Селективная система на основе фрагментов вируса М1 для отбора трансформантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Задачей настоящей работы было получение селективной системы на основе вируса М1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Методы. Для создания штамма-реципиента фрагмент ДНК, кодирующий киллер-токсин вируса М1 под контролем регулируемого промотора гена GAL1, был встроен в геном штаммов Y-1236 и Y-2177 S. cerevisiae, чувствительных к токсинам.

Результаты. Интеграция такой экспрессионной кассеты приводит к появлению условной летальности, а именно, данные штаммы гибнут на среде с галактозой, когда происходит синтез киллер-токсина. Для трансформации полученных штаммов используется линейный фрагмент ДНК, содержащий ген интереса, фланкированный последовательностями, гомологичными промотору гена GAL1 и терминаторной области гена CYC1. При трансформации за счет гомологичной рекомбинации происходит выщепление последовательности, кодирующей киллер-токсин, и трансформанты растут на среде с галактозой.

Выводы. Предложенная селективная система сочетает в себе основные преимущества других систем: возможность применения простых сред без необходимости добавления дорогостоящих антибиотиков и наличие упрощенных методик конструирования экспрессионных кассет и отбора трансформантов.

Об авторах

Дмитрий Михайлович Музаев

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: dmmuzaev@yandex.ru

инженер

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Михайлович Румянцев

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: a.m.rumyantsev@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800
ResearcherId: N-3546-2015

канд. биол. наук, младший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Усама Раек Аль Шанаа

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»; Комиссия по атомной энергии Сирии

Email: oalshanaa@mail.ru

аспирант

Сирия, Санкт-Петербург; Дамаск, Сирия

Елена Викторовна Самбук

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: e.sambuk@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0837-0498
SPIN-код: 8281-8020
Scopus Author ID: 6603061322
ResearcherId: H-6895-2013

д-р биол. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Varela C. The impact of non-Saccharomyces yeasts in the production of alcoholic beverages. Appl Microbiol Biotechnol. 2016;100(23):9861-9874. https://doi.org/10.1007/s00253-016-7941-6.
  2. Tofalo R, Fusco V, Böhnlein C, et al. The life and times of yeasts in traditional food fermentations. Crit Rev Food Sci Nutr. 2019;26:1-30. https://doi.org/10.1080/10408398.2019.1677553.
  3. Thim L, Hansen MT, Norris K, et al. Secretion and processing of insulin precursors in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(18):6766-6770. https://doi.org/10.1073/pnas.83.18.6766.
  4. Nielsen J. Production of biopharmaceutical proteins by yeast: advances through metabolic engineering. Bioengineered. 2013;4(4):207-211. https://doi.org/10.4161/bioe.22856.
  5. Jin YS, Cate JH. Metabolic engineering of yeast for lignocellulosic biofuel production. Curr Opin Chem Biol. 2017;41:99-106. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2017.10.025.
  6. Duina AA, Miller ME, Keeney JB. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces Cerevisiae model system. Genetics. 2014;197(1):33-48. https://doi.org/10. 1534/genetics.114.163188.
  7. Sikorski RS, Hieter P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 1989;122(1):19-27.
  8. Berlec A, Strukelj B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 2013;40(3-4):257-274. https://doi.org/10.1007/s10295-013-1235-0.
  9. Падкина М.В., Самбук Е.В. Генетически модифицированные микроорганизмы-продуценты биологически активных соединений // Экологическая генетика. – 2015. – Т. 13. – № 2. – С. 36–57. [Padkina MV, Sambuk EV. Genetically modified microorganisms as producers of biologically active compounds. Ecological genetics. 2015;13(2):36-57. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/ecogen13236-57.
  10. Землянко О.М., Рогоза Т.М., Журавлева Г.А. Механизмы множественной устойчивости бактерий к антибиотикам // Экологическая генетика. – 2018. – Т. 16. – № 3. – С. 4–17. [Zemlyanko OM, Rogoza TM, Zhouravleva GA. Mechanisms of bacterial multiresistance to antibiotics. Ecological genetics. 2018;16(3):4-17. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/ecogen1634-17.
  11. Magliani W, Conti S, Gerloni M, et al. Yeast killer systems. Clin Microbiol Rev. 1997;10(3):369-400. https://doi.org/10.1128/cmr.10.3.369.
  12. Hatoum R, Labrie S, Fliss I. Antimicrobial and probiotic properties of yeasts: from fundamental to novel applications. Front Microbiol. 2012;3:421. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00421.
  13. Belda I, Ruiz J, Alonso A, et al. The biology of pichia membranifaciens killer toxins. Toxins (Basel). 2017;9(4). pii: E112. https://doi.org/10.3390/toxins9040112.
  14. Zhu H, Bussey H. Mutational analysis of the functional domains of yeast K1 killer toxin. Mol Cell Biol. 1991;11(1):175-181. https://doi.org/10.1128/mcb.11.1.175.
  15. Schmitt MJ, Tipper DJ. Sequence of the M28 dsRNA: preprotoxin is processed to an alpha/beta heterodimeric protein toxin. Virology. 1995;213(2):341-351. https://doi.org/10.1006/viro.1995.0007.
  16. Самбук Е.В., Музаев Д.М., Румянцев А.М., Падкина М.В. Киллер-токсины дрожжей Saccharomyces cerevisiae: синтез, механизмы действия и практическое использование // Экологическая генетика. – 2019. – Т. 17. – № 3. – С. 59–73. [Sambuk EV, Muzaev DM, Rumjanzev AM, Padkina MV. Saccharomyces cerevisiae killer toxins: synthesis, mechanisms of action and practical use. Ecological genetics. 2019;17(3):59-73. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17816/ecogen17359-73.
  17. Bussey H, Saville D, Greene D, et al. Secretion of Saccharomyces cerevisiae killer toxin: processing of the glycosylated precursor. Mol Cell Biol. 1983;3(8):1362-1370. https://doi.org/10.1128/mcb.3.8.1362.
  18. Bussey H, Sherman D. Yeast killer factor: ATP leakage and coordinate inhibition of macromolecular synthesis in sensitive cells. Biochim Biophys Acta. 1973;298(4):868-875. https://doi.org/10.1016/0005-2736(73)90391-X.
  19. Eisfeld K, Riffer F, Mentges J, Schmitt MJ. Endocytotic uptake and retrograde transport of a virally encoded killer toxin in yeast. Mol Microbiol. 2000;37(4):926-940. https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2000.02063.x.
  20. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). – М.: Наука, 1981. – 288 с. [Osterman LA. Methods of protein and nucleic acid research. Springer; 1984. 288 p. (In Russ.)]. https://doi.org/10.1007/978-3-642-87485-7.
  21. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 1983;166(4):557-580. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(83)80284-8.
  22. Wu S, Letchworth GJ. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol. Biotechniques. 2004;36(1):152-154. https://doi.org/10.2144/04361dd02.
  23. Guthrie C, Fink GR. Guide to yeast genetics and molecular biology. Methods Enzymol. 1991;194:1-863. https://doi.org/10.1016/s0076- 6879(00)x0276-5.
  24. Gier S, Schmitt MJ, Breinig F. Expression of K1 toxin derivatives in Saccharomyces cerevisiae mimics treatment with exogenous toxin and provides a useful tool for elucidating K1 mechanisms of action and immunity. Toxins (Basel). 2017;9(11). pii: E345. https://doi.org/10.3390/toxins9110345.
  25. Botstein D, Fink GR. Yeast: an experimental organism for modern biology. Science. 1988;240(4858):1439-1443. https://doi.org/ 10.1126/science.3287619.
  26. Duina AA, Miller ME, Keeney JB. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 2014;197(1):33-48. https://doi.org/10.1534/genetics.114.163188.
  27. Tian Z, Liu R, Zhang H, et al. Developmental dynamics of antibiotic resistome in aerobic biofilm microbiota treating wastewater under stepwise increasing tigecycline concentrations. Environ Int. 2019;131:105008. https://doi.org/10.1016/j.envint.2019.105008.
  28. Baquero F, Martínez JL, Cantón R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments. Curr Opin Biotechnol. 2008;19(3):260-265. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2008.05.006.
  29. Tuller T, Girshovich Y, Sella Y, et al. Association between translation efficiency and horizontal gene transfer within microbial communities. Nucleic Acids Res. 2011;39(11):4743-4755. https://doi.org/10.1093/nar/gkr054.
  30. Terrinoni M, Nordqvist SL, Källgård S, et al. A novel nonantibiotic, lgt-based selection system for stable maintenance of expression vectors in Escherichia coli and Vibrio cholerae. Appl Environ Microbiol. 2018;84(4). pii: e02143-2117. https://doi.org/10.1128/AEM.02143-17.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема получения штаммов дрожжей S. cerevisiae с делециями в генах LEU2 и URA3: а — структура плазмиды pAL2T-delleu2; b — cхема получения ауксотрофного штамма 1-Y-1236 (Δleu2) при помощи системы FLP-FRT рекомбинации (штаммы 2-Y-1236 (Δura3), 1-Y-2177 (Δleu2) и 2-Y-2177 (Δura3) получали аналогично). Штаммы с двумя ауксотрофностями по лейцину и урацилу 3-Y-1236 (Δleu2 Δura3) и 3-Y-2177 (Δleu2 Δura3) получали путем использования штаммов с одиночной ауксотрофностью в качестве исходных

Скачать (233KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема интеграции последовательности токсина вируса M1 в геном штаммов дрожжей S. cerevisiae и ее применения в качестве селективного маркера: a — структура плазмиды pAL2-T-PGAL1-αTOX; b —схема получения штаммов 4-Y-1236 (LEU2-PGAL1-toxM1 Δura3) и 4-Y-2177 (LEU2-PGAL1-toxM1 Δura3), в геном которых была интегрирована последовательность ДНК-токсина вируса M1 под контролем регулируемого промотора гена GAL1; с — схема интеграции гена GFP, фланкированного последовательностями, гомологичными промотору гена GAL1 и терминаторной области гена CYC1

Скачать (239KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Фенотипы штаммов 3-Y-1236 (Δleu2 pYES2-M1) и 3-Y-1236 (Δleu2 pYES2-M28) на среде с газонами контрольных штаммов 3-Y-1236 (Δleu2 pYES2) и 3-Y-2177 (Δleu2 pYES2). Зона подавления возникает в результате действия киллер-токсинов

Скачать (172KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Рост штаммов 4-Y-1236 (LEU2-PGAL1-toxM1 Δura3) и 4-Y-2177 (LEU2-PGAL1-toxM1 Δura3), в геномы которых была интегрирована последовательность ДНК токсина вируса M1 под контролем регулируемого промотора гена GAL1, на средах с глюкозой и галактозой. Штаммы характеризуются условной летальностью — они не растут на средах с галактозой, поскольку в этих условиях в их клетках происходит синтез токсина. Высевали по 10 мкл суспензии 104 и 103 кл/мл

Скачать (114KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Проверка наличия интеграции гена GFP в геном трансформантов: a — результаты ПЦР с праймерами expαTOX-BHI-F и GFP-R и геномной ДНК штаммов: 1) 4-Y-2177; 3) 4-Y-2177 с интеграцией гена GFP, клон 1; 4) 4-Y-2177 с интеграцией гена GFP, клон 2. Размеры фрагментов соответствуют теоретически ожидаемому — 1343 п. о.; 2) маркер длин ДНК 1 kb (Евроген). b — схема расположения праймеров expαTOX-BHI-F и GFP-R; с — флуоресценция клеток исходного штамма 4-Y-2177 и штамма, трансформированного фрагментом GFP (клон 2)

Скачать (184KB)
Метаданные
7. Карта плазмиды pPICZ-FLP:

Скачать (162KB)
Метаданные

© Музаев Д.М., Румянцев А.М., Аль Шанаа У.Р., Самбук Е.В., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах