Морфологические особенности яичников потомства лабораторных мышей, которым вводили эстрогены во время беременности

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Вопрос о воздействии женских половых гормонов и их аналогов на человека и экспериментальных животных представляет большой интерес в медицине [8, 16]. Эстроген, который вырабатывают яичники, является представителем женских стероидных половых гормонов и проявляет широкий спектр физиологических функций: регуляция менструального цикла, размножения, модуляция плотности костной ткани, функций мозга и мобилизация холестерина [17]. Биологические эффекты эстрогенов передаются в основном через взаимодействие с рецепторами эстрогенов [12, 14]. Вырабатываемые яичниками стероиды необходимы для адекватного роста и развития плода и поддержания баланса многих функций во время беременности [18]. Стероидогенез увеличивается на протяжении беременности. При осложненной беременности концентрация стероидных гормонов меняется. Недостаточная или повышенная концентрация стероидных гормонов провоцирует бесплодие, синдром поликистозных яичников, выкидыш, преэклампсию, гестационный сахарный диабет и преждевременные роды [15].

Несмотря на благотворное действие эндогенного эстрогена, устойчивое воздействие экзогенного эстрогена — значимый фактор риска канцерогенеза [11] их метаболитов на молекулярно-генетическом уровне в эстроген-чувствительных тканях, в том числе и в репродуктивных органах [9, 19]. Эндокринный дисбаланс матери увеличивает вероятность патологических изменений в репродуктивных органах [4], костно-мышечном аппарате, иммунной и нервной системах обоих полов [13].

В настоящее время количество существующих моделей провоцирующего действия эстрогенподобных веществ на организм человека и млекопитающих незначительно. Пренатальное исследование воздействия препаратов с эстрогенной активностью, а также изучение последствий их применения на потомство является актуальной задачей исследования.

Цель работы — изучение морфологических особенностей яичников потомства лабораторных мышей после введения эстрогенов материнскому организму во время беременности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на половозрелых лабораторных мышах массой 19–21 г, которые были получены в «Питомнике лабораторных животных» (Республика Башкортостан, Чишминский район, с. Горный, лицензия № 99-04-000097 от 25.01.2005, Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ). Условия вивария и содержание животных соответствовали «Методическим рекомендациям по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений», другим санитарным нормам и требованиям ветеринарного контроля и надзора работ с лабораторными и экспериментальными животными.

После фертилизации беременных самок лабораторных мышей разделили на группы: две контрольные и две экспериментальные, которым на стадии развития гестации Е11.5 было выполнено внутримышечное однократное введение экспериментальных доз эстрогенов. Расчеты эффективности доз препарата производили в соответствии с коэффициентами для перерасчета доз веществ в мкг/кг для мышей [2, 3, 5–7]. Первой экспериментальной группе вводили однократно внутримышечно синестрол в виде 2 % масляного раствора в общей дозе 50 мкг/кг (n = 5; С-50), первой контрольной группе вводили оливковое масло в дозе 0,2 мкг/кг (n = 5; МО). Второй экспериментальной группе был введен 0,0005 % масляный раствор фулвестранта 0,4 мл в дозе 100 мкг/кг (n = 5; Ф-100), группа контроля (n = 5; МК) получала стерильное касторовое масло в дозе 0,8 мкг/кг.

По достижении постнатального возраста 90 дней потомство (по пять животных, рожденных от самок каждой группы) выводили из опыта в одну и ту же фазу эстрального цикла — в фазу диэструса. Для определения фазы эстрального цикла использовали влагалищные мазки, окрашенные по Романовскому и критерии, предложенные M.C. Cora и соавт. [10]. Все экспериментальные манипуляции выполнены в соответствии с Женевской конвенцией (Geneva, 1990), а также Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным (2000). На работу получено разрешение экспертного совета по биомедицинской этике ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» (протокол № 3 от 17.03.2014).

Объектом исследований служили яичники потомства лабораторных мышей, их извлекали и фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, подвергали стандартной гистологической обработке. Срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование, визуализацию и морфометрию гистологических препаратов производили с использованием инвертированного биологического микроскопа для лабораторных исследований Axioobserver со штативом D1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия), со специализированным программным обеспечением ZEN2018 (микроскоп был предоставлен лабораторией клеточных культур Центральной научной исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета). Фотосьемку гистологических препаратов производили цифровой камерой AxioCamMRc5 (Carl Zeiss, Япония).

Были определены следующие морфометрические показатели яичников: средняя площадь поперечного среза, средняя площадь коркового, мозгового веществ, средний диаметр кровеносных сосудов, средняя площадь желтых тел, среднее количество лютеиновых клеток в желтом теле на стандартной площади, среднее количество атретических фолликулов в яичнике на стандартной площади. Были также исследованы фолликулы на разных стадиях развития: примордиальные, первичные, вторичные, третичные на стандартной площади с дальнейшим сравнением полученных результатов с контрольной группой [1]. Всего приготовлено 97 гистологических микропрепаратов.

Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, США). По каждому параметру вычисляли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку (М ± SD). Достоверность изменений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, различия определяли при достигнутом уровне значимости p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При однократном пренатальном введении беременным самкам лабораторных мышей на стадии гестации Е11.5 препарата синестрола в виде 2 % масляного раствора в дозе 50 мкг/кг в экспериментальной группе С-50 выявило статистически значимое увеличение средней площади поперечного среза яичников по центру через мозговое вещество и средней площади коркового вещества (см. таблицу, рис. 1). Статистически значимое уменьшение средней площади мозгового вещества наблюдается в экспериментальной группе С-50 (31,5 ± 2,3 мкм²), в отличие от группы контроля МО (172,6 ± 2,5 мкм²). Мозговое вещество хорошо васкуляризовано, в строме яичника наблюдается статистически значимое увеличение среднего диаметра кровеносных сосудов в экспериментальной группе С-50 (31,0 ± 1,6 мкм), что свидетельствует об усилении их кровоснабжения, в контрольной группе МО (22,0 ± 3,7 мкм), кровеносные сосуды проходят из мозгового вещества в корковое. Соединительнотканная основа среза яичников экспериментальной группы С-50 не упорядочена, образована коллагеновыми волокнами, клетками фибробластического ряда веретенообразной формы, в срезе наблюдалось перемещение фолликулов на периферию ближе к корковому веществу, сократилось на стандартной площади количество примордиальных, вторичных, третичных фолликулов (5,4 ± 1,7; 4,2 ± 1,1; 3,0 ± 0,7). Среднее количество первичных фолликулов увеличилось в группе С-50 по сравнению с группой контроля МО. Среднее количество атретических фолликулов в экспериментальной группе С-50 и в группе контроля МО примерно одинаковое. Желтые тела покрыты соединительнотканной капсулой, от которой к центру направляются тонкие прослойки, содержащие кровеносные и лимфатические сосуды. Обнаруженные желтые тела имеют неправильную форму. Наблюдается увеличение среднего количества желтых тел в экспериментальной группе С-50 (4,8 ± 1,3), в сравнении с группой контроля МО (2,2 ± 1,3). Статистически увеличивается среднее количество лютеиновых клеток в экспериментальной группе С-50 (622,2 ± 26,1), тогда как в группе контроля МО этот показатель составил 448,0 ± 91,0.

 

Таблица / Table

Анализ морфометрических показателей среза яичников на стандартной площади потомства при пренатальном однократном внутримышечном воздействии эстрогенов / Analysis of morphometric parameters of the ovarian section on the standard area of the offspring with prenatal, single, intramuscular exposure to estrogens

Показатель / Indication	Группы / Group
	Контроль МО / Control (olive oil)	С-50 / S-50	Контроль МК / Control (castor oil)	Ф-100 / F-100
Средняя площадь поперечного среза яичников по центру органа, мкм2 / Mean cross-sectional area of the ovaries in the center of the organ, μm2	1249,2 ± 81,4	1628,3 ± 62,1*	964,5 ± 167,5	1122,3 ± 412,2
Средняя площадь коркового вещества среза яичников по центру органа, мкм2 / Mean area of the cortical substance of the ovarian section in the center of the organ, μm2	1076,6 ± 82,0	1596,7 ± 62,5*	862,8 ± 175,3	1273,7 ± 196,7*
Средняя площадь мозгового вещества среза яичников по центру органа, мкм2 / Mean area of the medulla of the ovarian section in the center of the organ, μm2	172,6 ± 2,5	31,5 ± 2,3*	101,7 ± 10,4	73,1 ± 22,6*
Средний диаметр кровеносных сосудов на стандартной площади среза яичников, мкм / Mean diameter of blood vessels on a standard ovarian incision area, μm	22,0 ± 3,7	31,0 ± 1,6*	21,5 ± 6,6	22 ± 6,6
Среднее количество примордиальных фолликулов на стандартной площади / Mean number of primordial follicles per standard area	8,0 ± 1,6	5,4 ± 1,7*	8,2 ± 3,7	11,0 ± 1,9
Среднее количество первичных фолликулов на стандартной площади / Mean number of primary follicles per standard area	3,4 ± 0,5	5,0 ± 1,2*	4,6 ± 1,5	7,6 ± 2,4*
Среднее количество вторичных фолликулов на стандартной площади / Mean number of secondary follicles per standard area	5,2 ± 2,9	4,2 ± 1,1	6,6 ± 1,5	10,0 ± 2,7*
Среднее количество третичных фолликулов на стандартной площади / Mean number of tertiary follicles per standard area	3,4 ± 0,9	3,0 ± 0,7	2,4 ± 1,1	3,6 ± 1,5
Среднее количество атретических фолликулов на стандартной площади / Mean number of atretic follicles per standard area	3,2 ± 0,8	3,0 ± 0,7	3,2 ± 1,3	7,4 ± 1,8*
Среднее количество желтых тел на стандартной площади / Mean number of yellow bodies in a standard area	2,2 ± 1,3	4,8 ± 1,3*	1,6 ± 1,1	3,2 ± 1,3
Среднее количество лютеиновых клеток в желтом теле на стандартной площади / Mean number of luteal cells in the yellow body per standard area	448,0 ± 91,0	622,2 ± 26,1*	465,8 ± 64,7	439 ± 20,4

* Выраженные эффекты значимы при р ≤ 0,05. * Marked effects are significant at р ≤ 0.05.

 

Рис. 1. Микрофотография препарата среза яичника потомства экспериментальной группы С-50. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×100

Fig. 1. Microphoto of the ovarian section preparation of the offspring of the experimental group S-50. Stained with hematoxylin-eosin. Magnification ×100

 

Рис. 2. Микрофотография препарата среза яичника потомства экспериментальной группы Ф-100. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×100

Fig. 2. Micrograph of the preparation of the ovarian section in the offspring of the experimental group F-100. Stained with hematoxylin-eosin. Magnification ×100

 

После проведенных морфометрических исследований среза яичников потомства лабораторных мышей во второй экспериментальной группе при однократном внутримышечном пренатальном введении препарата фулвестранта в дозе 100 мкг/кг, Ф-100, установлено, что снаружи яичник окружен белочной оболочкой, состоящей из плотной волокнистой соединительной ткани, покрытой мезотелием. Средняя площадь поперечного среза яичников в экспериментальной группе Ф-100 увеличена, по сравнению с группой контроля МК (см. таблицу, рис. 2).

Под белочной оболочкой располагается корковое вещество, состоящее из плотно лежащих фибробластов и межклеточного вещества. Средняя площадь коркового вещества в экспериментальной группе значительно больше (1273,7 ± 196,7 мкм²), чем в группе контроля МК (862,8 ± 175,3 мкм²).

Мозговое вещество на срезе яичников представлено большим количеством неупорядоченных эластических волокон, гладкомышечных клеток. Средняя площадь мозгового вещества в экспериментальной группе Ф-100 составила 73,1 ± 22,6 мкм², в контрольной группе МК наблюдается увеличение данного показателя (101,7 ± 10,4 мкм²).

При исследовании среднего диаметра сосудов среза яичников наблюдается склерозирование стромального компонента, приводящее к усилению кровоснабжения в виде перестройки сосудистой сети, выражающееся в увеличении среднего диаметра сосудов (22 ± 6,6 мкм) в экспериментальной группе Ф-100 в отличие от группы контроля МК (21,5 ± 6,6 мкм).

В корковом веществе на срезе яичников фолликулы находятся на разных стадиях развития: от примордиальных, первичных, вторичных, до зрелых третичных фолликулов, отмечается статистически значимое увеличение в экспериментальной группе Ф-100 в отличие от контрольной группы МК. На гистологическом срезе яичников экспериментальной группы наблюдаются кистозные изменения в фолликулах разных уровней развития. Среднее количество атретических фолликулов на срезе яичников в экспериментальной группе Ф-100 почти в два раза больше, чем в группе контроля МК.

Обнаруженные желтые тела имеют овальные или округлые формы. Проведенные исследования выявили, что в экспериментальной группе Ф-100 среднее количество желтых тел статистически увеличивается (3,2 ± 1,3) в отличие от группы контроля МК (1,6 ± 1,1). Среднее количество лютеиновых клеток в желтом теле на стандартной площади яичника в экспериментальной группе Ф-100 уменьшается, в сравнении с группой контроля МК.

ВЫВОДЫ

Таким образом, анализ морфометрических показателей среза яичников при пренатальном однократном внутримышечном воздействии синестрола в экспериментальной группе С-50, по сравнению с контрольной группой (МО), показал: увеличение средней площади коркового вещества среза яичников на 48,3 % (р ≤ 0,05); уменьшение средней площади мозгового вещества на 81,7 % (р ≤ 0,05); увеличение среднего диаметра кровеносных сосудов на 40,9 % (р ≤ 0,05), демонстрирующее усиление кровообращения в органе; снижение среднего количества примордиальных фолликулов на 32,5 % (р ≤ 0,05); увеличение среднего количества первичных фолликулов на стандартной площади на 47,1 % (р ≤ 0,05), свидетельствующее о нарушении процесса фолликулогенеза; увеличение среднего количества желтых тел в два раза (р ≤ 0,05); увеличение среднего количества лютеиновых клеток в желтом теле на 38,8 % (р ≤ 0,05).

Морфометрическая оценка показателей среза яичников потомства лабораторных мышей при пренатальном однократном внутримышечном воздействии фулвестранта в экспериментальной группе Ф-100, по сравнению с контрольной группой (МК), показала: увеличение средней площади коркового вещества на 47,6 % (р ≤ 0,05); уменьшение средней площади мозгового вещества на 28,1 % (р ≤ 0,05); увеличение среднего количества первичных фолликулов на 65,2 % (р ≤ 0,05); увеличение среднего количества вторичных фолликулов на 51,5 % (р ≤ 0,05); увеличение среднего числа атретических фолликулов в два раза ( р ≤ 0,05). На срезе яичников наблюдается склерозирование стромального компонента, сопровождающееся перестройкой сосудистой сети с признаками атрезии и кистозного перерождения во вторичных и третичных фолликулах.

Полученные результаты исследования подтверждают актуальность проблемы внедрения комплексных мероприятий, направленных на лимитирование воздействия вводимых в материнский организм препаратов эстрогенового ряда в период беременности, для предотвращения неблагоприятных эффектов на развитие яичников потомства.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Об авторах

Римма Тагировна Сулайманова

Университет «Реавиз»

Автор, ответственный за переписку.
Email: rimma2006@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-1658-9054
SPIN-код: 4933-2131

канд. биол наук, доцент кафедры медико-биологических дисциплин

Россия, Санкт-Петербург

Радик Магзинурович Хайруллин

Университет «Реавиз»

Email: r.m.hayrullin@reaviz.online

д-р мед. наук, профессор кафедры морфологии и патологии

Россия, Санкт-Петербург

Анна Ивановна Лебедева

Всероссийский центр глазной и пластической хирургии

Email: Jeol02@mail.ru

д-р биол. наук, старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела морфологии

Россия, Уфа

Луиза Изатуллаевна Сулайманова

Городская поликлиника № 52 Департамента здравоохранения города Москвы

Email: lsulajmanova@bk.ru

врач-терапевт

Россия, Москва

Элиза Джабраиловна Асхабова

Городская клиническая больница № 15 им. О.М. Филатова Департамента здравоохранения города Москвы

Email: eliza_askhabova92@mail.ru

врач-терапевт

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы