Разработка и применение методики на основе петлевой изотермической амплификации (lamp) для диагностики кампилобактериоза

Обоснование. Среди бактерий представители Campylobacter spp. часто становятся причиной гастроэнтеритов. Для их выявления активно используются различные диагностические методы, в том числе метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), однако для получения результатов требуется не менее 5–6 ч. Разработка быстрых молекулярных диагностических тестов на основе петлевой изотермической амплификации позволит существенно упростить процедуру и сократить время исследования, приблизив их к формату «у постели больного».

Цель исследования — разработка методики, основанной на петлевой изотермической амплификации (LAMP) с детектирующим флуоресцентным зондом, для диагностики кампилобактериоза.

Методы. Предварительную пробоподготовку клинических образцов фекалий проводили согласно методическим рекомендациям ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Экстрагировали ДНК с помощью набора «АмплиТест РИБО-преп» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Присутствие Campylobacter spp. подтверждали методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора «АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). В качестве гена-мишени для выбора LAMP-праймеров использовали ген 16S рРНК. Аналитическую специфичность проверяли на культурах бактерий; аналитическую чувствительность оценивали с помощью рекомбинантной плазмиды, содержащей целевой фрагмент последовательности ДНК кампилобактерий. Изотермическую амплификацию проводили при температуре 65°C в течение 30 мин.

Результаты. Разработана методика для выявления Campylobacter spp. на основе петлевой изотермической амплификации, где время реакции не превышает 30 мин. Аналитическая чувствительность разработанной методики сравнима с показателями ПЦР и равна 10³ ГЭ/мл; аналитическая специфичность составляет 100%. Исследование 127 клинических образцов, предварительно охарактеризованных коммерческим набором «АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL», показало высокую диагностическую специфичность и чувствительность разработанной LAMP-методики. Ложноположительных результатов не выявлено, 108 образцов оказались отрицательными по результатам LAMP и ПЦР. ДНК Campylobacter spp. была обнаружена методом LAMP в 18 образцах из 19 положительных по результатам ПЦР. Один дискордантный образец, отрицательный по результатам LAMP, может быть объяснен низкой бактериальной нагрузкой Campylobacter spp. для данного образца.

Заключение. Разработана методика быстрого выявления Campylobacter spp. на основе изотермической амплификации, и экспериментально показаны ее высокие аналитические и диагностические характеристики.