гетерозиготность по одному локусу, p_i – частота встречаемости i-го аллеля;

F_IS = (Н_е – H_o)/H_e,

где F_IS – индекс фиксации Райта, H_e – ожидаемая гетерозиготность, H_o – наблюдаемая гетерозиготность.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ частоты встречаемости гомозиготных вариантов микросателлитных локусов (BM1818, BM1824, BM2113, ETH10, ETH225, ETH3, INRA023, SPS115, TGLA126, TGLA122, TGLA227, TGLA53) в выборках животных айрширской, джерсейской и голштинской пород показал, что количество гомозиготных генотипов оказалось в целом выше у особей джерсейской породы. В среднем частота встречаемости гомозиготных генотипов по 12 локусам у джерсейского скота составила 0.38, у голштинского и айрширского — 0.30 и 0.27 соответственно (табл. 1).

У представителей всех трех пород отмечен достаточно высокий процент встречаемости гомозиготных по локусу TGLA126 животных. Однако у голштинов и джерсеев такие животные несли преимущественно генотип 117*117, а гомозиготные по TGLA126 айрширы – 115*115.

Установить связь между индивидуумами отдельной субпопуляции и субпопуляцией в целом позволяет индекс фиксации Райта (F_IS). Он количественно отражает отклонение частот встречаемости гетерозиготных генотипов от теоретически ожидаемой по Харди–Вайнбергу доли гетерозигот при случайном спаривании внутри популяции и может рассматриваться в качестве одного из критериев инбредности популяции. При этом положительное значение F_IS означает нехватку гетерозигот в данной популяции, в то время как отрицательное значение указывает на их избыток.

В исследуемой выборке джерсейского скота, несмотря на более высокий уровень гомозиготности, в среднем наблюдался минимальный излишек гетерозигот (F_IS = –0.03), в выборке айрширского – минимальный недостаток (F_IS = 0.01) (табл. 1).

 

Таблица 1. Структура субпопуляций крупного рогатого скота джерсейской, айрширской и голштинской пород по гомо- и гетерозиготности микросателлитных локусов

Микросателлитные локусы	Частота встречаемости локусов у животных
	джерсейской породы (n = 1000)		айрширской породы (n = 1000)		голштинской породы (n = 1000)
	гетерозиготные	гомозиготные	гетерозиготные	гомозиготные	гетерозиготные	гомозиготные
BM1818	0.74	0.26	0.81	0.19	0.63	0.37
BM1824	0.55	0.45	0.74	0.26	0.76	0.24
BM2113	0.34	0.66	0.88	0.12	0.74	0.26
ETH10	0.70	0.30	0.83	0.17	0.78	0.22
ETH225	0.67	0.33	0.83	0.17	0.67	0.33
ETH3	0.51	0.49	0.79	0.21	0.67	0.33
INRA023	0.73	0.27	0.68	0.32	0.66	0.34
SPS115	0.56	0.44	0.42	0.58	0.60	0.40
TGLA126	0.55	0.45	0.57	0.43	0.53	0.47
TGLA122	0.70	0.30	0.80	0.20	0.78	0.22
TGLA227	0.75	0.25	0.58	0.42	0.77	0.23
TGLA53	0.69	0.31	0.78	0.22	0.86	0.14
В среднем по 12 локусам	0.62 ± 0.07	0.38 ± 0.07	0.73 ± 0.07	0.27 ± 0.08	0.70 ± 0.05	0.30 ± 0.05
Ho (наблюдаемая гетерозиготность)	0.62		0.73		0.70
He (ожидаемая гетерозиготность)	0.60		0.74		0.70
FIS	–0.03		0.01		0.00

 

Наиболее высокое аллельное разнообразие оказалось у голштинского скота. Так, среднее количество аллелей на локус у джерсеев составило 5.8 ± 0.8, у айрширов – 7.8 ± 0.9, а у голштинов — 9.0 ± 1.7 (табл. 2).

 

Таблица 2. Характеристика аллелофонда по 12 микросателлитным локусам у животных джерсейской, айрширской и голштинской пород

Микросателлитные локусы	Джерсейская (n = 1000)		Айрширская (n = 1000)		Голштинская (n = 1000)
	Na	Na > 5%	Na	Na > 5%	Na	Na > 5%
BM1818	6	5	7	6	7	3
BM1824	5	3	6	5	5	4
BM2113	6	3	6	6	8	4
ETH10	6	4	8	6	8	4
ETH225	5	4	7	7	7	4
ETH3	4	2	7	6	8	4
INRA023	7	3	9	7	12	4
SPS115	6	4	6	6	7	3
TGLA126	4	4	7	5	7	2
TGLA122	7	4	11	7	14	4
TGLA227	9	5	9	9	11	4
TGLA53	5	4	10	8	14	7
Число аллелей на локус в среднем	5.8±0.8	3.8±0.5	7.8±0.9	6.5±0.7	9.0±1.7	3.9±0.7

Примечание. N_a – число аллелей на локус; N_a > 5% – число информативных аллелей.

 

Однако число информативных аллелей (т.е. встречающихся с частотой от 5% и выше) оказалось схоже в выборках джерсейского и голштинского скота (3.8 и 3.9 соответственно) и было значительно выше в выборке айрширского скота и составило 6.5 ± 0.7 аллелей на локус. На наш взгляд объяснить этот факт можно тем, что группы голштинского и джерсейского скота в представленных хозяйствах были сформированы преимущественно завезенными из-за рубежа чистопородными голштинскими или джерсейскими животными, а группа айрширских – путем поглотительного скрещивания (улучшаемая порода – красная степная, а улучшающая – айрширская).

Аллельные варианты исследуемых локусов и их встречаемость в группах джерсейского, айрширского и голштинского скота представлены для наглядности в виде диаграмм (рис. 1) и в табл. 3. Абсолютные значения встречаемости каждого из аллельных вариантов отражены на оси Y.

 

Рис. 1. Аллельные варианты микросателлитных локусов (ось Х) и их количество (ось Y) в выборках крупного рогатого скота

 

Рис. 1. (Окончание.) Аллельные варианты микросателлитных локусов (ось Х) и их количество (ось Y) в выборках крупного рогатого скота

 

Таблица 3. Частота встречаемости аллелей микросателлитных локусов в субпопуляциях айрширского, голштинского и джерсейского скота

Локус	Аллельный вариант	Джерсейский	Айрширский	Голштинский
BM1818	258	0.23	0.01	–
	260	0.14	0.01	–
	262	0.07	0.07	0.41
	264	0.12	0.00	0.10
	266	0.45	0.36	0.45
	268	–	0.08	0.02
	270	0.00	0.47	0.02
BM1824	178	0.00	0.43	0.28
	180	0.43	0.22	0.26
	182	0.01	0.22	0.15
	184	–	0.05	–
	188	0.55	0.08	0.31
	190	0.00	0.00	0.01
BM2113	121	–	–	–
	125	–	0.05	0.20
	127	–	0.07	0.15
	131	0.07	–	–
	133	0.09	0.14	0.01
	135	0.81	0.14	0.46
	137	0.03	0.43	0.04
	139	–	0.17	0.15
Eth10	209	–	–	0.02
	213	–	0.23	0.04
	215	0.43	0.14	0.01
	217	0.31	0.09	0.22
	219	0.18	0.14	0.30
	221	0.08	0.15	0.02
	223	0.01	0.25	0.18
	225	–	–	0.21
ETH225	140	0.14	0.15	0.11
	142	–	0.22	0.01
	144	0.49	0.13	0.03
	146	0.00	0.04	0.01
	148	0.29	0.03	0.48
	150	0.08	0.35	0.28
	152	–	0.08	0.09
ETH3	109	–	0.03	0.00
	117	0.58	0.33	0.46
	119	0.00	0.21	0.01
	121	0.01	0.01	–
	125	0.41	0.28	0.07
	127	–	0.13	0.16
	129	–	–	0.30
INRA023	198	0.21	–	–
	200	0.02	0.07	0.01
	202	–	–	0.18
	206	0.35	0.31	0.32
	208	0.34	0.02	0.01
Локус	Аллельный вариант	Джерсейский	Айрширский	Голштинский
	210	0.00	0.00	0.20
	214	0.04	0.49	0.28
	216	–	0.02	–
	218	0.03	–	–
	220	–	0.08	–
	222	–	0.01	–
SPS 115	248	0.12	0.58	0.56
	252	0.63	0.07	0.29
	254	0.15	0.26	0.02
	256	–	0.06	0.07
	258	–	0.01	0.01
	260	0.05	0.02	0.05
	261	0.05	–	–
TGLA 126	115	0.08	0.58	0.29
	117	0.66	0.33	0.64
	119	–	0.01	0.01
	121	0.11	0.04	0.04
	123	0.15	0.03	0.02
TGLA 122	141	–	0.07	0.01
	143	0.45	0.25	0.27
	147	–	0.22	–
	149	0.16	–	0.28
	151	0.23	0.36	0.04
	155	–	0.03	–
	161	0.00	0.05	0.04
	163	0.00	0.00	0.26
	169	0.15	–	–
	171	–	–	0.02
	183	–	0.02	0.07
TGLA 227	77	0.05	0.02	–
	81	0.43	0.15	0.02
	83	–	0.02	0.03
	85	–	0.09	–
	87	–	0.27	0.05
	89	0.00	0.13	0.40
	91	0.24	0.23	0.20
	93	0.22	0.03	0.01
	95	0.01	–	–
	97	0.01	0.06	0.16
	99	–	–	0.09
	101	0.06	–	–
	103	–	–	0.03
TGLA 53	154	–	0.02	0.01
	158	–	–	0.23
	160	0.24	0.29	0.08
	162	0.05	0.02	0.13
	166	–	0.34	0.02
	168	0.25	0.20	0.24
Локус	Аллельный вариант	Джерсейский	Айрширский	Голштинский
	170	0.43	0.07	0.01
	172	–	–	0.01
	176	–	–	0.08
	178	–	0.08	–
	182	0.02	–	–
	184	–	–	0.08
	186	–	–	0.10

 

У голштинских животных выявлены аллельные варианты, которые не встречались у джерсейского и айрширского скота: для локуса ETH3 – 129 (0.30), для локуса INRA023 – 202 (0.18), для TGLA 227 – 99 (0.09, для TGLA53 – 176 (0.08), 184 (0.08) и 186 (0.10).

Установлено, что уникальными для представленной выборки джерсейской породы является аллель 101 локуса TGLA227 с частотой встречаемости 0.06, аллель 261 локуса SPS115 (частота встречаемости 0.05) и аллель 198 локуса INRA023 (0.21).

Уникальными для айрширских животных являются аллели 184 локуса BM1824 (0.05) и 178 локуса TGLA53 (распространен с частотой 0.08).

С самой высокой частотой в группе особей джерсейской породы встретился аллель 135 локуса ВМ2113 (частота встречаемости 0.81), у айрширских животных – аллель 115 локуса TGLA126 – с частотой 0.58; у животных голштинской породы – аллель 117 локуса TGLA126 (частота встречаемости 0.64).

Типичными для голштинского скота и малораспространенными (либо не встречающимися) у представителей айрширской и джерсейской пород являются аллели 129 локуса ETH3, 176, 184, 186 локуса TGLA53.

Типичным для джерсейского скота оказался аллель 198 локуса INRA023.

Следует отметить значительные отличия микросателлитного профиля айрширского скота. Для айрширских животных типичными (но малораспространенными у джерсеев и голштинов) оказались аллели 270 локуса ВМ1818, 137 локуса ВМ2113, 213 локуса ETH10, 119 локуса ETH3, 142 локуса ETH225,87 локуса TGLA227, 166 локусаTGLA53. Интересно, что айрширская порода значительно отличается по частотам встречаемости аллельных вариантов и других полиморфных локусов [13, 14].

Полученные закономерности по частотам встречаемости и видовому разнообразию аллелей у голштинского скота нашей выборки сходны с таковыми у голштинизированного крупного рогатого скота Урала [15].

Как нам представляются практические возможности использования полученных данных? Например, ряд айрширских стад в нашем крае голштинизируется. Считается, что пятое поколение, полученное от чистопородных голштинских быков, – это чистопородные голштинские животные. Никаких анализов это подтверждающих не производится. Возможно, что наши исследования позволят в дальнейшем разработать доступную методику оценки чистопородности в подобных ситуациях.

Кроме того, проведено генотипирование выборок голштинского (n = 1000), айрширского (n = 1000) и джерсейского (n = 1000) скота по локусам CSN2 и CSN3.

Полученные результаты по частотам встречаемости генотипов и аллелей по CSN2 и CSN3 представлены в табл. 4.

 

Таблица 4. Частота встречаемости генотипов и аллелей по локусам CSN2 и CSN3 у крупного рогатого скота голштинской, айрширской и джерсейской пород

Локус	Генотип/аллель	Джерсейская (n = 1000)	Айрширская (n = 1000)	Голштинская (n = 1000)
CSN2	А1А1	0.02	0.24	0.19
	А1А2	0.30	0.51	0.50
	А2А2	0.68	0.25	0.31
	А1	0.18	0.49	0.44
	А2	0.82	0.51	0.56
CSN3	АА	0.01	0.57	0.33
	АВ	0.23	0.39	0.52
	ВВ	0.76	0.04	0.15
	А	0.13	0.77	0.59
	В	0.87	0.23	0.41

 

Анализ данных табл. 4 показывает, что если оценивать субпопуляции животных джерсейской, айрширской и голштинской пород с позиций перспектив селекции по локусам CSN2 и CSN3 (считая предпочтительными вариант А2А2 локуса CSN2 и вариант ВВ локуса CSN3) то проще всего добиться значимого результата с группой животных джерсейской породы. Так, в изученной субпопуляции джерсейского скота частота встречаемости генотипа А2А2 локуса CSN2 составила 0.68, а в группах айрширского и голштинского лишь 0.25 и 0.31 соответственно. Генотип ВВ локуса CSN3 встречался в джерсейской группе животных с частотой 0.76, а у айрширов и голштинов – 0.04 и 0.15 соответственно.

Сравнение полученных результатов с результатами исследований других авторов [9] показало, что субпопуляции юга России соответствуют у голштинской породы субпопуляции голштинской породы США (частота встречаемости аллеля А1 локуса CSN2 в ней – 0.42), у айрширской породы – субпопуляции Финляндии (0.50), а у генотипированной группы джерсейской породы частота встречаемости аллеля А1 оказалась выше (составила 0.18), чем в группе животных джерсейской породы США (0.02) [9].

Проведенное исследование показывает, что ограничиться подбором быков с гомозиготным генотипом (например, А2А2 или А2А2 ВВ) как стратегии создания стад – продуцентов молока желательного типа, можно только у джерсейских животных.

В голштинских и айрширских стадах нежелательные аллели A1 CSN2 и A CSN3 будут встречаться с достаточно высокой частотой в четырех–пяти следующих поколениях. А ограничение выбора быков-производителей быками с генотипами А2А2 и ВВ значительно сузит спектр производителей и приведет к потере других хозяйственно полезных признаков. У голштинских и айрширских животных правильная стратегия, на наш взгляд, – отбор животных с желательными генотипами, выделение их в отдельные группы, получение и переработка продукции именно от этих животных.

Следует отметить, что в мире нет единого мнения по поводу вредности молока типа А1 [9, 10]. Несмотря на это, селекционные программы в некоторых странах (например, Германии, США) направлены на элиминацию аллеля А1 локуса CSN2 из генотипа молочного скота.

Генотипированные группы джерсейских, айрширских и голштинских животных достаточны по объему, поэтому с большой степенью вероятности можно утверждать, что выявленные закономерности характерны для скота указанных пород на юге России (Ставропольский, Краснодарский край). Полученные данные можно использовать в исследовательской работе по отнесению тех или иных групп скота к типичным голштинским, айрширским или джерсейским группам и при создании стад – продуцентов молока определенного типа (например, молока типа А2).

Работа выполнена при поддержке Государственного задания и внебюджетных хоздоговорных средств. Номер регистрации темы “Разработать эффективные селекционные и биотехнологические методы сохранения и совершенствования существующих пород, создания новых типов и линий для рентабельного производства продукции в условиях современной технологии содержания и полноценного питания сельскохозяйственных животных” 0688-2019-0017.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

N. V. Kovalyuk

Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine

Author for correspondence.
Email: NVK1972@yandex.ru
Russian Federation, Krasnodar, 350055

A. E. Volchenko

Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine

Email: NVK1972@yandex.ru
Russian Federation, Krasnodar, 350055

E. V. Shiryaeva

Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine

Email: NVK1972@yandex.ru
Russian Federation, Krasnodar, 350055

L. I. Yakusheva

Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine

Email: NVK1972@yandex.ru
Russian Federation, Krasnodar, 350055

Yu. Yu. Shakhnazarova

Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine

Email: NVK1972@yandex.ru
Russian Federation, Krasnodar, 350055

References

Supplementary files