Идентификация скрытого нарушения свертывания крови (дефицит XI фактора) методом полимеразной цепной реакции (экспериментальное исследование)

Полный текст

Актуальность исследования Незначительные кровотечения довольно часто встречаются у детей и в некоторых случаях маскируют серьезные заболевания системы свертывания крови. Как правило, это редкие наследственные заболевания, связанные с недостаточностью таких факторов свертывания как I, II, V, VII, X, XI и XIII, а также дефицит, наиболее часто сопряженный с совместной недостаточностью факторов V и VIII и факторов, синтез которых связан с витамином К [2]. Считается, что у детей кровотечения из носа и легкие кровотечения являются нормой в 39 и 24 % случаев [6]. К другим кровотечениям, которые, как считается, не связаны с дефицитом факторов (наследственных) свертывания, относятся определенные анатомические аномалии недоразвития черепно-мозговой, желудочно-кишечной, мочеполовой систем и, что особенно актуально, системы эндокринной регуляции: тяжело протекающие и затяжные менструации у девочек-подростков, сопряженные, предположительно, с недоразвитием гипоталамо-гипофизарно-гонадного тракта, включая ановуляторные циклы [1]. Дети со скрытыми кровотечениями, сопряженными с врожденными аномалиями факторов свертывания крови, часто невосприимчивы к стандартным методам антикоагуляционной фармакотерапии. При этом в педиатрической клинике зачастую трудно провести рандомизированное исследование, вследствие сложности выявления таких детей-носителей наследственной аномалии по определенному фактору свертывания крови [8]. Поэтому мы и предприняли данное сравнительное экспериментальное исследование. По сведениям OMIA - ON LINE MENDELIAN INHERITANCE IN ANIMALS каталога у млекопитающих (Bos Taurus L.) в настоящее время выявлено 462 генетически обусловленных морфологических и функциональных нарушений и из них 46 наследственных аномалий можно идентифицировать с помощью молекулярно-генетических методов. Своевременная диагностика данных мутаций и выбраковка животных и племенного материала, а также требования генетического паспорта при закупке животных, эмбрионов, замороженной спермы позволяют элиминировать наследственные заболевания. Дефицит XI фактора свертывания крови у Bos Taurus L. является аутосомальным рецессивным наследственным генетическим дефектом. Впервые данная патология была зарегистрирована у Bos Taurus L. в 1969 году. Часто этиологическим фактором большинства скрытых генетических дефектов у животных являются точечные мутации в кодирующей части соответствующих генов. Известно, что генетический дефект, дефицит XI фактора свертывания крови у Bos Taurus L. (FXID), наоборот, является последствием вставки нуклеотидной последовательности в составе экзона 12 гена FXI длиной 76 пар оснований. В результате инсерции появился STOP codon (TAA) [3]. Высокая скорость распространения вредных мутаций определяется рецессивным характером их наследования. Продукты таких генов, как правило, участвуют в регуляции тканеспецифичных функций и неблагоприятные эффекты мутантного аллельного варианта компенсируются в гетерозиготе нормальной функцией аллеля дикого типа. Селекция на уровне фенотипа является неэффективной в связи с низкой частотой гетерозигот по отношению к гомозиготам. Фенотипически, дефицит XI фактора (FXID) свертывания крови у телят характеризуется длительным кровотечением из пупочного канатика, анемией. У коров, гетерозиготных носителей дефицита XI фактора свертывания крови, проявляется молозиво розового цвета, обычно такие животные воспримчивы к пневмонии, маститам и воспалениям верхнего репродуктивного тракта [4]. Исследованиями наших зарубежных коллег установлено, что недостаточность FXI фактора свертывания крови у млекопитающих негативно влияет на репродуктивную функцию у коров, в частности у таких животных снижается рост фолликулов и половой цикл сопровождается снижением пиковой концентрации эстрадиола в крови животных. У Bos Taurus L., гомозиготных и гетерозиготных носителей генетического дефекта фактора XI свертывания крови регистрируются низкие показатели воспроизводительной функции, часто встречаются трудные отелы и рождение нежизнеспособных телят [5]. В настоящее время молекулярно-генетические основы генетических дефектов млекопитающих, принадлежащих к виду Bos Taurus L., достаточно хорошо изучены, на основании этих исследований разработаны методы диагностики наследственных заболеваний. Все наследственные заболевания животных в той или иной степени связаны с нарушением репродуктивной функции у коров, снижением резистентности организма телят, у носителей мутации генетического дефекта часто регистрируются эмбриональная смертность, повышение индекса осеменения в результате ранней смертности предимплантационных эмбрионов в период стельности [7]. Цель работы: разработка метода идентификации дефицита XI фактора свертывания крови методом полимеразной цепной реакции и изучение распространенности данной патологии у популяции Bos Taurus L. Акмолинской и Алматинской областей. Материалы и методы Исследования проводились на 35 племенных быках АО «Асыл-Тулик» и на 24 быках ТОО «Асыл» и 37 коровах голштинской породы ТОО «Байсерке-Агро» в рамках реализации проекта «Мониторинг племенных животных Республики Казахстан на носительство генетических дефектов с помощью молекулярно-генетических методов» в учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра Казахского национального аграрного университета. В качестве материала для исследования были использованы замороженная сперма быков и периферическая кровь коров. ДНК из крови коров и спермы быков выделяли с помощью набора «ДНК сорб В». При выделении ДНК из замороженной спермы с целью оптимизации и выделения более качественной ДНК нами был использован способ предварительной обработки спермы следующим образом: вносили в пробирку 200 мкл спермы, затем добавляли 1 мл лизирующего буфера, имеющий состав: 100 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCI, рН 8,0 и перемешивали в течение 30 секунд, далее центрифугировали g 10 000 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования, суспендировали осадок в 500 мкл буфера: 100 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCI, рН 8,0 и добавляли 8 мкл 2-меркаптоэтанола. Затем перемешивали на вортексе в течение 1 минуты и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Полимеразную цепную реакцию проводили на термоциклере «Терцик» производства России. Для детекции носителей дефицита XI фактора свертывания крови использовали праймеры: F-5′-CCCACTGGCTAGGAATCATT-3′ и R-5′- CAAGGCAATGTCATATCCAC-3′. Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать фрагмент гена FXID размером 244 п. н. у здоровых гомозиготных животных, 244 п. н. и 320 п. н. у гетерозиготных носителей и 320 п. н. у гомозиготных носителей генетического дефекта (рис. 1). Условия проведения ПЦР: первый шаг - денатурация ДНК при температуре 95 °C - 10 минут, второй шаг 35 циклов, денатурация при 95 °C - 30 сек, отжиг праймеров - 55 °C 60 с и элонгация при температуре 72 °C 30 с. Завершающий синтез при 72 °C продолжительностью 10 мин. Хранение при +4 °C. Объем реакционной смеси был 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 Х буфера для ПЦР, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации каждого dNTP, 0,5 мкл фермента Taq Polymerase с активностью 5u/μl, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл дистиллированной воды. Результаты исследования и обсуждение В нашей работе для выделения ДНК из спермы быков-производителей и из периферической крови коров был использован метод экстракции ДНК с помощью набора «ДНК сорб В». Амплификация нужного фрагмента гена FXID проводилась с использованием прямого и обратного праймеров в течение 35 циклов. ПЦР-диагностика данного генетического дефекта основана на том, что у здоровых гомозиготных животных при амплификации образуется один бэнд размером 244 п. н., в случае гетерозиготного носительства в результате инсерции (вставки нуклеотидных последовательностей 76 п. н.) образуется второй бэнд размером 320 п. н. Нами были тестированы методом полимеразной цепной реакции 59 голов племенных быков-производителей и 37 голов коров голштинской породы Канадского происхождения ТОО «Байсерке-Агро». На электрофореграмме хорошо видны полоски ДНК-размером 244 п. н., лунки (1-13) и лунка М - ДНК-маркер плазмида pUC19DNA (рис. 1), рестрицированная эндонуклеазой MspI. Данный ДНК-маркер имеет фрагменты длиной 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34, 34 и на электрофореграмме четко видно, что амплификат размером 244 п. н. идет на уровне 242 п. н. ДНК-маркера. Предварительные результаты исследований свидетельствуют, что среди исследуемых животных отсутствуют носители генетического дефекта - дефицита XI фактора свертывания крови крупного рогатого скота (FXID). При этом в последнее время Республика Казахстан ежегодно в большом объеме закупает живой племенной скот и замороженную сперму племеных быков-производителей зарубежной селекции. Выводы Необходимо проведение мониторинга всего племенного поголовья на носительство данного наследственного заболевания, так как у гетерозиготных носителей дефицита XI фактора свертывания не проявляются клинические признаки этого генетического дефекта.

Об авторах

Есенгали Серикович Усенбеков

Казахский национальный аграрный университет

Email: usen03@mail.ru
канд. биол. наук, профессор, заведующий кафедрой клинической ветеринарной медицины

Орик Оразимановна Жансеркенова

Казахский национальный аграрный университет

Email: orik10@inbox.ru
канд. ветеринарных наук, руководитель учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра

Шинар Николаевна Касымбекова

Казахский национальный аграрный университет

Email: 070702007@mail.ru
ст. науч. сотрудник учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра

Сарсенбек Тореханович Сиябеков

Казахский национальный аграрный университет

Email: usen03@mail.ru
канд. ветеринарных наук, доцент кафедры клинической ветеринарной медицины

Иван Викторович Соболев

ГБУЗ «Санкт-Петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)»

Email: sobol548@inbox.ru
врач-онколог, отд. гинекологии

Руслан Иванович Глушаков

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Email: glushakovruslan@gmail.com
канд. мед. наук, доцент

Валерий Павлович Терлецкий

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных»

Email: valeriter@mail.ru
д-р биол. наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела биотехнологии лаборатории молекулярной цитогенетики

Сергей Николаевич Прошин

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Email: psnjsn@rambler.ru
д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии

Список литературы

Дополнительные файлы