Искусственная активация экспрессии nif-генов у клубеньковых бактерий Ex Planta

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Исследована возможность модификации регуляции азотфиксации у клубеньковых бактерий Mesorhizobium, Ensifer и Rhizobium путем привнесения в их геном дополнительной копии гена nifA под регуляцией бактериальных индуцируемых промоторов. Показано, что экспрессия nifA в рекомбинантных клетках всех трех родов бактерий приводит к появлению незначительной нитрогеназной активности. При этом уровень нитрогеназной активности не имеет явной корреляции с уровнем экспрессии привнесенного гена nifA, что, скорее всего, является следствием многоуровневости регуляции азотфиксации. Наиболее интересны результаты, полученные с рекомбинантным штаммом Ensifer sp. Mlu10PmNifA, который продемонстрировал нитрогеназную активность при свободноживущем состоянии, в несколько раз превышающую таковую у контрольного свободноживущего азотфиксирующего штамма Pseudomonas sp. K749. При этом штаммом была утеряна способность к клубенькообразованию, а также у рекомбинантных бактерий наряду с нитрогеназной выявлена нитраредуктазная активность.

Об авторах

Андрей Ханифович Баймиев

Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: baymiev@anrb.ru
ORCID iD: 0000-0001-6637-9365
SPIN-код: 1919-5236
ResearcherId: R-9219-2016

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов

Россия, 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

Роман Сергеевич Гуменко

Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» Российской академии наук

Email: r.gumenko@yandex.ru

младший научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов

Россия, 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

Анастасия Андреевна Владимирова

Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» Российской академии наук

Email: vladimirovaw@bk.ru

аспирант лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов

Россия, 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

Екатерина Сергеевна Акимова

Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» Российской академии наук

Email: iv.katerina-bio@yandex.ru

канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов

Россия, 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

Зиля Рифовна Вершинина

Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» Российской академии наук

Email: zilyaver@mail.ru

канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений и микроорганизмов

Россия, 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

Алексей Ханифович Баймиев

Институт биохимии и генетики — обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр» Российской академии наук

Email: baymiev@mail.ru

д-р биол. наук, заведующий лабораторией биоинженерии растений и микроорганизмов

Россия, 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

Список литературы

  1. Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Генетические основы эволюции растительно-микробного симбиоза. – СПб.: Информ-Навигатор, 2012. [Provorov NA, Vorob’ev NI. Geneticheskie osnovy evolyutsii rastitel’no-mikrobnogo simbioza. Saint Petersburg: Inform-Navigator; 2012. (In Russ.)]
  2. Dludlu MN, Chimphango SBM, Walker G, et al. Horizontal gene transfer among Rhizobia of the Core Cape Subregion of Southern Africa. S Afr J Bot. 2018;118:342-52. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2018.02.406.
  3. Andrews M, De Meyer S, James EK, et al. Horizontal transfer of symbiosis genes within and between Rhizobial Genera: Occurrence and Importance. Genes (Basel). 2018;9(7). https://doi.org/10.3390/genes9070321.
  4. Ling J, Wang H, Wu P, et al. Plant nodulation inducers enhance horizontal gene transfer of Azorhizobium caulinodans symbiosis island. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(48):13875-13880. https://doi.org/10.1073/pnas.1615121113.
  5. Dixon R, Kahn D. Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nat Rev Microbiol. 2004;2(8):621-31. https://doi.org/10.1038/nrmicro954.
  6. Kennedy C, Robson RL. Activation of nif gene expression in Azotobacter by the nifA gene product of Klebsiella pneumoniae. Nature. 1983;301(5901):626-628. https://doi.org/10.1038/301626a0.
  7. Kim Y-M, Hidaka M, Masaki H, et al. Constitutive expression of nitrogenase system in Klebsiella oxytoca by gene targeting mutation to the chromosomal nifLA operon. J Biotechnol. 1989;10(3-4):293-301. https://doi.org/10.1016/0168-1656(89)90073-4.
  8. An Q, Dong Y, Wang W, et al. Constitutive expression of the nifA gene activates associative nitrogen fixation of Enterobacter gergoviae 57-7, an opportunistic endophytic diazotroph. J Appl Microbiol. 2007;103(3):613-620. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03289.x.
  9. Chabot R, Antoun H, Kloepper JW, Beauchamp CJ. Root colonization of maize and lettuce by bioluminescent Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli. Appl Environ Microbiol. 1996;62(8):2767-2772.
  10. Chao WL. Antagonistic activity of Rhizobium spp. against beneficial and plant pathogenic fungi. Lett Appl Microbiol. 1990;10(5):213-215. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.1990.tb01336.x.
  11. Blatny JM, Brautaset T, Winther-Larsen HC, et al. Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria. Plasmid. 1997;38(1):35-51. https://doi.org/10.1006/plas.1997.1294.
  12. Sletta H, Nedal A, Aune TE, et al. Broad-host-range plasmid pJB658 can be used for industrial-level production of a secreted host-toxic single-chain antibody fragment in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2004;70(12):7033-7039. https://doi.org/10.1128/AEM.70.12.7033-7039.2004.
  13. Lin JJ. Electrotransformation of Agrobacterium. In: Methods in molecular biology. Totowa: Humana Press; 1995. P. 171-178.
  14. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76(9):4350-4354. https://doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350.
  15. Mongiardini EJ, Ausmees N, Perez-Gimenez J, et al. The Rhizobial adhesion protein RapA1 is involved in adsorption of Rhizobia to plant roots but not in nodulation. FEMS Microbiol Ecol. 2008;65(2):279-288. https://doi.org/10.1111/j.1574-6941.2008.00467.x.
  16. Tsoy OV, Ravcheev DA, Cuklina J, Gelfand MS. Nitrogen fixation and molecular oxygen: comparative genomic reconstruction of transcription regulation in Alphaproteobacteria. Front Microbiol. 2016;7:1343. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01343.
  17. González-Pérez MM, Marqués S, Domínguez-Cuevas P, Ramos JL. XylS activator and RNA polymerase binding sites at the Pm promoter overlap. FEBS Letters. 2002;519(1-3):117-122. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(02)02730-8.
  18. Brautaset T, Lale R, Valla S. Positively regulated bacterial expression systems. Microb Biotechnol. 2009;2(1):15-30. https://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2008.00048.x.
  19. Sullivan JT, Trzebiatowski JR, Cruickshank RW, et al. Comparative sequence analysis of the symbiosis island of Mesorhizobium loti strain R7A. J Bacteriol. 2002;184(11):3086-3095. https://doi.org/10.1128/jb.184.11.3086-3095.2002.
  20. Sullivan JT, Brown SD, Ronson CW. The NifA-RpoN regulon of Mesorhizobium loti strain R7A and its symbiotic activation by a novel LacI/GalR-family regulator. PLoS One. 2013;8(1): e53762. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053762.
  21. Gamez-Reyes A, Becerra-Lobato N, Ramírez-Trujillo JA, et al. The Rhizobium leucaenae CFN299 pSym plasmid contains genes expressed in free life and symbiosis, as well as two replication systems. Ann Microbiol. 2017;67(3): 263-73. https://doi.org/10.1007/s13213-017-1257-3.
  22. Nukui N, Minamisawa K, Ayabe S, Aoki T. Expression of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase gene requires symbiotic nitrogen-fixing regulator gene nifA2 in Mesorhizobium loti MAFF303099. Appl Environ Microbiol. 2006;72(7):4964-4969. https://doi.org/10.1128/AEM.02745-05.
  23. Oelze J. Respiratory protection of nitrogenase in Azotobacter species: is a widely held hypothesis unequivocally supported by experimental evidence? FEMS Microbiol Rev. 2000;24(4):321-333. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2000.tb00545.x.
  24. Boyd ES, Costas AM, Hamilton TL, et al. Evolution of molybdenum nitrogenase during the transition from anaerobic to aerobic metabolism. J Bacteriol. 2015;197(9):1690-9. https://doi.org/10.1128/JB.02611-14.
  25. Boyd ES, Peters JW. New insights into the evolutionary history of biological nitrogen fixation. Front Microbiol. 2013;4:201. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00201.
  26. Torres MJ, Rubia MI, de la Pena TC, et al. Genetic basis for denitrification in Ensifer meliloti. BMC Microbiol. 2014;14:142. https://doi.org/10.1186/1471-2180-14-142.
  27. Bobik C, Meilhoc E, Batut J. FixJ: a major regulator of the oxygen limitation response and late symbiotic functions of Sinorhizobium meliloti. J Bacteriol. 2006;188(13): 4890-4902. https://doi.org/10.1128/JB.00251-06.
  28. Cabeza R, Koester B, Liese R, et al. An RNA sequencing transcriptome analysis reveals novel insights into molecular aspects of the nitrate impact on the nodule activity of Medicago truncatula. Plant Physiol. 2014;164(1):400-411. https://doi.org/10.1104/pp.113.228312.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Стратегия клонирования генов nifA в плазмиду pJB658

Скачать (122KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ нитрогеназной активности бактерий. 1 — Rhizobium sp.VSy9PmNifA; 2 — Mesorhizobium sp. LZh7PmNifA; 3 — Ensifer sp. Mlu10PmNifA; 4 — контроль (Pseudomonas sp. К749 — свободноживущий азотфиксатор). К1, К2, К3 — дикие варианты штаммов клубеньковых бактерий

Скачать (141KB)
Метаданные
4. Рис. 3. ОТ-ПЦР-анализ транскрипционной активности генов nifA (a) и nifH (б) в клетках диких и рекомбинантных штаммов ризобий Rhizobium sp. VSy9, Mesorhizobium sp. LZh7, Ensifer sp. Mlu10. 1 — дикие штаммы бактерий; 2 — рекомбинантные штаммы бактерий без индукции; 3 — рекомбинантные штаммы бактерий с индукцией; 4 — ПЦР тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинатных бактерий после обработки ДНКазой; 5 — отрицательный контроль

Скачать (209KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Дот-блот-анализ продукции белка NifH рекомбинантными штаммами клубеньковых бактерий, выращенными на питательной среде без и с добавлением индуктора m-толуоловой кислоты (0,5 мМ). 1 — положительный контроль штамма Pseudomonas sp. К749; 2 — нерекомбинантный штамм бактерий Rhizobium sp. VSy9; 3 —нерекомбинантный штаммм бактерий Ensifer sp. Mlu10; 4 — нерекомбинантный штамм бактерий Mesorhizobium sp. LZh7; 5 — рекомбинантный штамм бактерий Rhizobium sp. VSy9PmNifA, культивируемый на среде без индуктора; 6 — рекомбинантный штамм бактерий Ensifer sp. Mlu10PmNifA, культивируемый на среде без индуктора; 7 — рекомбинантный штамм бактерий Mesorhizobium sp. LZh7PmNifA, культивируемый на среде без индуктора; 8 — рекомбинантный штамм бактерий Rhizobium sp. VSy9PmNifA, культивируемый на среде с индуктором; 9 — рекомбинантный штамм бактерий Ensifer sp. Mlu10PmNifA, культивируемый на среде с индуктором; 10 — рекомбинантный штамм бактерий Mesorhizobium sp. LZh7PmNifA, культивируемый на среде с индуктором

Скачать (69KB)
Метаданные

© Баймиев Ан.Х., Гуменко Р.С., Владимирова А.А., Акимова Е.С., Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
 


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах