Синтез флуоресцентного РНК-аптамерa Broccoli в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Актуальность. РНК-аптамеры — это короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, которые могут связываться с молекулами-мишенями с высокой специфичностью и аффинностью. Такие мишени очень разнообразны и могут представлять собой как отдельные ионы, так и целые клетки. РНК-аптамеры широко применяются в биологии и медицине для проведения фундаментальных исследований, а также в практических целях, в терапии и диагностике. В настоящее время, для получения аптамеров РНК в основном используются методы химического синтеза или синтеза in vitro. Однако эти методы являются дорогими, трудоемкими и малопродуктивными. Поэтому методы синтеза in vivo становятся все более привлекательными для ученых, работающих над оптимизацией производства аптамеров.

Цель данной работы — разработка репортерной системы для оптимизации синтеза малых молекул РНК в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Материалы и методы. Флуоресцентный РНК-аптамер Broccoli был использован для получения репортерной системы, позволяющей оптимизировать условия синтеза коротких РНК in vivo в клетках дрожжей. Этот аптамер имеет размер около 112 п.н. и связывается с флуоресцентным красителем DFHBI-1T. Отдельно от аптамера краситель практически не светится. При связывании его с аптамером и облучении светом с длиной волны 482 нм наблюдается эмиссия поглощенного излучения с пиком при 505 нм.

Результаты. Получена репортерная система, обеспечивающая синтез флуоресцентного РНК-аптамера Broccoli в клетках дрожжей S. cerevisiae. Транскрипция молекул РНК, содержащих аптамер, обеспечивается за счет регулируемого промотора гена GAL1. В синтезируемом транскрипте содержатся рибозимы HH и HDV, которые обеспечивают вырезание последовательности РНК-аптамера.

Выводы. Репортерная система на основе РНК-аптамера Broccoli может быть использована для оптимизации синтеза РНК-аптамеров in vivo в клетках дрожжей S. cerevisiae. Это является актуальной задачей в связи с активным применением таких аптамеров в научных исследованиях, биотехнологии и медицине.

Об авторах

Усама Аль Шанаа

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: st072427@student.spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1462-1687
SPIN-код: 7453-9258

мл. научн. сотр. кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Михайлович Румянцев

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

канд. биол. наук, мл. научн. сотр. кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Елена Викторовна Самбук

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: e.sambuk@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0837-0498
SPIN-код: 8281-8020
Scopus Author ID: 6603061322

д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Марина Владимировна Падкина

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: m.padkina@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-код: 7709-0449
Scopus Author ID: 6602596755

д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Barnett J.A. A history of research on yeasts 10: foundations of yeast genetics // Yeast. 2007. Vol. 24, No. 10. P. 799–845. doi: 10.1002/yea.1513
  2. Botstein D., Fink G.R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology // Genetics. 2011. Vol. 189, No. 3. P. 695–704. doi: 10.1534/genetics.111.130765
  3. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., et al. Life with 6000 Genes // Science. 1996. Vol. 274, No. 5287. P. 546–567. doi: 10.1126/science.274.5287.546
  4. Karathia H., Vilaprinyo E., Sorribas A., Alves R. Saccharomyces cerevisiae as a model organism: a comparative study // PLoS One. 2011. Vol. 6, No. 2. ID e16015. doi: 10.1371/journal.pone.0016015
  5. Bolotin-Fukuhara M., Dumas B., Gaillardin C. Yeasts as a model for human diseases // FEMS Yeast Research. 2010. Vol. 10, No. 8. P. 959–960. doi: 10.1111/j.1567-1364.2010.00693.x
  6. Guthrie C., Fink G.R. Guide to yeast genetics and molecular biology. Academic Press, Cambridge, 1991. 194 p.
  7. Pronk J.T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research // Appl Environ Microbiol. 2002. Vol. 68, No. 5. P. 2095–2100. doi: 10.1128/AEM.68.5.2095-2100.2002
  8. Lohr D., Venkov P., Zlatanova J. Transcriptional regulation in the yeast GAL gene family: a complex genetic network // FASEB J. 1995. Vol. 9, No. 9. P. 777–787. doi: 10.1096/fasebj.9.9.7601342
  9. Nielsen J. Yeast systems biology: model organism and cell factory // Biotechnol J. 2019. Vol. 14, No. 9. ID e1800421. doi: 10.1002/biot.201800421
  10. Macreadie I., Dhakal S. “The awesome power of yeast” // Microbiology Australia. 2022. Vol. 43, No. 1. P. 19–21. doi: 10.1071/ma22007
  11. Szczebara F.M., Chandelier C., Villeret C., et al. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast // Nat Biotechnol. 2003. Vol. 21, No. 2. P. 143–149. doi: 10.1038/nbt775
  12. Paddon C.J., Westfall P.J., Pitera D.J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin // Nature. 2013. Vol. 496, No. 7446. P. 528–532. doi: 10.1038/nature12051
  13. Klussmann S. The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides And Their Applications // John Wiley & Sons. 2006. 500 p. doi: 10.1002/3527608192
  14. Lee J.F. Aptamer Database // Nucleic Acids Research. 2004. Vol. 32, No. S1. P. 95D–D100. doi: 10.1093/nar/gkh094
  15. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. 1990. Vol. 346. P. 818–822. doi: 10.1038/346818a0
  16. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990. Vol. 249, No. 4968. P. 505–510. doi: 10.1126/science.2200121
  17. Filonov G.S., Moon J.D., Svensen N., Jaffrey S.R. Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution // J Am Chem Soc. 2014. Vol. 136, No. 46. P. 16299–16308. doi: 10.1021/ja508478x
  18. Paige J.S., Wu K.Y., Jaffrey S.R. RNA Mimics of Green Fluorescent Protein // Science. 2011. Vol. 333, No. 6042. P. 642–646. doi: 10.1126/science.1207339
  19. Filonov G.S., Kam C.W., Song W., Jaffrey S.R. In-gel imaging of RNA processing using broccoli reveals optimal aptamer expression strategies // Chem Biol. 2015. Vol. 22, No. 5. P. 649–660. doi: 10.1016/j.chembiol.2015.04.018
  20. Song W., Strack R.L., Jaffrey S.R. Imaging bacterial protein expression using genetically encoded RNA sensors // Nat Methods. 2013. Vol. 10, No. 9. P. 873–875. doi: 10.1038/nmeth.2568
  21. McConnell E.M., Nguyen J., Li Y. Aptamer-based biosensors for environmental monitoring // Front Chem. 2020. Vol. 8. ID434. doi: 10.3389/fchem.2020.00434
  22. Wiedman G.R., Zhao Y., Mustaev A., et al. An Aptamer-based biosensor for the azole class of antifungal drugs // mSphere. 2017. Vol. 2, No. 4. ID e00274–17. doi: 10.1128/mSphere.00274-17.
  23. Wu S., Zhang H., Shi Z., et al. Aptamer-based fluorescence biosensor for chloramphenicol determination using upconversion nanoparticles // Food Control. 2015. Vol. 50. P. 597–604. doi: 10.1016/j.foodcont.2014.10.003
  24. Eissa S., Zourob M. In vitro selection of DNA aptamers targeting β-lactoglobulin and their integration in graphene-based biosensor for the detection of milk allergen // Biosens Bioelectron. 2017. Vol. 91. P. 169–174. doi: 10.1016/j.bios.2016.12.020
  25. Yang Y.B., Yang X.D., Zou X.M., et al. Ultrafine graphene nanomesh with large on/off ratio for high-performance flexible biosensors // Adv Funct Mater. 2017. Vol. 27, No. 19. ID 1604096. doi: 10.1002/adfm.201604096
  26. Alizadeh N., Memar M.Y., Moaddab S.R., Kafil H.S. Aptamer-assisted novel technologies for detecting bacterial pathogens // Biomed Pharmacother. 2017. Vol. 93. P. 737–745. doi: 10.1016/j.biopha.2017.07.011
  27. Hoffmann S., Hoos J., Klussmann S., Vonhoff S. RNA aptamers and spiegelmers: synthesis, purification, and post-synthetic PEG conjugation // Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2011. Vol. 4. doi: 10.1002/0471142700.nc0446s46
  28. Kartje Z.J., Janis H.I., Mukhopadhyay S., Gagnon K.T. Revisiting T7 RNA polymerase transcription in vitro with the Broccoli RNA aptamer as a simplified real-time fluorescent reporter // J Biol Chem. 2021. Vol. 296. ID100175. doi: 10.1074/jbc.RA120.014553
  29. Duman-Scheel M. Saccharomyces cerevisiae (Baker’s Yeast) as an interfering RNA expression and delivery system // Curr Drug Targets. 2019. Vol. 20, No. 9. P. 942–952. doi: 10.2174/1389450120666181126123538
  30. Garrait G., Jarrige J.F., Blanquet-Diot S., Alric M. Genetically engineered yeasts as a new delivery vehicle of active compounds to the digestive tract: in vivo validation of the concept in the rat // Metab Eng. 2009. Vol. 11, No. 3. P. 148–154. doi: 10.1016/j.ymben.2009.01.001
  31. Phelps M.P., Seeb L.W., Seeb J.E. Transforming ecology and conservation biology through genome editing // Conserv Biol. 2020. Vol. 34, No. 1. P. 54–65. doi: 10.1111/cobi.13292
  32. Juergens H., Varela J.A., Gorter de Vries A.R., et al. Genome editing in Kluyveromyces and Ogataea yeasts using a broad-host-range Cas9/gRNA co-expression plasmid // FEMS Yeast Res. 2018. Vol. 18, No. 3. ID foy012. doi: 10.1093/femsyr/foy012
  33. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J Mol Biol. 1983. Vol. 166, No. 4. P. 557–580. doi: 10.1016/S0022-2836(83)80284-8
  34. Meilhoc E., Teissie J. Electrotransformation of Saccharomyces cerevisiae // Methods Mol Biol. 2020. Vol. 2050. P. 187–193. doi: 10.1007/978-1-4939-9740-4_21
  35. Filonov G.S., Jaffrey S.R. RNA Imaging with dimeric Broccoli in live bacterial and mammalian cells // Curr Protoc Chem Biol. 2016. Vol. 8, No. 1. P. 1–28. doi: 10.1002/9780470559277.ch150174
  36. Nelissen F.H., Leunissen E.H., van de Laar L., et al. Fast production of homogeneous recombinant RNA — towards large-scale production of RNA // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, No. 13. P. e102. doi: 10.1093/nar/gks292

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема репортерной конструкции, содержащей тандемный аптамер Broccoli, рибозимы Hammerhead (HH), Hepatitis Delta Virus (HDV) и сайты рестрикции (HindIII и XhoI) (a); вторичная структура основной части конструкции, демонстрирующая правильную укладку рибозима HH за счет добавленных в последовательность комплементарных участков (плеч гомологии) (b)

Скачать (124KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Общая схема конструирования плазмиды pYES2x2Broccoli. Указаны: элементы репортерной конструкции [красным — рибозимы типов Hammerhead (HH) и Hepatitis Delta Virus (HDV), зеленым — тандемный повтор аптамера Broccoli]; элементы, необходимые для поддержания плазмид в бактериях (серым — бактериальный ориджин репликации ori и ген устойчивости к ампициллину AmpR); элементы, необходимые для поддержания плазмид в клетках дрожжей и экспрессии репортерной конструкции (синим — промотор PGAL, терминатор CYC1, селективный маркер — ген URA3, ориджин репликации 2m ori)

Скачать (202KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофореграммы результатов ПЦР-амплификации фрагментов экспрессионной кассеты в составе плазмиды pYES2x2Broccoli (a–c) и рестрикционного анализа (d): a, дорожка 1 — промотор гена GAL1, амплифицированный с использованием специфических праймеров PGAL-F и PGAL-R (530 п.н.); b, дорожка 1 — тандемный повтор x2Broccoli (292 п.н.), амплифицированный с использованием праймеров Broccoli 2F и Broccoli 2R; с, дорожка 2 — полноразмерная кассета экспрессии (1167 п.н.), включающая промотор гена GAL1, аптамеры Broccoli, рибозимы HH и HDV и терминатор CYC1, амплифицированая с использованием праймеров PGAL-F и CYC1-R; d, дорожка 3 — результаты рестрикционного анализа плазмиды pYES2x2Broccoli, имеющей два сайта рестрикции BglI (один сайт в конструкции экспрессионной кассеты, а другой вне ее), в результате которого наблюдается два фрагмента ДНК: 1510 и 4658 п.н. Использовали маркеры размерами ДНК 100 п.н. и 1 т.п.н. (Евроген). Размеры полученных фрагментов соответствуют теоретически ожидаемым

Скачать (101KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Средние значения флуоресценции (при длине волны 520 нм) суспензий клеток дрожжей S. cerevisiae, инкубированных в средах с глюкозой и галактозой. Измерения проводили в четырех повторностях. Указан 95 % доверительный интервал

Скачать (55KB)
Метаданные
6. Последовательность экспрессионной кассеты в составе плазмиды pYES2x2Broccoli

Скачать (597KB)
Метаданные

© Шанаа У.А., Румянцев А.М., Самбук Е.В., Падкина М.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах