Изучение биохимической функции рецептор-подобных киназ гороха sym10, sym37 и k1, необходимых для развития бобово-ризобиального симбиоза

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

В развитии бобово-ризобиального симбиоза основную роль играют Nod-факторы, выделяемые бактериями порядка Rhizo­biales. Nod-факторы действуют в низких концентрациях, а их биологическая активность зависит от структуры, что предполагает наличие у растений специфичных рецепторов. Для гороха вероятными кандидатами на роль рецепторов являются LysM-содержащие рецепторные киназы — Sym10, Sym37 и K1, необходимость которых для развития симбиоза была показана при анализе мутантов. Однако способность связываться с Nod-фактором не была изучена, что определяется сложностью их получения в необходимом количестве для анализа. В этой работе исследована возможность синтеза рецепторных белков гороха в бактериях и использования метода поверхностного плазмонного резонанса для анализа связывания с лигандом.

Об авторах

Елена Анатольевна Долгих

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: dol2helen@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0003-3433-2102
SPIN-код: 4453-2060

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Анна Николаевна Кириенко

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Email: kirienkoann@yandex.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Оксана Дмитриевна Ковалева

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Email: meriones@list.ru

младший научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Игорь Анатольевич Тихонович

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Email: arriam2008@yandex.ru

д-р биол. наук, профессор, академик РАН, директор ФГБНУ ВНИИСХМ

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Список литературы

  1. Madsen EB, Madsen LH, Radutoiu S, et al. A receptor kinase gene of the LysM type is involved in legume perception of rhizobial signals. Nature. 2003;425:637-640. doi: 10.1038/nature02045.
  2. Radutoiu S, Madsen LH, Madsen EB, et al. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases. Nature. 2003;425:569-570. doi: 10.1038/nature02039.
  3. Broghammer A, Krusell L, Blaise M, et al. Legume receptors perceive the rhizobial lipochitin oligosaccharide signal molecules by direct binding. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(34):13859-13864. doi: 10.1073/pnas.1205171109.
  4. Mulder L, Lefebvre B, Cullimore J, Imberty A. LysM domains of Medicago truncatula NFP protein involved in Nod factor perception. Glycosylation state, molecular modeling and docking of chitooligosaccharides and Nod factors. Glycobiology. 2006;16(9):801-809. doi: 10.1093/glycob/cwl006.
  5. Lefebvre B, Klaus-Heisen D, Pietraszewska-Bogiel A, et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. J Biol Chem. 2012;287(14):10812-10823. doi: 10.1074/jbc.M111.281634.
  6. Fliegmann J, Canova S, Lachaud C, et al. Lipo-chitooligosaccharidic symbiotic signals are recognized by LysM receptor-like kinase LYR3 in the legume Medicago. ACS Chemical Biology. 2013;8 (9):1900-1906. doi: 10.1021/cb400369u.
  7. Malkov N, Fliegmann J, Rosenberg C, et al. Molecular basis of lipo-chitooligosaccharide recognition by the lysin motif receptor-like kinase LYR3 in legumes. Biochem J. 2016;473:1369-1378. doi: 10.1042/BCJ20160073.
  8. Zhukov V, Radutoiu S, Madsen LH, et al. The Pea Sym37 receptor kinase gene controls infection-thread initiation and nodule development. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2008;21(12):1600-1608. doi: 10.1094/MPMI-21-12-1600.
  9. Liu T, Liu Z, Song C, et al. Chitin-induced dimerization activates a plant immune receptor. Science. 2012;336(6085):1160-1164. doi: 10.1126/science.1218867.
  10. Hooykaas PJJ, Snidewint FGM, Schilperoort RA. Identification of the Sym plasmid of Rhizobium leguminosarumstrain 1001 and its transfer to and expression in other Rhizobia and Agrobacterium tumefaciens. Plasmid. 1982;8:73-82. doi: 10.1016/0147-619x(82)90042-7.
  11. Downie JA, Ma QS, Knight CD, et al. Cloning of the symbiotic region of Rhizobium leguminosarum: the nodulation genes are between the nitrogenase genes and a nifA-like gene. EMBO J. 1983;2(6):947-952.
  12. Spaink HPD, Sheeley M, van Brussel AAN, et al. A novel highly unsaturated fatty acid moiety of lipo-oligosaccharide signals determines host specificity of Rhizobium. Nature. 1991;354(6349):125-130. doi: 10.1038/354125a0.
  13. Duc G, Messager A. Mutagenesis of pea (Pisum sativum L.) and the isolation of mutants for nodulation and nitrogen fixation. Plant Sci. 1989;60:207-213. doi: 10.1016/0168-9452(89)90168-4.
  14. van Brussel AAN, Tak T, Wetselaar A, et al. Small leguminosae as test plants for nodulation of Rhizobium leguminosarum and other rhizobia and agrobacteria harbouring a leguminosarum sym-plasmid. Plant Science Letters. 1982;27(3):317-325. doi: 10.1016/0304-4211(82)90134-1.
  15. Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 1951;62:293-300.
  16. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;15:680-685. doi: 10.1038/227680a0.
  17. van Brussel AAN, Planque K, Quispel A. The wall of Rhizobium leguminosarum in bacteroid and free-living forms. J Gen Microbiol. 1977;101:51-56. doi: 10.1099/00221287-101-1-51.
  18. Miroux B, Walker JE. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 1996;260(3):289-98. doi: 10.1006/jmbi.1996.0399.
  19. Cao Y, Liang Y, Tanaka K, et al. The kinase LYK5 is a major chitin receptor in Arabidopsis and forms a chitin-induced complex with related kinase CERK1. eLife. 2014;3.e03766. doi: 10.7554/elife.03766.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема генетических конструкций на основе вектора pRSETa, необходимых для синтеза внеклеточных доменов рецепторных киназ Sym10, Sym37 и K1 P. sativum (стрелкой указан сайт гидролиза для энтерокиназы, которая может быть использована для удаления His6-tag)

Скачать (95KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ содержания рекомбинантных белков Sym10-ECD и Sym37-ECD в различных субклеточных фракциях бактерий E. coli после культивирования в присутствии ИПТГ в течение 2–16 часов при температуре 28 °C: НФ1 — нерастворимая фракция, полученная при центрифугировании 10 000 g; РФ1 — растворимая фракция, полученная при центрифугировании 10 000 g; РФ2 — растворимая фракция, полученная при центрифугировании 100 000 g. Визуализацию синтезированных полипептидов проводили с помощью Вестерн-блот-гибридизации с анти-His-антителами

Скачать (65KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Очистка рекомбинантного белка-рецептора Sym10-ECD с помощью жидкостной хроматографии низкого давления: а — внеклеточный домен рецептора Sym10-ECD был наработан в клетках E. coli C41 в растворимом виде. Белок выделяли из 300 мл бактериальной культуры после индукции ИПТГ (2 часа). После посадки на Ni-CAM-колонку элюцию белков осуществляли повышающимися концентрациями имидазола — 100, 200 и 500 мМ. Максимальный выход белка наблюдали во фракции, полученной после элюции 200 мМ имидазолом (пик отмечен стрелкой); b — анализ очищенных фракций белка был проведен методом Вестерн-блот-гибридизации с анти-His-антителами. НС — несвязавшийся белок; П1, П2 — фракции 1 и 2, полученные после промывки колонки буфером; С7–С11 — фракции, полученные после смыва с колонки белка 200 мМ имидазолом (максимум содержания белка выявлен во фракции С8). Стрелкой отмечена фракция с максимальным содержанием очищенного рекомбинантного белка

Скачать (60KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Очистка рекомбинантных белков-рецепторов Sym37-ECD (a, b) и K1-ECD (c) с помощью металлохелатной аффинной хроматографии: а — неклеточный домен рецептора Sym37-ECD был наработан в клетках E. coli C41 в растворимом виде после индукции ИПТГ (2 часа). После посадки на Ni-CAM колонку элюцию белков осуществляли повышающимися концентрациями имидазола — 100, 200 и 500 мМ. Выход белка наблюдали во фракциях, полученных после элюции 100 мМ (максимум во фракции В8) и 200 мМ имидазолом (фракция С8); b — анализ очищенных фракций белка был проведен методом Вестерн-блот-гибридизации с анти-His-антителами. НС — несвязавшийся белок; П1, П2 — фракции 1 и 2, полученные после промывки колонки буфером; B5–B8 — фракции, полученные после смыва с колонки белков 100 мМ имидазолом. Стрелкой отмечена фракция В8 с максимальным содержанием белка Sym37 при смыве с колонки 100 мМ имидазолом. С8, С9 — фракции, полученные после смыва с колонки белков 200 мМ имидазолом. Стрелкой отмечена фракция С8 с максимальным содержанием белка Sym37 при смыве с колонки 200 мМ имидазолом; с — очистка рекомбинантного белка-рецептора K1-ECD методом металлохелатной аффинной хроматографии. 1 — исходный супернатант 100 000 g; 2 — несвязавшийся белок после инкубации в течение ночи с никелевыми бусами; 3 — промывка буфером TBS; 4 — смыв белка 300 мМ имидазолом

Скачать (96KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Анализ связывания внеклеточного домена рецептора K1-ECD (С) с Nod-IV, V, C18 : 4, C18 : 1, Ac проводили с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса

Скачать (110KB)
Метаданные

© Долгих Е.А., Кириенко А.Н., Ковалева О.Д., Тихонович И.А., 2017

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах