Оценка способности клонов плюсовых деревьев Picea abies (L.) H. Karst. из среднетаежной подзоны Карелии к соматическому эмбриогенезу

Full Text

Сокращения: Петрозаводская ЛСП – Петрозаводская лесосеменная плантация; СЭ – соматический эмбриогенез; ЭСМ – эмбрионально-суспензорная масса.

 

ВВЕДЕНИЕ

Древесина является универсальным, экологичным и возобновляемым материалом, который используется во многих отраслях промышленности [1]. Однако в результате антропогенного воздействия (лесозаготовка, сельскохозяйственные мероприятия и др.) площади лесных фитоценозов стремительно сокращаются [2‒4]. В связи с этим необходимы программы по эффективному лесовосстановлению. Использование микроклонального размножения с применением селекционно-генетических методов отбора растительного материала может способствовать ускоренному получению качественного семенного материала экономически ценных древесных видов.

Ель европейская (Picea abies (L.) H. Karst.) является одним из важнейших лесообразующих видов на территории Европы. Для восстановления фитоценозов без вреда для естественных лесов создаются плантации с использованием высокопродуктивных генотипов [4]. Однако семенная продуктивность P. abies варьирует от года к году из-за нерегулярного цветения и вредителей [5]. В связи с чем получение большого объема посадочного материала из ограниченного количества семян представляется крайне перспективным, что для хвойных растений наиболее эффективно достигается с помощью соматического эмбриогенеза (СЭ).

Впервые СЭ у голосеменных был описан в 1985 г. на примере незрелых зародышей P. abies [6, 7] и мегагаметофитов Larix deciduas Mill [8]. К сожалению, несмотря на то, что метод СЭ уже разработан, его широкое применение для P. abies сильно ограничено в связи с тиражированием только определенных генотипов, а также высокими затратами на ручной труд [4, 9, 10]. Между тем в литературе представлены данные по инициации СЭ у P. abies, а также получению растений-регенерантов и созданию на их основе плантаций [5, 11]. Помимо этого, имеются сведения об инициации СЭ для ряда других видов рода Picea: P. sitchensis (Bong.) Carr. [12, 13], P. omorica Purk., P. pungens “Glauca” Beissn., P. breweriana S. Watson [14], P. mariana (Mill.) [15], P. morrisonicola Hay. [16], P. koraiensis Nakai [17], P. ajanensis Fisch. ex Carr. [18], P. obovata Ledeb. [19] и др.

В России на сегодняшний день информация об успешной инициации СЭ и получении растений-регенерантов у P. abies в изученной нами литературе отсутствует. Более того, эффективность СЭ сильно варьирует на разных этапах и для различных генотипов растений, поэтому модификация протоколов на каждой стадии до сих пор остается актуальной задачей [4].

Цель исследования – изучение процесса соматического эмбриогенеза у эксплантов ели европейской, собранных с разных деревьев-доноров в среднетаежной подзоне Карелии и при разных условиях культивирования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор незрелых шишек производили с 10 клонов плюсовых деревьев ели европейской (Picea abies (L.) H. Karst.), произрастающих на двух участках Петрозаводской лесосеменной плантации (ЛСП) I порядка (Прионежский район, Республика Карелия). Плантация закладывалась в 1977-х годах (участок 1, деревья № 1–5) и 1994 (участок 2, деревья № 6–10). Характеристика деревьев приведена в табл. 1. Сбор шишек на Петрозаводской ЛСП проводили 27 июля, 25 августа и 19 сентября, что соответствовало сумме эффективных температур 728, 1126 и 1257 градусо-дней (при базовой температуре 5°С) соответственно. Также однократно – 4 августа (сумма эффективных температур – 822 градусо-дня) шишки были отобраны с дерева P. abies (возраст 15 лет), которое произрастало на территории Петрозаводского городского округа (г. Петрозаводск). В каждую дату отбора при помощи стереомикроскопа (Leica, Германия) определяли стадию развития зиготического зародыша.

Перед введением зародышей в культуру шишки хранили в холодильнике при температуре 4°С в течение 3–4 недель. Обработка растительного материала включала несколько этапов. Из шишек извлекали семена, которые в нестерильных условиях помещали в 70% этиловый спирт на одну минуту. Далее, в стерильных условиях семена помещали в 10% раствор перекиси водорода на 10 мин, после чего промывали в обильном количестве стерильной воды в течение 10 мин.

 

Таблица 1. Морфологическая характеристика деревьев ели, произрастающих на Петрозаводской лесосеменной плантации

№ дерева	Высота, м	Диаметр (0.3 м), см	Диаметр (1.3 м), см	Возраст дерева, лет
1	18	47	43	42
2	16	44	43	27
3	12	36	30	30
4	14	33	29	34
5	14	43	37	31
6	10	25	23	21
7	10	26	22	22
8	10	25	28	26
9	10	20	24	24
10	9	19	22	20

 

Семена очищали от покровных чешуй, мегагаметофиты осторожно вскрывали и зиготические зародыши помещали на среду инициации. В каждую банку, как правило, помещали 4 зиготических зародыша. Банки выдерживали в темноте при температуре 24 ± 1°C. Для инициации соматического эмбриогенеза в соответствии с данными литературы было выбрано две среды: DCR [20] и LM с модификациями [9, 21]. В качестве регуляторов роста растений использовали 2,4-Д (9.0 мкмоль) и БАП (4.5 мкмоль), содержание сахарозы в обеих средах составляло 10 г/л, агара – 6 г/л.

После того, как размеры культуры клеток достигали примерно 5–10 мм, из культуры удаляли зиготический зародыш, и ткань пересаживали на питательную среду для пролиферации (LM или DCR соответственно) для получения эмбрионально-суспензорной массы (ЭСМ) и создания клеточной линии. При успешной пролиферации клеточных линий субкультивирование проводили каждые 2 недели.

Для вызревания соматических зародышей часть ЭСМ помещали на питательную среду созревания (maturation LM) схожего состава, но содержащую вместо 2,4-Д и БАП – 30 мкмоль АБК, 60 г/л сахарозы и 9 г/л агара [9]. Сформированные семядольные соматические зародыши переносили на среду прорастания (germination LM) на 10–21 сутки, в зависимости от клеточной линии. Среда прорастания отличалась меньшим содержанием сахарозы (20 г/л), отсутствием NH4NO3 и фитогормонов. Культивирование на средах созревания и прорастания осуществляли на свету при 16-часовом фотопериоде.

Цитологический анализ полученных культур клеток P. abies проводился с применением метода давленых препаратов. Перед началом анализа каллус 1–2 мин выдерживали в красителе (0.2% водный раствор сафранина с добавлением одной капли насыщенного спиртового раствора метиленового синего), затем на предметное стекло переносили исследуемый образец культуры клеток и добавляли одну каплю глицерина [22]. Препараты просматривали под световым микроскопом (Carl Zeiss Primo Star, Германия) при 4-х и 10-кратном увеличении. Для микрофотосъемки использовали цифровую камеру-окуляр ADFstd 10 (ADF, КНР).

Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка развития зиготических зародышей показала, что на 27 июля 2022 г. бо́льшая часть зародышей находилась на глобулярной стадии развития (рис. 1а). В это время зародыш проходил этап раннего эмбриогенеза, на котором за счет деления клеток суспензора эмбрион продвигался к холозальному концу мегагаметофита, увеличивался в размерах и развивался. Следующий этап – поздний эмбриогенез, в результате которого 25 августа были зарегистрированы семядольные зародыши (рис. 1б). Завершается эмбриогенез формированием зрелого зиготического зародыша биполярной структуры, который несет на одном конце гипокотиля зародышевый корешок, на другом семядоли (19 сентября). Хранение материала при низких положительных температурах в течение 3–4 недель до введения в культуру in vitro способствовало замедлению развития.

В рамках исследования в культуру in vitro был введен 291 зиготический зародыш, собранный на Петрозаводской ЛСП с клонов плюсовых деревьев P. abies (помещены на питательную среду LM – 263 шт., на среду DCR – 28 шт.), а также 24 зародыша, отобранные с P. abies в г. Петрозаводске (помещены на питательную среду LM). Стоит отметить, что 18% (57 шт.) эксплантов из общей выборки, введенные в культуру in vitro, подверглись контаминации в первые 14 дней эксперимента и не учитывались при дальнейшем анализе.

Шишки, собранные с Петрозаводской ЛСП, были повреждены огневкой шишковой (Dioryctria abietella Schiff.). При вскрытии шишек от клонов плюсовых деревьев № 4, 5 и 8 целых семян обнаружить не удалось, соответственно в культуру in vitro экспланты с этих деревьев введены не были.

Образование массы клеток происходило на 7–14 сутки в зависимости от генотипа растения и среды инициации. При этом стадия развития зиготических зародышей P. abies, отобранных 27 июля и 25 августа, не оказывала существенного влияния на данный процесс. Зародыши, собранные 19 сентября, в 50% случаев в культуре in vitro развивались в растения.

 

Рис. 1. Внешний вид зиготического зародыша Picea abies: а – глобулярный зародыш (27 июля); б – семядольный зародыш (25 августа). Масштаб – 0.5 мм.

 

В результате сравнения данных по инициации культуры клеток на питательных средах LM и DCR из зародышей, полученных из семян деревьев P. abies, произрастающих на Петрозаводской ЛСП, было установлено, что инициация культуры в 2.5 раза чаще происходила на питательной среде LM (рис. 2а). В то же время 96% эксплантов P. abies из г. Петрозаводска образовывали массу клеток на среде LM. При визуальном осмотре наличие вредителей в шишках с данного растения обнаружено не было.

В результате морфологической оценки было выявлено, что на питательной среде DCR формировался белый и твердый каллус, который через некоторое время начинал темнеть, переставая развиваться. На среде LM формирующаяся масса клеток была прозрачной, слизистой и мягкой (рис. 3а). Именно такие культуры, как показали цитологические исследования, являлись ЭСМ (рис. 4). Формирование ЭСМ начинается в результате удлинения и неравного деления клеток, с образования длинной эмбриональной трубки и эмбриональной инициали [23]. Подобное деление является основным критерием успешности СЭ. Дальнейшее деление эмбриональных инициалей приводит к формированию глобулярной структуры зародыша. Через месяц культивирования из ЭСМ были выделены клеточные линии, которые отличались между собой по пролиферативной активности. Было сформировано 26 клеточных линий для деревьев с Петрозаводской ЛСП, что составляет 35% от общего числа образовавшихся масс клеток. Стоит отметить, что ЭСМ активно формировалась из эксплантов двух генотипов P. abies, произрастающих на Петрозаводской ЛСП – № 3 и 7 (рис. 2б). Из эксплантов, деревом-донором которых являлась P. abies из г. Петрозаводска, были получены 23 эмбриогенные культуры, из которых в дальнейшем сформировались клеточные линии (рис. 2б).

У всех клеточных линий часть ЭСМ была перенесена на следующую питательную среду (maturation LM), где происходило созревание соматических зародышей (рис. 3б, в). Формирование семядольных зародышей зафиксировано на 10–21 сутки культивирования, в зависимости от клеточной линии. Полученные растения размещались на субстрате germination LM. Спустя некоторое время у части растений (20%) начинали формироваться корни (рис. 3г). Таким образом, за 3 месяца исследования процесса СЭ были получены растения-регенеранты P. abies.

Спустя 14 месяцев культивирования из 26 клеточных линий, полученных от эксплантов P. abies из Петрозаводской ЛСП, сохранилось 12 шт. (46%), а из эксплантов P. abies г. Петрозаводска – 2 клеточные линии (9%). Часть культур была подвержена грибковой инфекции, а другая часть переставала развиваться, темнела и погибала. Наиболее активными пролиферативными способностями обладали клеточные линии, полученные из эксплантов клонов плюсовых деревьев № 3 и 7 (рис. 2б), которые сохранили способность к образованию растений-регенерантов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Получение вегетативного потомства хвойных растений методом СЭ активно развивается [4]. Предполагается, что в ближайшем будущем СЭ будет внедрен в селекционные программы стран Европы, что поспособствует преодолению проблем в лесном секторе, вызванных изменением климата и высоким спросом на продукцию из древесины.

 

Рис. 2. Частота образования массы клеток (а) из зародышей Picea abies, собранных с деревьев на Петрозаводской лесосеменной плантации (ЛСП) и в г. Петрозаводске; б – число клеточных линий. Светлые столбцы – клеточные линии, сформированные в летний сезон 2022 г.; темные столбцы – клеточные линии, сохранившихся спустя 14 месяцев культивирования.

 

Рис. 3. Получение соматических растений Picea abies: а – инициация эмбриогенной культуры; б – глобулярные соматические зародыши на питательной среде maturation LM; в – вызревание соматического зародыша; г – растения-регенеранты на питательной среде germination LM (стрелкой обозначен сформированный корень). Масштаб – 0.5 мм.

 

Рис. 4. Формирование соматических зародышей в эмбрионально-суспензорной массе Picea abies. Масштаб – 100 мкм.

 

Считается, что как зрелые, так и незрелые зиготические зародыши могут быть использованы в качестве эксплантов при инициации эмбриогенных культур Picea, хотя частота инициации у зрелых эмбрионов ниже, по сравнению с незрелыми [9, 24]. Так на P. abies было показано, что из незрелых зародышей формирование масс клеток достигает 100%, в то время, как из зрелых – 50% [25]. Для P. abies [26] и P. mariana [15] характерна более активная индукция СЭ из зиготических зародышей на этапе раннего эмбриогенеза на посткливажной стадии развития (культура мегагаметофитов). В то же время у P. sitchensis частота индукции СЭ составляла от 3 до 5% при использовании эксплантов как зрелых, так и незрелых зиготических зародышей [12, 13]. Установлено, что ЭСМ у P. pungens образуется из незрелых зиготических зародышей на стадии сформированных семядолей [27]. Представленные данные свидетельствуют о необходимости разработки видоспецифичных протоколов индукции СЭ для представителей рода Picea.

По нашим данным, в 2022 г. для среднетаежной подзоны Карелии оптимальным сроком для сбора шишек P. abies являлся период – конец июля–август. В этот период зиготический зародыш развивался из глобулярного в семядольный. При поздних сроках сбора растительного материала (сентябрь), помимо снижения частоты инициации из-за вызревания зародышей, пораженные вредителями шишки могут уже не содержать семян, что делает невозможным размножение растений как естественным путем, так и с помощью СЭ. Поэтому ранний сбор и хранение шишек при низких положительных температурах в холодильнике замедляет развитие зиготического зародыша, продлевая период введения материала в культуру без снижения частоты инициации, а также оказывает негативное влияние на развитие личинок вредителя, что способствует сохранению большей части семян. Отметим, что развитие личинок огневки шишковидной в шишках P. abies делает невозможным сбор семян с деревьев, произрастающих на Петрозаводской ЛСП на протяжении нескольких лет. Семена, собранные с клонов плюсовых деревьев на плантации, могли бы послужить качественным посадочным материалом для целей лесовосстановления в среднетаежных лесах Европейского Севера России. В связи с этим проведение исследований по искусственному размножению ценных генотипов хвойных растений с определенных географических районов и их сохранению в культуре in vitro является особенно актуальным.

Модификация протоколов и подбор условий культивирования до сих пор остается важнейшим этапом для успешного запуска СЭ. К ним относят протоколы по предварительной стерилизации растительного материала перед введением эксплантов в культуру in vitro и состав питательной среды. В литературе [24, 28] отмечается, что стресс, вызванный химическим и физическим воздействием на клетки экспланта, может способствовать укорачиванию теломер, а это, в свою очередь, оказывает негативное влияние на процесс СЭ. Для растений рода Picea наиболее часто используемыми и рекомендуемыми питательными средами являются LP [29] и LM [4, 21]. В нашем исследовании мы инокулировали зародыши P. abies на два субстрата, значительно отличающихся по составу. Показано, что питательная среда DCR не подходит для запуска СЭ P. abies – на ней формировался неэмбриогенный каллус. Похожие результаты были получены нами и при введении мегагаметофитов Pinus sylvestris L., содержащих незрелые зародыши [30, 31]. Интересно, что в работе Третьяковой с соавт. [19], где в культуру in vitro вводили зародыши P. obovata на 4 различных субстрата – DCR, 1/2LV, MS, AI, активной способностью к пролиферации обладали только 3 клеточные линии из 300, при этом большая часть ЭСМ культивировалась на питательной среде DCR.

В нашем эксперименте после среды пролиферации клеточные линии переносили на среду созревания и культивировали при 16-часовом фотопериоде. В литературе [32–34] представлена информация о том, что перед началом созревания зародышей хвойных растений на короткий период времени можно использовать субстрат, не содержащий регуляторы роста, с добавлением активированного угля (предсозревание). Помимо этого, для снижения осмотического потенциала питательной среды в нее добавляют полиэтиленгликоль [34–36]. Это может оказывать положительное влияние на созревание соматических зародышей. Также некоторые исследователи [33, 37] рекомендует выращивать культуры хвойных растений на среде созревания в темноте. Перечисленные выше модификации протоколов культивирования эмбриогенных линий, вероятно, могут способствовать лучшему формированию растений-регенерантов.

На успех инициации СЭ существенное влияние оказывает генотип дерева-донора. Aronen с соавт. [24] показали, что инициация СЭ у эксплантов P. abies от контролируемого опыления варьировала в зависимости от генотипа, а также отличалась год от года и составляла 61–100% в 2012 г., и 30–94% в 2014 г. В нашем исследовании ЭСМ были получены для всех деревьев, с которых удалось собрать неповрежденный семенной материал. При этом наибольшее число эмбриогенных клеточных линий было образовано для клонов плюсовых деревьев № 3 и 7, а также для дерева из г. Петрозаводска – 23 клеточные линии. Через 14 месяцев с начала культивирования от данных деревьев-доноров активную пролиферацию продолжили 36% (дерево № 3), 50% (дерево № 7) и 9% (дерево из г. Петрозаводска) клеточных линий от первоначально образованных. В работе Hazubska-Przybyl и Bojarczuk [11] показано, что спустя 24 месяца культивирования способностью к активному делению обладали 9% эмбриогенных культур P. abies. Таким образом, можно заключить, что генотип дерева-донора эксплантов оказывает влияние не только на инициацию СЭ, но и на последующую выживаемость клеточных линий.

В результате проведенных исследований были адаптированы протоколы различных этапов СЭ для эксплантов с деревьев-доноров P. abies, произрастающих в среднетаежной подзоне Карелии. Установлено, что незрелые зиготические зародыши, отобранные в качестве эксплантов при сумме эффективных температур 728–1126 градусо-дней (при базовой температуре 5°) и хранившиеся при низких положительных температурах в течение 3–4 недель, наиболее отзывчивы к СЭ. Выявлены генотипы клонов плюсовых деревьев, произрастающих на Петрозаводской ЛСП, способные к образованию ЭСМ, длительной пролиферации и формированию растений-регенерантов. Полученные данные свидетельствуют о высокой репродуктивной способности некоторых генотипов P. abies, произрастающих на Петрозаводской ЛСП, и важности проведения исследований по их массовому тиражированию с перспективой дальнейшего использования данных генотипов в качестве растительного материала для целей лесовосстановления на Европейском Севере России.

Авторы выражают благодарность сотрудникам Института леса – обособленного подразделения Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук” за помощь в сборе полевого материала и лично старшему химику лаборатории аналитической С.И. Тихомировой за помощь при культивировании клеточных линий ели европейской.

Работа выполнена за счет средств федерального бюджета по государственному заданию Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук” (Институт леса – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.

About the authors

Р. В. Игнатенко

Институт леса – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”

Author for correspondence.
Email: ocean-9@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

О. В. Чирва

Институт леса – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”

Email: ocean-9@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

М. А. Ершова

Институт леса – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”

Email: ocean-9@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

Н. А. Галибина

Институт леса – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”

Email: ocean-9@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

И. А. Теслюк

Институт леса – обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”

Email: ocean-9@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

References

Supplementary files