Влияние пептидного экстракта из гипофиза Северного оленя на когнитивные функции крыс при изменении светового режима

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Ежедневные изменения окружающей среды зависят от вращения Земли вокруг своей оси с периодом примерно равным 24 ч. Живые системы для адаптации к этим циклам используют эндогенные циркадианные часы. Биологические часы управляют многими физиологическими реакциями, чтобы привести организм в соответствие с ритмами окружающей среды. Однако ритмы сохраняются даже в отсутствие одного из основных внешних ритмозадателей, такого как свет [9, 11].

Структура эндогенных биоритмов определяется как упорядоченная совокупность взаимосвязанных колебательных систем — осцилляторов. Осцилляторы одного иерархического уровня функционируют параллельно, разных уровней — последовательно. Согласно данным литературы, одними из локальных осцилляторов служат клеточные окислительно-восстановительные реакции. На уровне транскрипции клеточные часы контролируют качество и количество многих антиоксидантных белков, кофакторов, ферментов [13]. Редокс-статус клетки является источником эндогенной информации об интенсивности и направленности метаболизма, который обеспечивает двигательную активность животных и необходимые когнитивные навыки для адаптации к изменениям во внешней среде [12, 14]. Известно, что нарушение циклов свет – темнота приводит к достаточно серьезным изменениям в физиологии, поведении и настроении [6], то есть значительно влияет на функции центральной нервной системы (ЦНС). В настоящее время показано, что количество синапсов и форма нейронов меняется в течение суток, осциллирует в соответствии с циркадианными ритмами, генерируемыми эндогенными биологическими часами, либо зависит напрямую от стимулов, поступающих из внешней среды. Подобные изменения называют циркадианной пластичностью, и они необычайно важны для процессов обработки сенсорной информации, обучения и памяти. Нарушение циркадианных ритмов может вызвать значительные повреждения мозговых функций [10]. С другой стороны, изменение поведенческих процессов, эмоциональный фон влияют на скорость метаболических реакций, тем самым синхронизируя эндогенные ритмы с реальной обстановкой во внешней среде. Соответственно, физическая, психическая и эмоциональная компоненты, составляющие основу когнитивных функций, являются ведущей формой взаимодействия животного с внешним миром. Одним из примеров животного, обладающего мощными адаптационными приспособлениями к экстремальному существованию в условиях полярной ночи и полярного дня, является Северный олень (Rangifer tarandus). Предполагается, что наличие кормовой базы и соответствующее пищевое поведение служат основой взаимодействия этих животных с окружающей средой. Существует также мнение, что для адаптации к световому режиму этими животными используется нециркадианная ритмика синтеза мелатонина, а экспрессия «классических часовых генов» нарушена или ослаблена [11].

Существуют различные виды светового десинхроноза (нарушение ритмики внешнего ритмозадателя), обусловленные как природными условиями (естественный режим освещения в северной части России, в Арктике и Антарктике), так и техногенными причинами (работа в ночную смену, трансмеридиональные перелеты). Длительное воздействие экстремального фактора приводит к развитию десинхроноза — патологического состояния организма, возникающего под действием экстремального фактора и характеризующегося десинхронизацией биоритмов, что способствует нарушению работоспособности и здоровья человека.

В проведенном исследовании для изучения светового десинхроноза и возможностей его коррекции был использован пептидный экстракт гипофиза Северного оленя. Регуляторные пептиды — это вырабатываемые организмом соединения, выполняющие важные нейромедиаторные, модулирующие и интегративные задачи. Они являются связующим звеном между основными системами организма (нервной, эндокринной, иммунной). Значимость регуляторных пептидов существенно возрастает при воздействии на организм негативных факторов (стрессы, повреждения). Пептиды признаны высокоизбирательными, эффективными, селективными веществами, и в то же время относительно безопасными, чем объясняется повышенный к ним интерес в фармацевтических исследованиях [4, 15].

Цель исследования — изучение влияния пептидов из гипофиза Северного оленя на показатели когнитивных функций крыс при длительном изменении светового режима на модели с измененной клеточной осцилляцией за счет оксидативного стресса, вызванного отравлением животных тиопенталом натрия в полулетальной дозе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на белых крысах-самцах породы Вистар массой 180–220 г. Длительность акклиматизационного периода для животных составляла 14 дней. Животные содержались в виварии в соответствии с требованиями ГОСТ 33044–2014 от 01.08.2015 «Принципы надлежащей лабораторной практики» при свободном доступе к воде и пище.

Животные были разделены на три группы: интактная, контрольная и опытная. Крысам из контрольной и опытной группы вводили депримирующий агент тиопентал натрия, внутрибрюшинно, однократно в полулетальной дозе 85 мг/кг массы животного. Животные из интактной группы получили физиологический раствор. После острого отравления типенталом натрия выжившие животные из контрольной и опытной группы были помещены в условия с разным режимом освещения: режим обычного освещения (12/12, светодиодное освещение, 500 лк), режим постоянного освещения и режим постоянной темноты на 1 мес. Животные интактной группы так же были размещены в разные режимы освещения, описанные выше. Таким образом, в каждом режиме освещения было 3 группы животных: интактная, контрольная и опытная. В каждой группе по 10 животных. Крысам опытной группы в каждом режиме освещения вводили пептидный экстракт гипофиза Северного оленя в течение 14 дней после отравления тиопенталом натрия в первую половину объективного дня в дозе 100 мкг/кг, интраназально, 1 раз в сутки (фармакологическая коррекция).

Через 1 мес. изучались когнитивные функции крыс в тесте условной реакции пассивного избегания (УРПИ). УРПИ позволяет изучить основные закономерности образования условного рефлекса, оценить влияние неблагоприятного фактора на процессы формирования, фиксации и воспроизведения временных связей. Условная реакция пассивного избегания болевого раздражения — метод, основанный на выработке условной реакции пассивного избегания в челночной камере у крыс в ответ на безусловный электрокожный болевой раздражитель, предъявляемый в темном отсеке камеры. Крысу помещают в светлый отсек. Вследствие своих биологических особенностей крыса предпочитает находиться в темном помещении. Время перехода животного из светлого в темный отсек регистрируется как латентный период первого захода (ЛП₀). При переходе в темный отсек животное получает болевое электрокожное раздражение через электродный пол (обучение). Для воспроизведения полученной информации крысу помещают в светлый отсек через 2 и 24 ч после обучения. В течение 2 мин регистрируют следующие параметры: количество обученных крыс (не зашедших в темную камеру на протяжении 2 мин) в процентах от общего количества животных и латентный период первого захода через 2 и 24 ч после обучения (ЛП₂ и ЛП₂₄).

Статистическая обработка данных выполнена с использованием программного обеспечения AtteStat, версия 13. В качестве непараметрического критерия использован критерий Манна – Уитни. Вывод о статистической достоверности различий между группами принимали при р ≤ 0,05 и ниже.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате исследования установлено, что через 1 мес. после острого отравления тиопенталом натрия в группе животных, находившихся при обычном освещении (12/12) и не получавших пептидного экстракта из гипофиза Северного оленя (контрольная группа), количество обученных животных через 2 ч после обучения составило 30 %, что было в 3 раза меньше по сравнению с интактной группой (табл. 1). В группе, получавшей пептидный экстракт гипофиза, количество обученных животных увеличивалось до 80 %. Через 24 ч количество обученных животных в группе без фармакологической коррекции снизилось до 20 %, а в группе с фармакологической коррекцией составило 80 %. Применение пептидного экстракта гипофиза у животных с измененной хроноструктурой, находившихся при обычном освещении, привело к достоверному увеличению латентного периода захода в темный отсек через 2 ч после обучения на 68,1 % по сравнению со значениями этого показателя в группе контрольных животных. При этом в контрольной группе латентный период захода в темный отсек через 2 ч после обучения достоверно снижался на 51,2 % по сравнению с интактной группой. Через 24 ч после обучения латентный период захода в темный отсек в группе контрольных животных достоверно снижался на 65,5 % по сравнению с интактной группой. Применение пептидного экстракта гипофиза Северного оленя достоверно увеличило это время в 2,5 раза по сравнению со значениями этого показателя в группе контрольных животных при обычном освещении.

 

Таблица 1. Фармакологическая коррекция показателей теста условной реакции пассивного избегания у крыс-самцов при обычном освещении через 1 мес. после острого отравления тиопенталом натрия

Table 1. Pharmacological correction of parameters of the passive avoidance conditioned reflex test in male rats under normal lighting for 1 month after acute poisoning with sodium thiopental

Исследуемый показатель / Researched parameter (M ± m)	Экспериментальные группы / Experimental groups
	интактные / intact (n = 10)	без коррекции (контроль) / without correction (control) (n = 10)	пептидный экстракт гипофиза / pituitary gland peptide extract (n = 10)
Латентный период первого захода, с / Latent period of the first entry, s	22,7 ± 4,4	21,3 ± 4,6	26,7 ± 5,7
Латентный период захода через 2 ч, с / Latent period of entry after 2 hours, s	108,3 ± 11,7	52,8 ± 17,1**	88,8 ± 15,9*
Процент обученных животных через 2 ч после обучения / Percentage of trained animals 2 hours after training	90	30	80
Латентный период захода через 24 ч, с / Latent period of entry after 24 hours, s	102,2 ± 11,8	37,3 ± 15,8**	93,7 ± 13,9*
Процент обученных животных через 24 ч после обучения / Percentage of trained animals 24 hours after training	90	20	70
*Достоверно в сравнении с контрольной группой (р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни); **достоверно в сравнении с интактной группой (р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни). *Significantly compared with the control group (р ≤ 0,05; Mann–Whitney test); **significantly compared with the intact group (р ≤ 0,05; Mann–Whitney test).

 

Таким образом, через 1 мес. после отравления тиопенталом натрия в полулетальной дозе у экспериментальных животных, находившихся в условиях обычного светового режима, наблюдались нарушения высших интегративных функций ЦНС. Полученные результаты объясняются нейротоксическим действием барбитуратов, связанным с доставкой и утилизацией кислорода в клетки ЦНС, что проявляется в увеличении концентрации активных форм кислорода, в снижении активности супероксиддисмутазы, инициации апоптоза и последующей массовой деструкцией нейронов [8]. Оксидативный стресс изменил ритмичность синтеза антиоксидантных ферментов, что привело к нарушению энергоснабжения, необходимого для правильного функционирования нейронов, и как следствие, снижение скорости синтеза белка, нарушение синаптической пластичности приводит к нарушению формирования памяти [1, 2, 5, 13]. Применение пептидного экстракта гипофиза Северного оленя способствовало цитопротективному процессу, что увеличило процент обученных животных [3, 7].

В табл. 2 представлены результаты теста УРПИ при постоянном освещении у крыс-самцов через 1 мес. после острого отравления тиопенталом натрия в полулетальной дозе и при использовании пептидного экстракта Северного оленя. Через 2 ч после обучения наблюдалось снижение в 2 раза процента обученных животных в контрольной группе по сравнению с интактной группой. Применение пептидного экстракта гипофиза Северного оленя приводило к 100 % количеству обученных животных. Через 24 ч количество обученных животных в группе без фармакологической коррекции составляло 30 %, а в группе с фармакологической коррекцией — 80 %. Отмечалось достоверное увеличение латентного периода первого захода в темный отсек в контрольной группе в 2,5 раза по сравнению с данным показателем животных интактной группы. При использовании клеточного экстракта гипофиза латентный период через 2 ч после обучения достоверно увеличился на 43,0 % по сравнению со значениями этого показателя в группе контрольных животных. Через 24 ч после обучения латентный период захода в темный отсек в группе контрольных животных был достоверно ниже на 40,0 % по сравнению с интактной группой. При применении пептидного экстракта гипофиза Северного оленя происходило достоверное увеличение исследуемого показателя на 81,2 % по сравнению с группой контрольных животных.

 

Таблица 2. Фармакологическая коррекция показателей теста условной реакции пассивного избегания у крыс-самцов при постоянном освещении через 1 мес. после острого отравления тиопенталом натрия

Table 2. Pharmacological correction of parameters of the passive avoidance conditioned reflex test in male rats under constant illumination for 1 month after acute poisoning with sodium thiopental

Исследуемый показатель / Researched parameter (M ± m)	Экспериментальные группы / Experimental groups
	интактные / intact (n = 10)	без коррекции (контроль) / without correction (control) (n = 10)	пептидный экстракт гипофиза / pituitary gland peptide extract (n = 10)
Латентный период первого захода, с / Latent period of the first entry, s	22,9 ± 11,3	56,6 ± 17,4**	18,0 ± 4,2
Латентный период захода через 2 ч, с / Latent period of entry after 2 hours, s	98,9 ± 14,2	83,9 ± 15,3	120,0 ± 0,0*
Процент обученных животных через 2 ч после обучения / Percentage of trained animals 2 hours after training	80	40	100
Латентный период захода через 24 ч, с / Latent period of entry after 24 hours, s	101,3 ± 12,6	60,7 ± 14,2**	110,5 ± 9,5*
Процент обученных животных через 24 ч после обучения / Percentage of trained animals 24 hours after training	80	30	80
*Достоверно в сравнении с контрольной группой (р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни); **достоверно в сравнении с интактной группой (р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни). *Significantly compared with the control group (р ≤ 0,05; Mann–Whitney test); **significantly compared with the intact group (р ≤ 0,05; Mann–Whitney test).

 

Изменение светового режима на постоянное освещение в течение 1 мес. вносит существенный вклад в поведение животных после острого отравления тиопенталом натрия. Это выражается в значительном увеличении латентного периода первого захода в темный отсек, через 2 и 24 ч, что свидетельствует о нарушенном психоэмоциональном состоянии животных. Сочетанное воздействие химического и физического факторов не сопровождалось аддитивным эффектом, так как количество обученных животных через 2 и 24 ч существенным образом не изменялось в этих группах. Тем не менее применение пептидного экстракта гипофиза Северного оленя оказало больший эффект у отравленных животных с измененным световым режимом по сравнению с отравленными животными без изменения такового. Данный факт свидетельствует о влиянии светового сигнала на чувствительность метаболизма в клетках ЦНС к действию пептидов после выраженного оксидативного стресса.

В табл. 3 представлены результаты теста УРПИ при постоянной темноте у крыс-самцов через 1 мес. после острого отравления тиопенталом натрия в полулетальной дозе и действия фармакологической субстанции.

 

Таблица 3. Фармакологическая коррекция показателей теста условной реакции пассивного избегания у крыс-самцов при постоянной темноте через 1 мес. после острого отравления тиопенталом натрия

Table 3. Pharmacological correction of parameters of the passive avoidance conditioned reflex test in male rats under constant darkness for 1 month after acute poisoning with sodium thiopental

Исследуемый показатель / Researched parameter (M ± m)	Экспериментальные группы / Experimental groups
	интактные / intact (n = 10)	без коррекции (контроль) / without correction (control) (n = 10)	пептидный экстракт гипофиза / pituitary gland peptide extract (n = 10)
Латентный период первого захода, с / Latent period of the first entry, s	42,3 ± 14,3	46,2 ± 13,0	7,5 ± 1,6*
Латентный период захода через 2 ч, с / Latent period of entry after 2 hours, s	97,5 ± 11,6	83,4 ± 15,3	100,0 ± 13,4
Процент обученных животных через 2 ч после обучения / Percentage of trained animals 2 hours after training	80	60	80
Латентный период захода через 24 ч, с / Latent period of entry after 24 hours, s	78,2 ± 17,2	71,0 ± 16,5	90,7 ± 15,2
Процент обученных животных через 24 ч после обучения / Percentage of trained animals 24 hours after training	70	50	80
*Достоверно в сравнении с контрольной группой (р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни); **достоверно в сравнении с интактной группой (р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни). *Significantly compared with the control group (р ≤ 0,05; Mann–Whitney test); **significantly compared with the intact group (р ≤ 0,05; Mann–Whitney test).

 

При изменении освещения на постоянную темноту после оксидативного стресса, вызванного тиопенталом натрия в дозе LD50, выявлено достоверное снижение латентного периода первого захода в темный отсек в опытной группе с фармакологической коррекцией пептидным экстрактом гипофиза Северного оленя на 83,7 % по сравнению с животными из контрольной группы. Латентный период первого захода в темный отсек через 2 и 24 ч после обучения в контрольной группе незначительно снижался, а в опытной группе незначительно повышался по сравнению с интактной группой. Через 1 мес. в контрольной группе животных через 2 ч после обучения наблюдалось снижение количества обученных животных до 60 %, что было ниже на 20 % по сравнению с интактной. В опытной группе количество обученных животных находится на уровне интактной группы. Через 24 ч по количеству обученных животных наблюдалась сходная тенденция.

Изменение в течение 1 мес. светового режима на постоянную темноту снизило процент обученных животных после отравления по сравнению с интактной группой, находившихся в том же световом режиме, но не так выраженно, как при постоянном освещении. Использование фармакологической коррекции пептидным экстрактом гипофиза Северного оленя восстановило способность к выработке условного рефлекса, формированию памятного следа.

Полученные данные о воздействии пептидного экстракта гипофиза Северного оленя на высшие интегративные функции ЦНС в отсутствие внешнего ритмозадателя свидетельствуют, вероятно, об изменении экспрессии часовых генов или/и об усилении активности периферических ритмозадателей. Результаты использования пептидной субстанции свидетельствуют о хронобиотической активности пептидного экстракта гипофиза Северного оленя в дозе 100 мкг/кг при интраназальном введении.

ВЫВОДЫ

1. Изменение светового режима в течение 1 мес. в условиях измененной клеточной осцилляции приводило к нарушению высших интегративных функций ЦНС у крыс. Это сопровождалось повышением скорости угасания рефлекса и нарушением процессов консолидации памяти, при этом в условиях постоянного освещения данные нарушения более выражены.
2. Результатом фармакологической коррекции этих изменений пептидным экстрактом гипофиза Северного оленя в дозе 100 мкг/кг при интраназальном введении стало улучшение процессов консолидации памяти и воспроизведения информации (увеличение количества обученных животных при изменении светового режима).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Этический комитет. Исследование одобрено комиссией по биоэтике ФГБУН ИТ ФМБА России, протокол № 1 от 2018 г.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Ethics approval. Ethical approval: the study was approved by the Commission on Bioethics of the FSBI IT FMBA of Russia, Protocol No. 1, 2018

Об авторах

Екатерина Геннадьевна Батоцыренова

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; Научно-клинический центр токсикологии им. акад. С.Н. Голикова Федерального медико-биологического агентства

Автор, ответственный за переписку.
Email: bkaterina2009@yandex.ru

канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии, ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России; ведущий научный сотрудник лаборатории биохимической токсикологии и фармакологии, ФГБУ «Научно-клинический центр токсикологии им. С.Н. Голикова ФМБА»

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Маргарита Викторовна Мельникова

Научно-клинический центр токсикологии им. акад. С.Н. Голикова Федерального медико-биологического агентства

Email: margarita10108@mail.ru

научный сотрудник лаборатории лекарственной токсикологии — испытательного центра изделий медицинского назначения

Россия, Санкт-Петербург

Алиса Владимировна Бельская

Научно-клинический центр токсикологии им. акад. С.Н. Голикова Федерального медико-биологического агентства

Email: belskayaalisa@gmail.com

научный сотрудник, заместитель руководителя испытательного центра лаборатории лекарственной токсикологии — испытательного центра изделий медицинского назначения

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Олегович Иванов

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: doivanov@yandex.ru
SPIN-код: 4437-9626

д-р мед. наук, профессор, главный внештатный неонатолог Минздрава России, ректор, заведующий кафедрой неонатологии с курсами неврологии и акушерства и гинекологии ФП и ДПО

Россия, Санкт-Петербург

Вадим Анатольевич Кашуро

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: kashuro@yandex.ru

д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой биологической химии, ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России; профессор кафедры анатомии и физиологии животных и человека, ФГБОУ ВО «Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена»; профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии, ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Елена Николаевна Красникова

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: enkrasnikova@gmail.com

канд. хим. наук, доцент кафедры биологической химии

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Вячеславович Шарабанов

Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства

Email: avsharabanov@gmail.com

научный сотрудник

Россия, пос. Светлые Горы, Московская обл.

Список литературы

Дополнительные файлы