Модуль RRE-REV не оказывает влияния на эффективность упаковки белков cas9 и Gag в вирусоподобные частицы системы Nanomedic

Полный текст

Развитие технологий редактирования генома человека с помощью системы CRISPR/Cas9 позволило начать разработки лекарственных средств для лечения ряда заболеваний человека, многие из которых уже находятся на различных стадиях клинических исследований [1]. Это обусловливает актуальность создания эффективных технологий доставки компонентов системы CRISRP/Cas9 в клетки человека [2]. Один из таких методов доставки – вирусоподобные частицы (VLP, virus-like particles) на основе оболочечных вирусов: лентивируса ВИЧ или γ-ретровируса MLV [3]. VLP представляют собой вирусные частицы, собранные из структурных белков и содержащие некоторые вирусные ферменты, но лишенные вирусного генома и акцессорных белков. На своей поверхности VLP несут белок оболочки, чаще всего гетерологичный белок VSVG из вируса везикулярного стоматита (VSV). За счет этого VLP могут эффективно проникать в клетки, доставляя компоненты системы редактирования генома [3]. Различные варианты VLP для доставки комплекса белка Cas9 и гидовой РНК (рибонуклеопротеиновый комплекс, РНП) были описаны в ряде недавних работ [4–8]. При этом одна из лимитирующих стадий получения VLP – это упаковка в них нуклеазы Cas9. Большинство вариантов систем сборки VLP основано на слиянии нуклеазы Cas9 с полипротеином Gag вирусов ВИЧ или MLV [6–8]. Нуклеаза Сas9 упаковывается в частицы в составе слитого белка с Gag, и после формирования частицы вирусные протеазы расщепляют слитый белок, высвобождая Cas9. Было обнаружено, что протеаза вируса ВИЧ способна частично разрушать нуклеазу Cas9 [5]. Для предотвращения деградации Cas9 была разработана система сборки VLP NanoMEDIC, в которой упаковка Cas9 в VLP основана на димеризации Cas9, слитой с доменом FRB (FRB-Cas9), c белком Gag из вируса ВИЧ, слитым с доменом FKBP12. В присутствии рапамицина или его аналогов домены FKBP12 и FRB димеризуются, в результате чего нуклеаза Cas9 привлекается в упаковывающиеся частицы, а в клетках-мишенях концентрация димеризатора падает, и Cas9 высвобождается из комплекса с Gag [5].

Геном ретровирусов содержит так называемые Rev response element (RRE), которые необходимы для экспорта несплайсированных вирусных транскриптов из ядра в цитоплазму. У вируса ВИЧ акцессорный белок Rev связывается с RRE и помогает экспорту по CRM1-зависимому пути [9]. У более простых ретровирусов молекулы РНК-генома содержат так называемые constitutive transport elements (CTEs), которые привлекают компоненты NXF1/NXT1-зависимого пути экспорта вирусных транскриптов. Есть данные о том, что добавление RRE элемента к транскрипту в присутствии белка Rev значительно ускоряет экспорт транскрипта в цитоплазму и приводит к более быстрому накоплению белка-репортера [10]. Подобное наблюдение было сделано и для CTE сигнала вируса M-PMV [10]. В работе [Indikova et al., 11] была предложена система для сборки VLP на основе слитого белка Vpr-Cas9, и для повышения эффективности сборки VLP в генетическую конструкцию, кодирующую Vpr-Cas9, были добавлены элементы RRE или CTE. Оказалось, что RRE-Rev модуль примерно в два раза повышал уровень упаковки Vpr-Cas9 в VLPs по сравнению с CTE-сигналом [11]. Однако в данной работе не проводилось сравнение эффективности упаковки Vpr-Cas9 в VLP между конструкциями несущими RRE или CTE и без таковых [11]. Таким образом, остается непонятным, каков был вклад RRE-Rev модуля в улучшенную упаковку Vpr-Cas9 в VLP по сравнению с конструкциями без RRE. В данной работе мы решили выяснить, можно ли повысить эффективность упаковки нуклеазы Cas9 и белка Gag в VLP системы NanoMEDIC за счет RRE-Rev-зависимого экспорта транскриптов из ядра. Для этого был оценен эффект добавления RRE-элементов в генетические конструкции, кодирующие FRB-Cas9 и FKBP12-Gag, на уровень соответствующих белков в клеточных лизатах и VLP системы NanoMEDIC.

Вначале на основе ранее описанных плазмид системы NanoMEDIC pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A (Addgene # 138477) и pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) (Addgene # 138476), любезно предоставленных [Akitsu Hotta, 5], были получены конструкции, несущие элемент RRE вируса ВИЧ-1 между кодирующей последовательностью и сигналом полиаденилирования (рис. 1). Для этого элемент RRE амплифицировали в ПЦР на матрице плазмиды pUCHR (описана ранее в [12]) с праймерами 5’-EcoRI-BstBI-RRE (5-CCGAATTCGAAGAGCAGTGGGAATAGGAGC-3) и 3’-PspXI-RRE (5-CGACTCGAGGAGCTGTTGATCCTTTAGG-3) и клонировали по сайтам EcoRI/PspXI в pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A или по сайтам BstBI/PspXI в вектор pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV). Далее оценивали эффект от введения RRE элементов на уровень продукции белков FRB-Cas9 и FKPB12-Gag при транзиторной трансфекции в клетки линии HEK293T (получены из NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, США), которые культивировали при 37 °C в увлажненной атмосфере в присутствии 5% CO₂ в среде Dulbecco’s modified Eagle’s medium (HyClone, #SH30285.01), содержащей 10%-ю фетальную бычью сыворотку (HyClone, США, #SV30160.03), 2 мМ L-глутамин (Gibco, США, #25003-024), 1000 ед./мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США, 15140-122) и 400 мкг/мл G418 сульфата (Calbiochem, Германия, #345812). Клетки рассевали в 24-х луночные планшеты (Costar, США, #3524) в плотности 100-150 тыс. в лунку, и трансфицировали плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 или FKBP12-Gag, содержащими RRE элемент или без такового, вместе с плазмидой для экспрессии белка Rev (pRSV-Rev, Addgene #12253, любезно предоставлена Дидье Троно и описана ранее [13] или вместе с контрольной плазмидой pBluescriptSKII(-) (Stratagene, США), которая не содержит функциональных генетических элементов млекопитающих, в соотношении 1:1. Клетки трансфицировали, используя реагент GenJectTM-39 (Molecta, Россия) в соответствии с протоколом производителя, используя 500 нг плазмидной ДНК на лунку. Через 48 ч после трансфекции клетки лизировали в 1-кратном буфере для ДСН-ПААГ и полученные лизаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга с мышиными моноклональными антителами к белку p17 HIV Type 1 клон 32/5.8.42 (Zeptometrix, США, #0801005) в разведении 1:2500, мышиными моноклональными антителами к α-тубулину, клон DM1α (Sigma-Aldriсh, США, #T6199), в разведении 1:2000, и кроличьими поликлональными антителами к HA-эпитопу для детекции Cas9 (Cell Signaling, Нидерланды, #3724S), разведение 1:2000. Хемилюминесцентный сигнал детектировали с помощью системы гель-документации ChemiDoc MP (Bio-Rad, США), используя набор реагентов Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, США). Денситометрический анализ результатов вестерн-блоттинга проводили с помощью программы Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). В результате было установлено, что котрансфекция плазмиды для экспрессии белка Rev приводила к 1.76-кратному повышению уровня FRB-Cas9-RRE в клеточных лизатах (рис. 2, FRB-Cas9, образцы Rev+ RRE+). Неожиданно, более выраженный эффект (3-кратное повышение уровня белка FRB-Cas9) отмечался в случае транскрипта без элемента RRE (см. рис. 2, FRB-Cas9, образцы Rev+ RRE-). Для белка FKBP12-Gag было выявлено незначительное повышение уровня белка примерно в 1.2-раза при котрансфекции плазмиды для экспрессии Rev, также не зависящее от наличия в транскрипте элемента RRE (рис.2, FKBP12-Gag, Rev+ и Rev-). Полученные результаты указывают либо на неспецифический эффект от котрансфекции плазмиды pRSV-Rev, либо на то, что эффект от экспрессии белка Rev не зависит от его способности стимулировать экспорт мРНК из ядра за счет связывания с RRE элементами.

Для проверки этих гипотез был проведен контрольный эксперимент, в котором плазмиды для экспрессии FRB-Cas9 и FRB-Cas9-RRE котрансфицировали вместе с плазмидой pRSV-Rev (рис. 3, Rev) или с контрольными плазмидами pBluescriptSKII(-) (pBl), pCMV-pA (CMV) и pEYFP-N1 (Clontech, США) (Eyfp). Плазмида pCMV-pA получена ранее в лаборатории и содержит промотор цитомегаловируса человека и сигнал полиаденилирования вируса SV40, но не содержит кДНК. Плазмида pEYFP-N1 экспрессирует флуоресцентный белок Eyfp под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования вируса SV40. В результате было установлено, что уровень белка FRB-Cas9 повышался при котрансфекции как pRSV-Rev (в 1.66 для FRB-Cas9 и в 1.25 для FRB-Cas9-RRE), так и контрольной плазмиды pCMV-pA (в 1.39 для FRB-Cas9 и в 1.9 для FRB-Cas9-RRE), независимо от присутствия в транскрипте элемента RRE (рис. 2а). Таким образом, наблюдаемый эффект на уровень белка FRB-Cas9, по всей видимости, не связан с взаимодействием белка Rev c RRE-элементом, а является следствием неспецифического эффекта при котрансфекции плазмиды.

Дополнительно были получены плазмиды на основе pRSV-Rev c нарушенной кодирующей последовательностью белка Rev. Для этого плазмиду pRSV-Rev либо обрабатывали рестриктазой BamHI, после чего липкие концы плазмиды достраивали с помощью фрагмента Кленова и лигировали вектор сам на себя. В результате в кодирующей последовательности Rev образуется преждевременный стоп-кодон, таким образом экспрессируется укороченный белок Rev с 1 по 61 аминокислоту (Rev∆B). В другом варианте плазмиду pRSV-Rev обрабатывали рестриктазами PspXI-BamHI, удаляя N-концевой фрагмент белка Rev вместе со старт-кодоном (Rev∆BP). Полученная плазмида не содержит старт-кодон в одной рамке считывания с С-концевой частью белка Rev и не должна экспрессировать даже минимальные фрагменты этого белка. В результате трансфекции полученных плазмид вместе с FRB-Cas9 было обнаружено 2-кратное повышение уровня FRB-Cas9 при экспрессии Rev, но не Rev∆B или Rev∆BP (см. рис. 2б). Полученный результат указывает на то, что помимо неспецифического эффекта от транзиторной трансфекции, наблюдаемый эффект от трансфекции плазмиды pRSV-Rev частично может быть связан с функцией Rev, не ассоциированной с влиянием на экспорт мРНК из ядра. Однако для FRB-Cas9-RRE в данном эксперименте не было обнаружено существенного эффекта от котрансфекции плазмид с Rev (см. рис. 2б). С одной стороны, это противоречит результатам на рис. 1 и 2а, но с другой стороны, эффект от экспрессии Rev в этих экспериментах составлял всего 1.75 и 1.25. Поэтому вариабельность результатов может быть обусловлена малой величиной наблюдаемого эффекта при котрансфекции плазмиды для экспрессии Rev вместе с FRB-Cas9-RRE либо быть артефактом транзиторной трансфекции (см. ниже).

 

Рис. 1. Схемы плазмидных конструкций для получения VLP системы NanoMEDIC. Плазмиды pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A и pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) модифицировали путем добавления элемента RRE вируса ВИЧ-1 (RRE) между кодирующей последовательностью (FRB-Cas9 или FKBP12-Gag) и сигналом полиаденилирования (pA). EF1α – промотор гена EEF1A1 человека.

 

Рис. 2. Влияние экспрессии белка Rev на уровень продукции FRB-Cas9 и FKPB12-Gag. Лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 и FKPB12-Gag c элементами RRE (RRE+) или без таковых (RRE-) вместе с плазмидой для экспрессии белка Rev (Rev+) или контрольной плазмидой pBluescriptSKII(-) (Rev-), анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA-эпитопу (FRB-Cas9), белку ВИЧ p27 (FKBP12-Gag) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

 

Рис. 3. Оценка специфичности эффекта от экспрессии белка Rev на уровень продукции FRB-Cas9. Лизаты клеток HEK293T, трансфицированных плазмидами для экспрессии FRB-Cas9 c элементами RRE или без таковых (RRE-) вместе с плазмидами (а) для экспрессии белков Rev и Eyfp или контрольными плазмидами pBluescriptSKII(-) (pBl) и pCMV-pA (CMV), или (б) для экспрессии белка Rev, его укороченной формы (Rev∆B), плазмиды с делецией N-концевой части кДНК Rev (Rev∆BP) и контрольной плазмиды (pBl) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA-эпитопу (FRB-Cas9) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

 

Для выявления эффекта RRE-Rev модуля на упаковку Cas9 и Gag в VLP системы NanoMEDIC получали VLP, используя плазмиды для экспрессии соответствующих белков с RRE элементом или без такового в присутствии или отсутствие плазмиды для экспрессии Rev. В частности, для продукции VLP 2 ∙ 10⁵ клеток НЕК293Т рассевали в лунки 12-луночного планшета в 1 мл полной среды (DMEM/F12 (“ПанЭко”, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки телят (HyClone), 4 мМ L-глутамина и 40 мг/л гентамицина (“ПанЭко”). Через 24 ч клетки трансфицировали, используя 0.1 мкг плазмиды pHLF-EF1α-FRB-Cas9 или pHLF-EF1α-FRB-Cas9-RRE, 0.1 мкг плазмиды pHLS-EF1α-FKBP12-Gag или pHLS-EF1α-FKBP12-Gag-RRE, 0.04 мкг плазмиды pCMV-VSV-G (Addgene #8454, любезно предоставлена Бобом Вайнбергом и описана ранее [14] ), 0.08 мкг pKSgRNA-GFPt (плазмида для экспрессии гидовой РНК, направленной к кДНК белка TurboGFP, мишень: GATGCGGCACTCGATCTCCATGG) с добавлением 0.1 мкг плазмиды pRSV-Rev или pBluescriptII KS (+). Для трансфекции использовали трансфекционный реагент GenJect-39 (“Молекта”) в соотношении 1:2 (мкг ДНК : мкл GenJect) и среду OptiMEM (Gibco). Через 4 ч после добавления к клеткам комплексов ДНК/GenJect среду меняли на свежую, предварительно прогретую до 37^оС, для образцов с димеризатором в среду добавляли реагент AP21967 (Takara Bio Inc., Япония) до конечной концентрации 300 нМ.

Для получения препарата VLP через 48 ч после трансфекции отбирали супернатант, центрифугировали его 5 мин при 3600 g, после чего переносили в новые пробирки и центрифугировали при 4 ^оС и 21 000 g в течение 2.5 ч. Супернатант отбирали, оставляя около 15 мкл жидкости над осадком, содержащим VLP. Суммарный объем доводили до 20 мкл с помощью OptiMEM (Gibco), смешивали с 4-кратным буфером для ДСН-ПААГ (250 мМ Трис-HCl, pH = 6.8, 40%-ный глицерин, 8%-ный ДСН, 4%-ный 2-меркаптоэтанол и 0.2%-ный бромфеноловый синий) и инкубировали в течение 5 мин при 80 °С. Параллельно клетки-продуценты вирусоподобных частиц трипсинизировали с помощью раствора трипсина-ЭДТА 0.05% (“ПанЭко”), отмывали в буфере PBS, суспендировали на холоду в 120 мкл лизирующего буфера, содержащего 20 мM Трис-HCl pH = 8.0, 150 мM NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% (w/v) “Тритон Х-100”, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и инкубировали при 4 ^оС 15 мин. Затем лизаты центрифугировали 10 мин при 4 ^оС и 12 000 g, после чего супернатанты смешивали с 4-кратным буфером образца для ДСН-ПААГ и инкубировали в течение 5 мин при 80 °С.

Далее проводили вестерн-блот-анализ полученных препаратов VLP и лизатов клеток-продуцентов с антителами к HA-эпитопу, белку Gag и α-тубулину. В результате было установлено, что обработка клеток веществом AP21967, вызывающим димеризацию FRB и FKBP12, приводит к примерно 2-3-кратному повышению уровня упаковки Cas9 в VLP, что было описано ранее для системы NanoMEDIC [5] (рис. 4, образцы AP+). При этом уровень упаковки Cas9 в VLP в образцах без добавления AP21967 был примерно в два раза выше для RRE-транскриптов, но не зависел от присутствия Rev. В образцах, обработанных AP21967, уровень Cas9 существенно не различался между образцами с RRE и без такового. Анализ клеточного лизата выявил повышение уровня белка Cas9 примерно в два раза во всех образцах, трансфицированных плазмидами с RRE элементом, не зависящее от присутствия Rev (см. рис. 4, панель лизаты, FRB-Cas9). По всей видимости повышенный уровень упаковки Cas9 в VLP в клетках, трансфицированных RRE плазмидами и не обработанных AP21967, обусловлен повышением уровня Cas9 в лизатах. Кроме того, при получении VLP для трансфекции используется смесь из четырех плазмид, поэтому возможное влияние плазмиды pRSV-Rev на уровень белка FRB-Cas9 в данных условиях может быть менее выражено по сравнению с экспериментами с котрансфекцией двух плазмид.

Таким образом, было установлено, что лишь обработка клеток димеризатором AP21967 оказывала существенный эффект на уровень упаковки Cas9 в VLP. Присутствие элемента RRE повышало уровень Cas9 в лизатах и уровень упаковки Cas9 в VLP без обработки димеризатором AP21967, однако при добавлении AP21967 уровень упаковки Cas9 в VLP был примерно одинаков во всех образцах. Это свидетельствует о том, что основную роль при упаковке Cas9 в частицы системы NanoMEDIC играет именно AP21967-индуцированная димеризация FRB и FKBP12, но не модификация плазмид с помощью элемента RRE или ко-трансфекция плазмиды, экспрессирующей Rev.

 

Рис. 4. Влияние RRE-элементов на упаковку нуклеазы Cas9 в VLP системы NanoMEDIC. VLP получали, как описано в тексте, используя плазмиды для экспрессии FRB-Cas9 и FKPB12-Gag c элементами RRE или без таковых в присутствии белка Rev (Rev+) или без белка Rev (Rev-). Для индукции димеризации FRB и FKBP12 клетки обрабатывали веществом AP21967 в концентрации 300 нМ (AP+) или ДМСО (AP-). Через 48 ч после трансфекции получали лизаты VLP и клеток-продуцентов и анализировали их с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к HA- эпитопу (FRB-Cas9), белку ВИЧ p17 (FKBP12-Gag) и α-тубулину для контроля суммарного уровня белка в лизатах клеток. Показаны результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

 

Доставка РНП с помощью VLP для редактирования генома с терапевтическими целями сходна по эффективности с электропорацией РНП [7]. При этом VLP можно псевдотипировать различными белками вирусной оболочки, тем самым направляя в определенный тип клеток in vivo [7]. Наконец, доставка РНП снижает вероятность редактирования нецелевых локусов из-за быстрой деградации белка Cas9, а также элиминирует риск инсерционного мутагенеза из-за отсутствия вирусного генома [15]. Все это в совокупности определяет актуальность развития методов эффективной продукции VLP.

В данной работе был оценен эффект от модификации транскриптов элементами RRE для повышения упаковки FRB-Cas9 и FKBP12-Gag в частицы системы NanoMEDIC в присутствии акцессорного белка Rev. Было выявлено, что транзиторно котрансфицируемые плазмиды, как для экспрессии Rev, так и контрольные, не содержащие кДНК, могут неспецифически влиять на уровни белков Cas9 и Gag в клеточных лизатах. При этом эффект не зависит от наличия элемента RRE в этих плазмидах. Известно, что при транзиторной котрансфекции плазмидных векторов могут наблюдаться различные артефакты, включая активацию репортерных генов пустыми плазмидными векторами [16], а также ряд других парадоксальных эффектов (см. обзор [17]. Это может объяснить полученные в данной работе результаты.

Влияние модуля RRE-Rev на уровень упаковки нуклеазы Vpr.Prot.Cas9 в VLP было показано в работе [Indikova et al, 11]. Уровень упаковки Vpr.Prot.Cas9 в VLP был в два раза выше для RRE по сравнению со CTE-элементом, однако уровень Vpr.Prot.Cas9 в лизатах не различался между транскриптами с CTE и RRE элементами. Важно отметить, что в данной работе не проводилось сравнения с контрольным транскриптом, не содержащим RRE или CTE элементы. В качестве источника белка Rev авторы использовали плазмиды pRSV-Rev и упаковочную плазмиду psPAX2, несущую также гены gag и pol. Наличие двух плазмид, кодирующих Rev, вероятно, обеспечивает более высокий уровень белка Rev по сравнению с нашей экспериментальной системой. Однако и в этом случае отсутствовал необходимый контроль в виде оценки упаковки Vpr.Prot.Cas9-RRE в VLP в отсутствие плазмиды pRSV-Rev. Таким образом, отсутствие важных контролей, а также вероятность детекции артефактов транзиторной котрансфекции не позволяют сделать вывод о необходимости модуля RRE-Rev для повышения эффективности упаковки Vpr.Prot.Cas9. Результаты нашей работы указывают на то, котрансфекция не только pRSV-Rev, но и контрольных плазмид, не экспрессирующих Rev, обладает неспецифическим эффектом на уровень экспрессии FRB-Cas9 в лизатах, и это не зависит от наличия RRE элемента в транскрипте. Более того, было обнаружено, что именно AP21967-индуцированная димеризация FRB и FKBP12 играет основную роль при упаковке Cas9 в частицы системы NanoMEDIC, но не модификация плазмид с помощью элемента RRE или котрансфекция плазмиды, экспрессирующей Rev.

В настоящий момент основной способ получения VLP – это транзиторная котрансфекция нескольких плазмид [4, 5, 7, 11]. Результаты данной работы указывают на нецелесообразность использования RRE-Rev модуля для повышения упаковки нуклеазы Cas9 в VLP системы NanoMEDIC. Полученные артефактные результаты при транзиторной котрансфекции определенных плазмид указывают на необходимость тщательного контроля условий получения VLP для выявления факторов, повышающих эффективность упаковки нуклеазы Cas9 в VLP. Мы предполагаем, что создание стабильных клеточных линий, экспрессирующих некоторые из компонентов, необходимых для сборки функциональных VLP, может помочь в стандартизации и оптимизации условий получения VLP.

Благодарности

Работа была выполнена с использованием инфраструктуры Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Института биологии гена РАН.

Источник финансирования

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00381).

Соблюдение этических стандартов

Исследований с участием людей и/или животных не проводилось.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Н. А. Круглова

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Москва

Д. С. Комков

Институт биологии гена Российской академии наук; Ben-Gurion University of the Negev

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

Россия, Москва; Израиль, Be’erSheva

Д. В. Мазуров

Институт биологии гена Российской академии наук; University of Minnesota

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

Россия, Москва; USA, Minneapolis

М. В. Шепелев

Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы