Coumarin-based acid dye for fluorescent staining of calcium carbonate particles

S. N. Zelinskiy; Зелинский С. Н.; E. N. Danilovtseva; Даниловцева Е. Н.; M. S. Strelova; Стрелова М. С.; V. A. Pal’shin; Пальшин В. А.; V. V. Annenkov; Анненков В. В.

doi:10.31951/2658-3518-2023-A-6-244

Кислотный краситель на основе кумарина для флуоресцентного окрашивания частиц карбоната кальция

Авторы: Зелинский С.Н.¹, Даниловцева Е.Н.¹, Стрелова М.С.¹, Пальшин В.А.¹, Анненков В.В.¹
Учреждения:
1. Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук
Выпуск: № 6 (2023)
Страницы: 244-252
Раздел: Статьи
URL: https://journals.rcsi.science/2658-3518/article/view/282905
DOI: https://doi.org/10.31951/2658-3518-2023-A-6-244
ID: 282905

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Витальное флуоресцентное окрашивание кальцийсодержащих структур в кальцифицирующих организмах - мощный инструмент для изучения биокальцификации. Основные красители, используемые в этой области, обладают зеленой или красной флуоресценцией, которая может перекрываться с флуоресценцией хлорофилла и других органических веществ. Мы синтезировали новый флуоресцентный краситель QA2 на основе кумарина, который окрашивает карбонат и фосфат кальция. Флуоресценция красителя зависит от среды, она усиливается в неполярной среде, а максимум эмиссии смещается в синюю область спектра. Мелкие частицы ватерита и фосфата кальция адсорбируют QA2 на поверхности и демонстрируют преимущественно зеленую флуоресценцию, в то время как кристаллы кальцита с низкой площадью поверхности окрашиваются в массе и демонстрируют также интенсивную синюю флуоресценцию. Способность красителя QA2 генерировать синюю флуоресценцию карбоната кальция может быть полезна для отслеживания образования карбоната кальция в живых организмах в присутствии органических веществ с зеленой и красной флуоресценцией.

Ключевые слова

флуоресценция, витальный краситель, кумарин, кальцит, ватерит

Полный текст

1. Введение

Витальное флуоресцентное окрашивание кальцийсодержащих структур в кальцифицирующих организмах позволяет измерять скорость их роста и изучать процессы биокальцификации (Ramesh et al., 2017; Tambutte et al., 2012). Для этого используются различные флуоресцентные красители, флуоресцирующие в зеленом и красном спектре (Liao et al., 2021; Tada et al., 2014). Наибольшее применение среди таких красителей нашли кальцеин (Mount et al., 2004; Vidavsky et al., 2015) и ализариновый красный (González-Pabón et al., 2021; Wannakajeepiboon et al., 2023). Кальцеин считается более надежным и широко используемым благодаря своей потенциальной нетоксичности и простоте применения - в отличие от ализаринового красного, кальцеин можно добавлять непосредственно в среду обитания организмов (Serguienko et al., 2018). Однако наличие автофлуоресценции в раковинах моллюсков (Delvene et al., 2022; Spires et al., 2021), а также в водорослях (Donaldson, 2020; Schoor et al., 2015; Tang and Dobbs, 2007) может вызвать трудности в интерпретации флуоресцентных изображений из-за перекрытия спектров флуоресценции кальцеина или ализаринового красного и структур, автофлуоресцирующих в желто-зеленой или красной области. Решением проблемы может стать использование красителей с флуоресценцией в синей области спектра. Недавно (Annenkov et al., 2019) мы разработали краситель QN2 на основе кумарина для окрашивания растущих кремнистых фрустул диатомовых водорослей. Этот краситель демонстрирует эмиссию в синей области спектра с добавлением зеленой флуоресценции при встраивании в кремнезем. Способность QN2 проникать в кремнистые структуры объясняется наличием аминных групп, способных взаимодействовать с кремнеземом. Биоминералы на основе кальция способны связываться с карбоксилсодержащими веществами (Nudelman et al., 2006; Rao et al., 2015), поэтому красители, нацеленные на кальций (ализариновый красный и кальцеин), содержат несколько кислотных групп.

Цель данной работы - синтез нового кумаринового красителя QA2 с двумя карбоксильными группами, изучение его спектральных свойств и способности окрашивать in situ полученные карбонат и фосфат кальция.

2. Материалы и методы

2.1. Химические реактивы

Все растворители и реактивы были приобретены в ЗАО «Вектон» (Санкт-Петербург, Россия). Этилацетат промывали раствором бикарбоната натрия, дистиллированной водой, сушили над безводным хлоридом кальция с последующей отгонкой. Диметилформамид (ДМФА) встряхивали в течение 30 минут с безводным CuSO₄, фильтровали через воронку Бюхнера, перегоняли в вакууме и выдерживали на молекулярных ситах 3А. Триэтиламин сушили CaH₂ и отгоняли. Перед использованием L-аспарагиновую кислоту выдерживали над P₄O₁₀ в вакуумированном эксикаторе в течение 48 часов. 7-(Диэтиламино)кумарин-3-карбоновая кислота и сукцинимидиловый эфир 7-(диэтиламино)кумарин-3-карбоновой кислоты были синтезированы в соответствии с (Berthelot et al., 2005).

2.2. Синтез of N-[[7-(диэтиламино)-2-оксо-2H-1-бензопиран-3-ил]карбонил]-L-аспарагиновой кислоты (QA2)

Смесь 40.6 мг (0.305 ммоль) L-аспарагиновой кислоты, 74.8 мг (0.739 ммоль) триэтиламина, 90.3 мг (0.252 ммоль) сукцинимидилового эфира 7-(диэтиламино)кумарин-3-карбоновой кислоты и 3 мл сухого ДМФА перемешивали на магнитной мешалке в атмосфере азота при комнатной температуре в течение четырёх часов и при 55°C пять часов. Затем летучие компоненты выпарили в вакууме масляного насоса (нагрев на бане 35°C), а остаток растворили в смеси 3 мл дистиллированной воды и 5 мл этилацетата и профильтровали через слой ваты. Водный слой отделили, проэкстрагировали этилацетатом (2 мл × 2), подкислили концентрированной соляной кислотой и снова проэкстрагировали этилацетатом (2 мл × 3). Последние объединенные этилацетатные экстракты высушили MgSO₄, выпарили на роторном испарителе и выдержали в вакууме масляного насоса при 40°C в течение трех часов, получив желто-коричневый продукт. ESI-MS, найдено: [M+H]⁺ 377.1340, молекулярной формуле C₁₈H₂₀N₂O₇ соответствует [M+H]⁺ 377.1343.

2.3. Синтез карбоната и фосфата кальция в присутствии красителей

Окрашенные осадки карбоната кальция получали соосаждением из исходных растворов Na₂CO₃ (24 мМ, pH = 9), CaCl₂ (24 мМ) и QA2 (4 мМ). Осадки получали в стеклянных флаконах емкостью 10 мл при 25°C. Общий объем раствора составлял 4 мл. Растворы карбоната натрия, красителя и необходимого количества воды смешивали, хорошо встряхивали и через 1 минуту при перемешивании добавляли раствор хлорида кальция. Концентрации в конечной смеси составили 6 мМ Ca²⁺, 6 мМ CO₃^2-, 0,01 мМ красителя. Флакон закрывали крышкой и оставляли при комнатной температуре. Выпавший через 2 ч осадок отделяли центрифугированием (1000 g, 10 минут), промывали водой (4°С) и исследовали микроскопически.

Окрашенные осадки фосфата кальция получали соосаждением из маточных растворов (NH₄)₂HPO₄ (24 ммоль, рН = 10), CaCl₂ (24 ммоль) и QA2 (4 мМ). Осадки получали в стеклянных флаконах емкостью 10 мл при 25°C. Общий объем раствора составлял 4 мл. Растворы гидрофосфата диаммония, красителя и необходимого количества воды смешивали, хорошо встряхивали и через 1 мин при перемешивании добавляли раствор хлорида кальция. Концентрации в конечной смеси составляли 6 мМ Ca²⁺, 3,6 мМ HPO₄^2-, 0,01 мМ красителя. Флакон закрывали крышкой и оставляли при комнатной температуре. Выпавший через 2 ч осадок отделяли центрифугированием (1000 g, 10 минут), промывали водой (4°С) и исследовали микроскопически.

2.4. Приборы

Анализ HRMS проводили при помощи системы Agilent 6210 TOF (времяпролетная) LC/MS (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия). Образец растворяли в смеси деионизированной воды и ацетонитрила 2/1 (по объему). В качестве элюирующих растворителей А и В использовали воду и ацетонитрил с 0,1% добавкой (по объему) гептафтормасляной кислоты. Условия проведения TOF MS были следующими: диапазон масс m/z от 60 до 500, время сканирования 1 секунда с задержкой между сканированиями 0,1 с; масс-спектры записывали при ионизации электрораспылением (ESI)+, режим V, центроид, нормальный динамический диапазон, капиллярное напряжение 3500 В, температура десольватации 325 °C и поток азота 5 л/мин.

Спектры поглощения, возбуждения и эмиссии измеряли на спектрофлуориметре СМ-2203 (ЗАО «Спектроскопия, оптика и лазеры - современные разработки», республика Беларусь, Минск) в 10 мм кварцевой кювете. В качестве источника возбуждения в приборе использовалась импульсная ксеноновая лампа.

Световая и флуоресцентная микроскопия проводилась на инвертированном микроскопе MOTIC AE-31T с ртутной лампой HBO 103 W/2 OSRAM. Возбуждение проводилось при 470 нм для зеленой и желтой эмиссии и 365 нм для синей эмиссии.

3. Результаты и обсуждение

Краситель QA2 был получен в реакцией сукцинимидилового эфира 7-(диэтиламино)кумарин-3-карбоновой кислоты с L-аспарагиновой кислотой (Рис. 1). Спектры поглощения нового красителя (Рис. 2) содержат три пика при 216, 265 и 430 (вода), 253 и 410 (диоксан) нм. Форма спектров эмиссии (Рис. 3) не сильно зависит от длины волны возбуждения, но интенсивность флуоресценции в воде значительно ниже, чем в диоксане, а ее максимум (475 нм) сдвинут в красную область по сравнению с флуоресценцией в диоксане (455 нм). Аналогичные эффекты наблюдались и обсуждались для красителя QN2 (Annenkov et al., 2019).

Рис.1. Синтез красителя QA2.

Рис.2. Спектры поглощения 10 µM растворов QA2 в воде и 1,4-диоксане.

Рис.3. Спектры возбуждения и эмиссии QA2 в воде и 1,4-диоксане. Концентрация 5 µМ. A - спектры возбуждения при эмиссии 452 нм, B - спектры эмиссии при возбуждении 256 нм, C - 425 нм, D - 410 нм, E - 400 нм, F - 385 нм, G - 374 нм. Щели для эмиссии и возбуждения 5 нм

Карбонат кальция, получаемый в результате реакции хлорида кальция и карбоната натрия (Рис. 4), содержит частицы двух форм: кубические кристаллы и агрегированные мелкие округлые частицы. Кубические кристаллы представляют собой кальцит, а мелкие частицы - ватерит - метастабильную форму карбоната кальция, которая в водной среде превращается в кальцит путем растворения и перекристаллизации (Ogino et al., 1987). Частицы кальцита проявляют зеленую и синюю флуоресценцию, в то время как ватерит демонстрирует только зелено-желтую эмиссию. Это различие в цвете флуоресценции аналогично различию в спектрах эмиссии в воде и в неполярном растворителе, таком как диоксан. Мы предполагаем, что мелкие частицы ватерита с высокой площадью поверхности адсорбируют QA2 на поверхности, и флуоресценция красителя аналогична флуоресценции в водной среде. Превращение ватерита в кальцит приводит к захоронению красителя в кристалле кальцита, и его флуоресценция становится похожей на эмиссию в неводной среде, со сдвигом в синий диапазон. Осаждение фосфата кальция в присутствии красителя QA2 приводит к образованию мелких зелено-флуоресцирующих частиц, которые демонстрируют слабую синюю эмиссию (Рис. 5). Вероятно, краситель в мелких частицах фосфата кальция не так изолирован от воды, как в кристаллах кальцита, что снижает флуоресценцию в синем диапазоне.

Рис.4. Микрофотографии в видимом свете и эпифлуоресценция частиц карбоната кальция, полученных в присутствии красителя QA2. Масштабная линейка 50 µм.

Рис.5. Микрофотографии в видимом свете и эпифлуоресценция частиц фосфата кальция, полученных в присутствии красителя QA2. Масштабная линейка 50 µм.

4. Выводы

Мы синтезировали новый флуоресцентный краситель QA2 на основе кумарина, который окрашивает карбонат и фосфат кальция. Флуоресценция красителя зависит от среды, она усиливается в неполярной среде, а максимум эмиссии смещается в синюю область спектра. Мелкие частицы ватерита и фосфата кальция адсорбируют QA2 на поверхности и демонстрируют преимущественно зеленую флуоресценцию, в то время как кристаллы кальцита с низкой площадью поверхности окрашиваются в массе и демонстрируют также интенсивную синюю флуоресценцию. Способность красителя QA2 генерировать синюю флуоресценцию карбоната кальция может быть полезна для отслеживания образования карбоната кальция в живых организмах в присутствии органических веществ с зеленой и красной флуоресценцией.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, проект № 122012600070-9. Авторы выражают благодарность Центру ультрамикроанализа (Лимнологический институт) за предоставленное оборудование.