Гетерологичный синтез фрагментов N и M капсидного белка VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни птиц в дрожжах Pichia pastoris

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. Инфекционная бурсальная болезнь — одно из наиболее часто встречающихся и экономически значимых вирусных заболеваний птиц. Наиболее действенным способом предупреждения инфекционных заболеваний является вакцинация. Субъединичные вакцины, содержащие иммуногенный белок патогена или его фрагменты, но не содержащие других белков, липополисахаридов, токсинов, не вызывают побочных реакций.

Цель — получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, которые синтезируют и секретируют фрагменты капсидного белка VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни.

Материалы и методы. Последовательности ДНК, кодирующие фрагменты N и М белка VP2, были клонированы под контролем промотора гена АОХ1 и интегрированы в геном штаммов Х-33 (mut+) и GS115 (his4) дрожжей P. pastoris.

Результаты. Анализ белков, секретируемых полученными штаммами, продемонстрировал возникновение дополнительных белков с молекулярной массой, соответствующей целевым белкам.

Заключение. Таким образом, полученные штаммы дрожжей P. pastoris — продуценты фрагментов N и М белка VP2 могут быть использованы для выделения иммуногенных белков и создания субъединичной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц.

Об авторах

Андрей Михайлович Румянцев

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

канд. биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Михаил Александрович Цыганков

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: mial.tsygankov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2513-6655
SPIN-код: 1098-0995
Scopus Author ID: 56252740000
ResearcherId: H-4691-2013

инженер-исследователь

Россия, Санкт-Петербург

Владислав Валерьевич Веретенников

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: vlad.veretennikov.96@mail.ru
SPIN-код: 3412-1396
Scopus Author ID: 57219380560

младший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Елена Викторовна Самбук

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: esambuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0837-0498
SPIN-код: 8281-8020
Scopus Author ID: 6603061322
ResearcherId: H-6895-2013

д-р биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Марина Владимировна Падкина

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: mpadkina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-код: 7709-0449
Scopus Author ID: 57200427270

д-р биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Marangon S., Busani L. The use of vaccination in poultry production // Rev Sci Tech. 2007. Vol. 26. No. 1. P. 265–274. doi: 10.20506/rst.26.1.1742
  2. Hon C.C., Lam T.T., Yip C.W., et al. Phylogenetic evidence for homologous recombination within the family Birnaviridae // J Gen Virol. 2008. Vol. 89. No. 12. P. 3156–3164. doi: 10.1099/vir.0.2008/004101-0
  3. Berg T.P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review // Avian Pathol. 2000. Vol. 29. No. 3. P. 175–194. doi: 10.1080/03079450050045431
  4. Muller H., Mundt E., Eterradossi N., Islam M.R. Current status of vaccines against infectious bursal disease // Avian Pathol. 2012. Vol. 41. No. 2. P. 133–139. doi: 10.1080/03079457.2012.661403
  5. Румянцев А.М., Сидорин А.В., Самбук Е.В., Падкина М.В. Современные технологии производства вакцин против инфекционных болезней птиц // Экологическая генетика. 2021. Т. 19, № 3. С. 241–262. doi: 10.17816/ecogen71021
  6. Ellis R.W. Development of combination vaccines // Vaccine. 1999. Vol. 17. No. 13–14. P. 1635–1642. doi: 10.1016/s0264-410x(98)00424-1
  7. Azad A.A., Barrett S.A., Fahey K.J. The characterization and molecular cloning of the double-stranded RNA genome of an Australian strain of infectious bursal disease virus // Virology. 1985. Vol. 143. No. 1. P. 35–44. doi: 10.1016/0042-6822(85)90094-7
  8. Jagadish M.N., Staton V.J., Hudson P.J., Azad A.A. Birnavirus precursor polyprotein is processed in Escherichia coli by its own virus-encoded polypeptide // J Virol. 1988. Vol. 62. No. 3. P. 1084–1087. doi: 10.1128/JVI.62.3.1084-1087.1988
  9. Da Costa B., Chevalier C., Henry C., et al. The capsid of infectious bursal disease virus contains several small peptides arising from the maturation process of pVP2 // J Virol. 2002. Vol. 76. No. 5. P. 2393–2402. doi: 10.1128/jvi.76.5.2393-2402.2002
  10. Lee C.C., Ko T.P., Chou C.C., et al. Crystal structure of infectious bursal disease virus VP2 subviral particle at 2.6A resolution: implications in virion assembly and immunogenicity // J Struct Biol. 2006. Vol. 155. No. 1. P. 74–86. doi: 10.1016/j.jsb.2006.02.014
  11. Letzel T., Coulibaly F., Rey F.A., et al. Molecular and structural bases for the antigenicity of VP2 of infectious bursal disease virus // J Virol. 2007. Vol. 81. No. 23. P. 12827–12835. doi: 10.1128/JVI.01501-07
  12. Eckart M.R., Bussineau C.M. Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast // Curr Opin Biotechnol. 1996. Vol. 7. No. 5. P. 525–530. doi: 10.1016/s0958-1669(96)80056-5
  13. Berlec A., Strukelj B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells // J Ind Microbiol Biotechnol. 2013. Vol. 40. No. 3–4. P. 257–274. doi: 10.1007/s10295-013-1235-0
  14. Celik E., Calık P. Production of recombinant proteins by yeast cells // Biotechnol Adv. 2012. Vol. 30. No. 5. P. 1108–1118. doi: 10.1016/j.biotechadv.2011.09.011
  15. Ahmad M., Hirz M., Pichler H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. Vol. 98. No. 12. P. 5301–5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5
  16. Джавадов Э.Д., Румянцев А.М., Веретенников В.В., Тарлавин Н.В. Использование рекомбинантного белка VP2 в качестве субъединичной вакцины против инфекционной бурсальной болезни // Международный вестник ветеринарии. 2021. № 3. С. 9–14. doi: 10.17238/issn2072-2419.2021.3.19
  17. Web.mit.edu [интернет]. “Smash and Grab” Yeast Genomic Prep. Методика выделения ДНК, “Smash and Grab” [дата обращения 12.10.21]. Доступ по ссылке: http://web.mit.edu/biology/guarente/protocols/quickprep.html
  18. Wu S., Letchworth G.J. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol // Biotechniques. 2004. Vol. 36. No. 1. P. 152–154. doi: 10.2144/04361DD02
  19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984. 480 с.
  20. Padkina M.V., Parfenova L.V., Gradoboeva A.E., Sambuk E.V. Heterologous interferons synthesis in yeast Pichia pastoris // Appl Biochem Microbiol. 2010. Vol. 46. P. 409–414. doi: 10.1134/S0003683810040083
  21. Azad A.A., McKern N.M., Macreadie I.G., et al. Physicochemical and immunological characterization of recombinant host-protective antigen (VP2) of infectious bursal disease virus // Vaccine. 1991. Vol. 9. No. 10. P. 715–722. doi: 10.1016/0264-410x(91)90286-f
  22. Pradhan S.N., Prince P.R., Madhumathi J., et al. Protective immune responses of recombinant VP2 subunit antigen of infectious bursal disease virus in chickens // Vet Immunol Immunopathol. 2012. Vol. 148. No. 3–4. P. 293–301. doi: 10.1016/j.vetimm.2012.06.019
  23. Arnold M., Durairaj V., Mundt E., et al. Protective vaccination against infectious bursal disease virus with whole recombinant Kluyveromyces lactis yeast expressing the viral VP2 subunit // PLoS One. 2012. Vol. 7. No. 9. ID e42870. doi: 10.1371/journal.pone.0042870
  24. Pitcovski J., Gutter B., Gallili G., et al. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens // Vaccine. 2003. Vol. 21. No. 32. P. 4736–4743. doi: 10.1016/s0264-410x(03)00525-5
  25. Taghavian O., Spiegel H., Hauck R., et al. Protective oral vaccination against infectious bursal disease virus using the major viral antigenic protein VP2 produced in Pichia pastoris // PLoS One. 2013. Vol. 8. No. 12. ID e83210. doi: 10.1371/journal.pone.0083210
  26. Salehinia J., Sadeghi H.M.M., Abedi D., Akbari V. Improvement of solubility and refolding of an anti-human epidermal growth factor receptor 2 single-chain antibody fragment inclusion bodies // Res Pharm Sci. 2018. Vol. 13. No. 6. P. 566–574. doi: 10.4103/1735-5362.245968
  27. Esmaili I., Mohammad Sadeghi H.M., Akbari V. Effect of buffer additives on solubilization and refolding of reteplase inclusion bodies // Res Pharm Sci. 2018. Vol. 13. No. 5. P. 413–421. doi: 10.4103/1735-5362.236834
  28. Shi R., Pan Q., Guan Y., et al. Imidazole as a catalyst for in vitro refolding of enhanced green fluorescent protein // Arch Biochem Biophys. 2007. Vol. 459. No. 1. P. 122–128. doi: 10.1016/j.abb.2006.11.002
  29. Arakawa T., Ejima D., Tsumoto K., et al. Suppression of protein interactions by arginine: a proposed mechanism of the arginine effects // Biophys Chem. 2007. Vol. 127. No. 1–2. P. 1–8. doi: 10.1016/j.bpc.2006.12.007
  30. Schuchner S., Behm C., Mudrak I., Ogris E. The Myc tag monoclonal antibody 9E10 displays highly variable epitope recognition dependent on neighboring sequence context // Sci Signal. 2020. Vol. 13. No. 616. ID eaax9730. doi: 10.1126/scisignal.aax9730

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схемы полученных плазмид. а — Расположение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, соответствующих фрагментам M (208–351 ак.) и N (18–139 ак.) белка VP2 вируса ИББ; b — схема плазмид pPICZαВ/(625-1053) и pPICZαВ/(52-417). Обозначены бактериальный ориджин репликации (pUC origin), ген устойчивости к антибиотику зеоцину [кодирующая последовательность — Zeo(R), бактериальный промотор — EM7, дрожжевой промотор — TEF1, терминатор транскрипции — CYC1], экспрессионная кассета [промотор гена алкогольоксидазы 1 (AOX1 promoter)], последовательность сигнального пептида (alpha-factor), последовательности, кодирующие фрагменты белка VP2 вируса ИББ (M-VP2 и N-VP2), последовательности, кодирующие c-myc-эпитоп и гистидиновую метку (6хHis), терминатор транскрипции гена алкогольоксидазы 1 (AOX1 transcription terminator)

Скачать (105KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграммы продуктов ПЦР. a — Результаты ПЦР: 1 — с праймерами к последовательности фрагмента N и плазмидой pPICZαВ/(52-417) в качестве матрицы, 3 — с праймерами к последовательности фрагмента М и плазмидой pPICZαВ/(625-1053); b — результаты ПЦР: с праймерами к последовательности фрагмента N и геномной ДНК штамма N-X-33 (4), штамма N-GS115 (5); с праймерами к последовательности фрагмента М и геномной ДНК штамма M-X-33 (6); штамма M-GS115 (7). Дорожки 2 и 8 — маркер DNA Ladder 100+ bp (Евроген, Россия)

Скачать (114KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофореграмма белков культуральной среды штамма M-X-33 (а) и результаты вестерн-блот-гибридизации с антителами к эпитопу c-myc (b). 1 — Культуральная жидкость исходного штамма X-33; 2 и 4 — маркеры PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermofisher Scientific, США); 3 — культуральная жидкость штамма M-X-33, синтезирующего секреторный фрагмент M VP2 (208–351 ак.) с эпитопом c-myc и гистидиновой меткой. Стрелкой указана полоса, соответствующая секреторному фрагменту М белка VP2

Скачать (70KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Электрофореграмма белков, очищенных из культуральной жидкости штаммов дрожжей — продуцентов фрагментов N и М белка VP2 (а) и результаты вестерн-блот-гибридизации с антителами к эпитопу c-myc (b). 1 — Белки культуральной жидкости исходного штамма X-33 (отрицательный контроль); 2 — секреторный фрагмент N VP2 (18–139 ак.), синтезированный штаммом N-X-33; 3 и 4 — секреторный фрагмент M VP2 (208–351 ак.), синтезированный штаммами M-X-33 и M-GS115 соответственно; 5 — маркер PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermofisher Scientific, США). Указаны полосы, соответствующие синтезированным белкам (белая стрелка), и полосы, предположительно соответствующие димеру M-фрагмента VP2 (черная стрелка)

Скачать (100KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Результаты вестерн-блот гибридизации с антителами к эпитопу c-myc. Очищенный фрагмент М белка VP2 (208–351 ак.) в буфере PBS с 250 мМ имидазола без кипячения (1); с кипячением (2); очищенный фрагмент М белка VP2 в буфере PBS без кипячения (4); с кипячением (5); 3, 6 — маркер PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermofisher Scientific, США). Указаны полосы, соответствующие синтезированным белкам (белая стрелка) и полосы, предположительно соответствующие димеру M-фрагмента VP2 (черная стрелка). Отдельно указаны высокомолекулярные агрегаты белка (Аг)

Скачать (92KB)
Метаданные

© ООО "Эко-Вектор", 2022


 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах