Технические аспекты проведения этапа электрофореза в методе ДНК-комет

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Причины меж- и внутрилабораторной вариабельности данных, полученных в исследованиях методом ДНК-комет, на сегодняшний день не до конца ясны. Гель-электрофорез является определяющим этапом при использовании метода анализа поврежденности ДНК единичных клеток. В настоящей работе проведена сравнительная оценка расчетной и фактической напряженности электрического поля в пяти различных электрофоретических камерах и вклада выявляемых различий в вариабельность оцениваемой поврежденности ДНК. Только для одной камеры измеренная напряженность совпала с расчетной — 1 В/см, тогда как для четырех варьировала от 0,6 до 2,0 В/см. Оцененные в одних и тех же образцах клеток почек мышей значения поврежденности ДНК различались между камерами до 4,7 крат для индуцированной и до 10 крат для спонтанной поврежденности ДНК. Выявлена высокая локальная вариация напряженности электрического поля и температуры раствора по площадке камер и вариабельность поврежденности ДНК в идентичных образцах клеток в условиях одного электрофореза. Таким образом, несоответствие при электрофорезе расчетной (теоретической) и фактической напряженности электрического поля может служить причиной межлабораторной вариабельности данных метода ДНК-комет. Рециркуляция раствора в ходе электрофореза позволяет значимо снизить внутриэкспериментальную и внутрилабораторную вариабельность результатов.

Об авторах

Алий Курманович Жанатаев

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: zhanataev@academpharm.ru
ORCID iD: 0000-0002-7673-8672
SPIN-код: 7070-0510
Scopus Author ID: 6506103462

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория фармакологии мутагенеза

Россия, Москва

Елена Александровна Анисина

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»

Email: anisinalena@yandex.ru

научный сотрудник, лаборатория фармакологии мутагенеза

Россия, Москва

Кира Львовна Плигина

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»

Email: kira-pligina@rambler.ru
SPIN-код: 7315-5417

канд. биол. наук, научный сотрудник, лаборатория фармакологии мутагенеза

Россия, Москва

Артем Андреевич Лисицын

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»

Email: nordikal@yandex.ru

лаборант-исследователь, лаборатория фармакологии мутагенеза

Россия, Москва

Андрей Дмитриевич Дурнев

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»

Email: addurnev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0218-8580
SPIN-код: 8426-0380
Scopus Author ID: 7006060753

д-р мед. наук, профессор, чл.-кор. РАН, директор

Россия, Москва

Список литературы

  1. Koppen G, Azqueta A, Pourrut B, et al. The next three decades of the comet assay: a report of the 11th international comet assay workshop. Mutagenesis. 2017;32(3):397-408. https://doi.org/10.1093/mutage/gex002.
  2. Møller P. The comet assay: ready for 30 more years. Mutagenesis. 2018;33(1):1-7. https://doi.org/10.1093/mutage/gex046.
  3. Azqueta A, Gutzkow KB, Brunborg G, Collins AR. Towards a more reliable comet assay: optimizing agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 2011;724(1-2):41-45. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2011.05.010.
  4. Azqueta A, Muruzabal D, Boutet-Robinet E, et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res. 2019;843:24-32. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2019.04.007.
  5. Forchhammer L, Johansson C, Loft S, et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 2010;25(2):113-123. https://doi.org/10.1093/mutage/gep048.
  6. Johansson C, Møller P, Forchhammer L, et al. An ECVAG trial on assessment of oxidative damage to DNA measured by the comet assay. Mutagenesis. 2010;25(2):125-132. https://doi.org/10.1093/mutage/gep055.
  7. Ersson C, Möller L. The effects on DNA migration of altering parameters in the comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments. Mutagenesis. 2011;26(6):689-695. https://doi.org/10.1093/mutage/ger034.
  8. Speit G, Trenz K, Schütz P, et al. The influence of temperature during alkaline treatment and electrophoresis on results obtained with the comet assay. Toxicol Lett. 1999;110(1-2):73-78. https://doi.org/10.1016/S0378-4274(99)00137-X.
  9. Sirota NP, Zhanataev AK, Kuznetsova EA, et al. Some causes of inter-laboratory variation in the results of comet assay. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2014;770:16-22. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2014.05.003.
  10. Møller P, Möller L, Godschalk RW, Jones GD. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay validation group. Mutagenesis. 2010;25(2):109-111. https://doi.org/10.1093/mutage/gep067.
  11. Godschalk RW, Ersson C, Riso P, et al. DNA-repair measurements by use of the modified comet assay: an inter-laboratory comparison within the European Comet Assay validation group (ECVAG). Mutat Res. 2013;757(1):60-67. https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2013.06.020.
  12. Ersson C, Møller P, Forchhammer L, et al. An ECVAG inter-laboratory validation study of the comet assay: inter-laboratory and intra-laboratory variations of DNA strand breaks and FPG-sensitive sites in human mononuclear cells. Mutagenesis. 2013;28(3):279-286. https://doi.org/10.1093/mutage/get001.
  13. Plappert-Helbig U, Guérard M. Inter-laboratory comparison of the in vivo comet assay including three image analysis systems. Environ Mol Mutagen. 2015;56(9):788-793. https://doi.org/10.1002/em.21964.
  14. Olive PL, Wlodek D, Durand RE, Banáth JP. Factors influencing DNA migration from individual cells subjected to gel electrophoresis. Exp Cell Res. 1992;198(2):259-267. https://doi.org/10.1016/0014-4827(92)90378-l.
  15. Brunborg G, Rolstadaas L, Gutzkow KB. Electrophoresis in the comet assay. (September 12th 2018). In: Bolduna OM, Balta C, eds. Electrophoresis – Life Sciences Practical Applications. London: Intech Open; 2018. Р. 63-80. https://doi.org/10.5772/intechopen.76880.
  16. Sambrook J, Russel DW. Molecular cloning – a laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
  17. Olive PL, Banáth JP. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 2006;1(1):23-29. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.5.
  18. OECD. Test No. 489: In vivo mammalian alkaline comet assay [Internet]. Paris: OECD Publishing; 2016. Available from: https://www.oecd.org/env/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay-9789264264885-en.htm.
  19. Gutzkow KB, Langleite TM, Meier S, et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 2013;28(3):333-340. https://doi.org/10.1093/mutage/get012.
  20. Tice RR, Agurell E, Anderson D, et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 2000;35(3):206-221. https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:33.0.CO;2-J.
  21. Collins AR, Oscoz AA, Brunborg G, et al. The comet assay: topical issues. Mutagenesis. 2008;23(3):143-151. https://doi.org/10.1093/mutage/gem051.
  22. Collins AR, El Yamani N, Lorenzo Y, et al. Controlling variation in the comet assay. Front Genet. 2014;5:359. https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00359.
  23. Roy M, Hamel A, Cardoso R. Effect of slide positioning in electrophoresis chamber over comet assay results [Internet]. Charles River Laboratories, Senneville, Quebec, Canada, H9X 3R3. Available from: https://www.criver.com/sites/default/files/resources/EffectofSlidePositioninginElectrophoresisChamberOverCometAssayResults.pdf.
  24. Brody JR, Kern SE. Sodium boric acid: a tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. Biotechniques. 2004;36(2):214-216. https://doi.org/10.2144/04362BM02.
  25. O’Conner JL, Wade MF, Zhou Y. Control of buffer pH during agarose gel electrophoresis of glyoxylated RNA. Biotechniques. 1991;10(3):300-302.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Геометрические параметры камер, расположение слайдов с клетками на площадке и участки (обозначены цифрами 1–12) определения локальной напряженности электрического поля и температуры электрофорезного раствора в камерах CSL-COM40, Sub-Cell 192 и multiSUB Screen 32. М — межэлектродное расстояние; В — высота, Д — длина, Ш — ширина площадки камер

Скачать (70KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Камера COMPAC-50 с вертикальной ориентацией слайдов. 1–9 — участки определения напряженности электрического поля. М — межэлектродное расстояние; В — высота раствора для электрофореза, Д — длина, Ш — ширина резервуара камеры

Скачать (198KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Морфология ДНК-комет в зависимости от напряженности электрического поля (А, Б, В и Г; электрофорез 20 мин) и при увеличении скорости рециркуляции в 2 раза (Д и Е; камера multiSUB Screen 32). Шкала — 50 мкм

Скачать (193KB)
Метаданные

© Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Плигина К.Л., Лисицын А.А., Дурнев А.Д., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах