Прогнозирование действия энзимов для извлечения веществ с антимикробной направленностью действия из организмов Sus scrofa и Bos taurus

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Изучение антимикробных соединений животного происхождения, в частности антимикробных пептидов (АМП), является актуальной темой исследований в последнее время. Тем не менее извлечение эндогенных АМП является затруднительным процессом и требует применения принципов направленной энзиматической обработки на основании знаний о строении препропептидных молекул — предшественников АМП. В данной работе был проведен поиск присутствующих в организмах Sus scrofa и Bos taurus антимикробных пептидов, а также их предшественников с помощью баз данных The Antimicrobial Peptide Database и UniProtKB. В аминокислотных последовательностях препропептидов находили последовательность зрелого пептида и определяли сайты расщепления для трипсина, бактериальной коллагеназы (тип I) и нейтрофильной эластазы. По итогам поиска антимикробных соединений в базе данных The Antimicrobial Peptide Database было выявлено 18 антимикробных пептидов Sus scrofa и 40 антимикробных пептидов Bos taurus. Согласно результатам определения сайтов расщепления в предшественниках АМП, энзимы были распределены от менее предпочтительного к более предпочтительному для высвобождения АМП следующим образом: бактериальная коллагеназа (тип I) ≤ трипсин < нейтрофильная эластаза. Такой порядок обоснован не только количеством подходящих сайтов расщепления и их точностью, но и действием ферментов внутри зрелых АМП: важно учитывать, что энзимы могут «разрезать» сами пептиды, снижая тем самым их антимикробную активность. Проведенный биоинформатический анализ применим как для осуществления первичного скрининга потенциала сырья, так и для определения подходящих энзимов с целью извлечения антимикробных соединений из организмов Sus scrofa и Bos taurus.

Полный текст

1. Введение

История открытия веществ с противомикробными свойствами берет начало со второй половины XIX века, когда было обнаружено, что микроорганизмы ответственны за различные инфекционные заболевания, преследовавшие человечество с давних времен [1]. Первым противомикробным агентом в мире был сальварсан, средство от сифилиса, синтезированное в 1910 г. Эрлихом [2]. В 1935 г. Домагком и другими исследователями были разработаны сульфаниламиды. Эти препараты были синтетическими соединениями и имели ограничения с точки зрения безопасности и эффективности. В 1928 году Флеминг обнаружил, что рост Staphylococcus aureus подавляется в зоне, окружающей синюю плесень (гриб из рода Penicillium) в зараженных ей культуральных чашках, что привело к открытию антибиотиков, ингибирующих рост других микроорганизмов [1]. Антибиотик, названный пенициллином, начал применяться в клинической практике в 1940-х годах и возглавил эру антимикробной терапии, спасая жизни раненых во время Второй мировой войны. В течение последующих двух десятилетий один за другим разрабатывались новые классы противомикробных препаратов, однако вскоре стало ясно, что микроорганизмы обладают способностью приобретать устойчивость к антимикробным агентам антибиотической природы. В связи с возросшей резистентностью микроорганизмов антимикробные вещества, ранее эффективные, больше не применяются или подвергаются модификациям. Ученые постоянно ведут поиски новых агентов с антимикробной направленностью действия, считая ключевыми критериями их отбора эффективность и безопасность, а также учитывая время и возможность возникновения резистентности к действующему веществу у микроорганизмов. Большой интерес у исследователей вызывают антимикробные пептиды (АМП), которые представляют собой небольшие поликатионные пептиды и являются основными факторами противоинфекционной защиты врожденного иммунитета множества живых организмов [3]. Основной механизм действия АМП заключается в нарушении целостности бактериальных клеточных мембран, также они участвуют в стимуляции иммунного ответа и в регуляции воспалительных процессов [4]. Было выявлено, что АМП ограничивают развитие устойчивости бактерий, по сравнению с другими антимикробными соединениями [4, 5], что является большим преимуществом и позволяет рассматривать антимикробные пептиды как альтернативу традиционным антибиотикам.

Согласно анализу публикационной активности в базе данных Google Scholar, по запросу «antimicrobial peptide» за последние десять лет было опубликовано свыше 92 000 работ, а с начала 2023 года это число достигло более 17 700 публикаций. Коллективными усилиями многих исследователей на основе освоенных знаний в области антимикробных пептидов в 2003 году была разработана база данных The Antimicrobial Peptide Database [6]. К настоящему времени в ней насчитывается 3 425 антимикробных пептида из шести царств: 385 бактериоцинов/пептидных антибиотиков — из бактерий, 5 — из архей, 8 — из протистов, 25 — из грибов, 368 — из растений и 2 489 — из животных, включая некоторые синтетические пептиды [6]. К 2024 году количество ресурсов, содержащих информацию об антимикробных пептидах различного происхождения, существенно возросло и составляет более 25 баз данных [7]. В настоящее время число ученых, исследующих антимикробные пептиды, довольно велико, как и диапазон объектов исследований.

Классифицировать АМП можно по многим признакам: по направленности действия (антибактериальные, инсектицидные, противогрибковые, противовирусные АМП), по физико-химическим свойствам (нейтральные, анионные, катионные), по размеру (крупные (50–100 аминокислотных остатков — а. о.), малые (10–24 а. о.), средние (25–50 а. о.)) и т. д. [8]. Стоит отметить, что большинство изученных антимикробных пептидов млекопитающих являются компонентом врожденного иммунитета и были выделены из нейтрофильных гранулоцитов. В основном они синтезируются в виде предшественников — препропептидных молекул, состоящих из N-концевой сигнальной последовательности (которая способствует нацеливанию на эндоплазматический ретикулум), просегмента и С-концевого катионного пептида. Последний, в свою очередь, демонстрирует антимикробную активность после отщепления от остальной части молекулы [8, 9, 10] посредством посттрансляционных модификаций. Препропептид удерживает C-концевой пептид в неактивной форме до его дальнейшей обработки и подготовки к высвобождению, когда это необходимо.

Следует учитывать, что АМП могут быть токсичными для некоторых клеток и нормальной микрофлоры организма-хозяина при определенных условиях. Это говорит о том, что иммунитет организма-хозяина должен поддерживать тонкий баланс: АМП должны быть достаточно мощными, чтобы быстро ингибировать патогенные микроорганизмы, но не настолько, чтобы нарушать баланс микробиоты или повреждать ткани организма-хозяина [11]. По-видимому, именно это условие обеспечивает надежную «упаковку» пептида и нейтрализацию его активности до сигнала об «атаке» патогеном. Из-за потенциально вредного воздействия зрелых АМП на клеточные мембраны млекопитающих процессинг многих АМП также регулируется путем их хранения в секреторных гранулах [12].

Несмотря на актуальность изучения антимикробных пептидов в настоящее время, большей популярностью пользуются синтезы рекомбинантных АМП с известной или биоинформатически вычисленной последовательностью, предназначенные для дальнейшего использования в качестве фармпрепаратов, пестицидов, пищевых консервантов и т. д. [13]. Данные технологии достаточно востребованы, хорошо воспроизводимы в отношении многих бактериоцинов, но имеют некоторые сложности при воспроизведении в отношении АМП млекопитающих, что обусловлено различиями между прокариотами и эукариотами. Анализ научных публикаций показал, что многие ученые озадачены вопросами поиска новых АМП, но лишь некоторые заинтересованы вопросами эффективного извлечения АМП из растительного сырья [14], насекомых [15], беспозвоночных [16].

Извлечение эндогенных антимикробных пептидов из эукариотических организмов посредством биотехнологических приемов представляет собой затруднительную задачу, которая требует решения. Стоит отметить, что принципы «направленной» энзиматической обработки для интенсификации извлечения АМП являются сложной и малоизученной областью исследований, однако довольно перспективной. В связи с этим целью настоящего исследования было прогнозирование действия энзимов для направленного извлечения антимикробных соединений на базе знаний о структуре их предшественников из организмов Sus scrofa и Bos taurus.

2. Объекты и методы

Поиск аминокислотных (АК) последовательностей зрелых антимикробных соединений в организмах Sus scrofa и Bos taurus осуществлялся с использованием базы данных The Antimicrobial Peptide Database [6]. Для этого переходили во вкладку AMP Database Search и в графе Source Organism указывали Sus scrofa/Bos taurus. На странице каждого обнаруженного пептида копировали ID-номер пептида из графы SwissProt ID, который вставляли в строку поиска базы данных UniProtKB [17] для поиска АК-последовательности предшественника данного пептида. В случае, если ID-номер пептида в графе SwissProt не был указан, применялся инструмент Peptide Search (https://www.uniprot.org/peptide-search), позволяющий найти предшественник искомого АМП по аминокислотной последовательности последнего с учетом таксономии.

В качестве энзимов, расщепляющих аминокислотные последовательности препропептидных молекул, рассматривали трипсин, бактериальную коллагеназу (тип I) и нейтрофильную эластазу, предпочтительные сайты расщепления для которых определяли посредством литературного поиска. В АК-последовательностях препропептидов находили последовательность зрелого пептида и выявляли сайты расщепления для каждого из энзимов. Для оценки среднего процентного содержания АК-остатков в АМП, которые должны присутствовать в сайтах расщепления в соответствии с литературными данными о протеолитическом действии отобранных энзимов, после определения списка АК-последовательностей зрелых антимикробных соединений для Sus scrofa и Bos taurus в базе данных The Antimicrobial Peptide Database [6] внизу списка переходили во вкладку Select all and see sequence statistical data.

3. Результаты и обсуждение

По итогам поиска антимикробных соединений в базе данных The Antimicrobial Peptide Database [6] было выявлено 18 антимикробных пептидов Sus scrofa и 40 антимикробных пептидов Bos taurus. Результаты определения сайтов расщепления в препропептидных предшественниках АМП для трипсина, эластазы и коллагеназы представлены в Таблицах 1, 2 и 3 соответственно.

Трипсин представляет собой сериновую протеазу, вырабатываемую поджелудочной железой. Этот фермент преимущественно гидролизует связи аминокислотных остатков лизина и аргинина (Arg (R) -|- Xaa (нейтральная аминокислота), Lys (K) -|- Xaa) на С-концевой стороне белка (Рисунок 1) [18, 19, 20].

 

Таблица 1. Действие трипсина на препропептидные предшественники некоторых АМП

Table 1. Action of trypsin on prepropeptide precursors of some AMPs

Примечание: желтым и зеленым отмечены зрелые антимикробные пептиды, красным — сайты действия фермента.

Действие трипсина на препропептидные предшественники АМП

 

Таблица 2. Действие эластазы на препропептидные предшественники некоторых АМП

Table 2. Action of elastase on prepropeptide precursors of some AMPs. Окончание таблицы 2

Примечание: желтым и зеленым отмечены зрелые антимикробные пептиды, красным — сайты действия фермента.

 

Таблица 3. Действие коллагеназы на препропептидные предшественники некоторых АМП

Tabke 3. Action of collagenase on prepropeptide precursors of some AMPs

Примечание: желтым и зеленым отмечены зрелые антимикробные пептиды, красным — сайты действия фермента.

 

Рисунок 1. Предпочтительный сайт расщепления для трипсина

Figure 1. Preferred cleavage site for trypsin

Примечание: сайты узнавания субстрата пронумерованы S1-Sn в направлении N-конца субстрата и S1’-Sn’ в направлении C-конца. Аминокислотные остатки субстрата пронумерованы P1-Pn и P1’-Pn’ соответственно. Нумерация начинается с разрезаемой связи.

Note: The substrate binding sites downstream of the cleavage site are numbered S1-Sn towards the N-terminus of the substrate and S1’-Sn’ towards the C-terminus. The substrate residues are numbered P1-Pn and P1’-Pn’ respectively. The numbering starts at the scissile bond.

 

В группе АМП Sus scrofa под названием протегрины, которые содержат всего от 16 до 18 аминокислотных остатков, определялось до 5 сайтов расщепления внутри зрелой последовательности, в то время как в Профенине-1 и Профенине-2, содержащих 78 и 79 АК-остатков соответственно, было выявлено по 6 сайтов расщепления. Группа АМП под названием PMAP также характеризовалась наличием большого количества сайтов расщепления — от 6 (в PMAP-23) до 13 (в PMAP-36), что в случае реального воздействия трипсином привело бы к сильному снижению биологической активности пептида [21]. В исследовании Ebbensgaard и др. было показано, что взаимодействие таких АМП, как Cap 18, Цекропин P1, Цекропин B, Мелиттин и Индолицидин, с трипсином приводит к полной потере их антимикробной активности уже через 30 секунд инкубации [21]. Вероятность внутреннего расщепления пептида зависит в большей степени не от размера АМП, а от его строения. Наибольшее количество сайтов расщепления среди зрелых антимикробных соединений Sus scrofa было выявлено в свином лизоциме — 20 единиц, в то время как наименьшее — в антимикробном пептиде SP-B (1 сайт расщепления).

Рассматривая результаты определения сайтов расщепления в предшественниках АМП Bos taurus, можно аналогично результатам анализа Sus scrofa отметить большое содержание данных сайтов в зрелых последовательностях АМП. Стоит отметить, что организм Bos taurus характеризуется присутствием большой группы АМП под названием бета-дефензины, в зрелых последовательностях которых выявлено до 9 сайтов расщепления (в Бета-дефензинах 2, 3 и 6). Данные АМП содержат в себе от 38 до 42 АК-остатков. Известно, что бета-дефензины конститутивно экспрессируются в молочных железах крупного рогатого скота и проявляют бактерицидную активность в отношении широкого спектра патогенов, включая Escherichia coli и Staphylococcus aureus [22]. В группе BMAP, содержащих от 27 до 34 АК-остатков, было выявлено от 7 (BMAP-28) до 11 (BMAP-34) сайтов расщепления внутри зрелых последовательностей. Наибольшее количество сайтов расщепления среди АМП Bos taurus было обнаружено в группе гистонов — от 24 (у Гистона Н4) до 29 единиц (у Гистона Н3), в то время как наименьшее — в таких АМП, как P3 и говяжий бета-казеин. У последних сайт расщепления был всего один и либо не влиял на уменьшение АК-последовательности АМП, либо имел незначительное влияние. Бета-казеин и P3 находятся не в C-концевой части последовательности препропептидного предшественника, таким образом, после воздействия трипсином данные пептиды, возможно, еще будут «пришиты» к части последовательности предшественника, не обладающей активностью.

В целом, результаты определения сайтов расщепления для трипсина в предшественниках АМП организмов Sus scrofa и Bos taurus (Таблица 1) показали, что довольно большое содержание аргинина (R) и лизина (K) в АМП и их предшественниках приводит к образованию чрезмерного множества фрагментов, расщепляя в том числе зрелую пептидную последовательность. Так, процентное содержание АК-остатков аргинина (R) и лизина (K) в зрелых АМП Sus scrofa составляет 12,92% и 6,46% соответственно, а содержание этих же АК-остатков в зрелых АМП Bos taurus составляет 13,48% и 7,79% соответственно. Это не является существенным отличием и показывает примерно одинаковую эффективность воздействия трипсина на расщепление АМП данных организмов. Учитывая также тот факт, что трипсин проявляет большую активность на С-концевой стороне белка [18], а также то, что большинство зрелых АМП сосредоточены именно в этой области, можно сделать вывод: трипсин не является подходящим энзимом для извлечения АМП из их препропептидных предшественников.

Действие эластазы на препропептидные предшественники АМП

Нейтрофильная эластаза относится к группе сериновых протеаз и осуществляет гидролиз преимущественно по связям валина (Val (V) -|- Xaa) и аланина (Ala (A)-|-Xaa) (Рисунок 2) [23, 24].

 

Рисунок 2. Предпочтительный сайт расщепления для эластазы

Figure 2. Preferred cleavage site for elastase

Примечание: сайты узнавания субстрата пронумерованы S1-Sn в направлении N-конца субстрата и S1’-Sn’ в направлении C-конца. Аминокислотные остатки субстрата пронумерованы P1-Pn и P1’-Pn’ соответственно. Нумерация начинается с разрезаемой связи.

Note: The substrate binding sites downstream of the cleavage site are numbered S1-Sn towards the N-terminus of the substrate and S1’-Sn’ towards the C-terminus. The substrate residues are numbered P1-Pn and P1’-Pn’ respectively. The numbering starts at the scissile bond.

 

В группе протегринов, где внутри зрелых последовательностей было найдено до пяти сайтов расщепления при воздействии трипсина, при влиянии эластазы обнаруживалось максимум три сайта расщепления. Один из сайтов расщепления находился в началe N-концевой части зрелого пептида, обеспечивая его высвобождение из предшественника. Другие сайты располагались в C-концевой части, расщепление по ним приводило к укорачиванию пептида, что может влиять на его активность. Кроме того, результаты показали, что такие АМП Sus scrofa, как PMAP-37, PR-39, Профенин-1 и PR-35, будут также высвобождаться под воздействием эластазы с минимальным изменением их структуры, несмотря на то, что количество сайтов расщепления в их предшественниках достигало 21 (в предшественнике Профенина-1).

Среди АМП Bos taurus также были выявлены пептиды, обладающие высоким потенциалом извлечения с помощью эластазы — Бактенецин-5, Бактенецин-7 и Индолицидин. Группа дефензинов характеризовалась наличием от 2 (Бета-дефензины 1, 2, 8 и 11) до 4 (Бета-дефензины 4 и 5) сайтов расщепления внутри зрелой последовательности, однако они были расположены ближе к ее центру, что может приводить к сильному укорачиванию АМП и, как следствие, к снижению их активности. Группа BMAP характеризовалась наличием одного сайта расщепления в начале зрелой последовательности пептида, однако последующие сайты укорачивали ее с С-концевой стороны. Аналогичное влияние эластаза может оказывать на предшественник пептида BSN-37: в нем выявлено 16 сайтов расщепления, последний из которых «разрезает» препропептидную молекулу в месте начала зрелой последовательности антимикробного пептида. Тем не менее, как и АМП группы BMAP, пептид не высвобождался полностью, будучи «сшитым» с восемью аминокислотными остатками предшественника, что способно снизить активность BSN-37.

Среднее относительное содержание валина и аланина было несколько ниже в зрелых антимикробных последовательностях Sus Scrofa и Bos taurus, по сравнению с содержанием аргинина и лизина. Так, для АМП Sus scrofa процентное содержание валина и аланина составляло 5,11% и 3,36% соответственно, а для АМП Bos taurus — 5,51% и 4,6%. Это соотношение влияло и на распределение сайтов расщепления эластазы в зрелых АМП Sus scrofa и Bos taurus — их количество было в целом меньшим, чем в случае с трипсином. Возможности эластазы для активации АМП уже были продемонстрированы коллективом итальянских ученых в 2022 году: ими было разработано пролекарство, удлиняющее антимикробный пептид D-BMAP18 отрицательно заряженной инактивирующей последовательностью, содержащей сайт расщепления нейтрофильной эластазой [25]. Конечная цель заключалась в том, чтобы обеспечить активацию D-BMAP18 эндогенной эластазой только в месте инфекции/воспаления, обеспечивая медленное и целенаправленное высвобождение фармакологически активного пептида. Пролекарство обладало минимальной активностью в отсутствие эластазы, а продукт его протеолиза сохранял значительную антимикробную активность, но меньшую цитотоксичность. Таким образом, потенциал применения эластазы для извлечения АМП из препропептидных предшественников организмов Sus scrofa и Bos taurus является достаточно высоким.

Действие коллагеназы на препропептидные предшественники АМП

Бактериальная коллагеназа I типа представляет собой протеазу, расщепляющую связь между нейтральной аминокислотой (Xaa) и глицином в последовательности Pro(P)-Xaa-|-Gly(G)-Pro(P) (Рисунок 3) [26, 27].

 

Рисунок 3. Предпочтительная последовательность для расщепления коллагеназой

Figure 3. Preferred cleavage site for collagenase

Примечание: сайты узнавания субстрата пронумерованы S1-Sn в направлении N-конца субстрата и S1’-Sn’ в направлении C-конца. Аминокислотные остатки субстрата пронумерованы P1-Pn и P1’-Pn’ соответственно. Нумерация начинается с разрезаемой связи.

Note: The substrate binding sites downstream of the cleavage site are numbered S1-Sn towards the N-terminus of the substrate and S1’-Sn’ towards the C-terminus. The substrate residues are numbered P1-Pn and P1’-Pn’ respectively. The numbering starts at the scissile bond.

 

Лишь у 3-х предшественников АМП Sus scrofa были обнаружены сайты расщепления для коллагеназы: Профенин-2, SP-B и SP-E, причем в предшественнике Профенина-2, содержащем 228 АК-остатков, коллагеназа отщепляла только последние 9 С-концевых АК-остатка, оставляя «пришитой» основную часть АМП к N-концевой части. В пептидах SP-B и SP-E специфичные последовательности обнаруживались чаще, однако они находились посередине антимикробной последовательности зрелого пептида. При воздействии коллагеназы на данные АМП их последовательность укорачивалась бы вдвое, что значительно снижало бы их активность [28].

Среди предшественников АМП Bos taurus наблюдались схожие результаты: сайты расщепления были обнаружены только в предшественниках Бактенецина-5 и BSN-37. При этом, как и в случае с предшественником Профенина-2, воздействие коллагеназой позволило бы отщепить только несколько АК-остатков в С-концевой части препропептидного предшественника Бактенецина-5 и BSN-37.

В связи со специфичностью необходимой последовательности субстрата, результаты определения сайтов расщепления для коллагеназы не показали значимого результата, несмотря на довольно высокое содержание пролина и глицина в зрелых последовательностях АМП как Sus scrofa, так и Bos taurus. Так, содержание АК-остатков пролина и глицина в АМП Sus scrofa в среднем составляло 22,47% и 9,15% соответственно, а в АМП Bos taurus — 9,67% и 8,81%.

Ранее было показано, что вследствие особенностей строения большинство АМП млекопитающих имеют изоэлектрическую точку (pI) в щелочном диапазоне рН [7, 29], в связи с чем некоторые ученые рекомендуют применять слабокислотную экстракцию для их эффективного извлечения [30, 31]. Для дальнейшей же энзиматической обработки экстракта с целью высвобождения и активации АМП необходимо учитывать оптимум действия рН конкретного энзима. Так, для протеолитического действия трипсина диапазон оптимальных значений рН составляет 7,0–8,0 [32], для коллагеназы — от 6,0 до 7,0 [33], для эластазы — около 7,0 [34]. Таким образом, при использовании слабокислых экстрагентов в дальнейшем необходимо будет нейтрализовать полученные экстракты для более эффективного воздействия рассматриваемых энзимов. Согласно данным Таблиц 1, 2 и 3, а также учитывая особенности протеолитического действия энзимов при различных значениях рН, можно распределить ферменты от менее предпочтительного к более предпочтительному для высвобождения АМП из предшественников в организмах Sus scrofa и Bos taurus следующим образом: бактериальная коллагеназа (тип I) ≤ трипсин < нейтрофильная эластаза.

В эпоху применения современных биоинформатических инструментов алгоритм прогнозирования действия энзимов для извлечения АМП из различных типов сырья может отличаться от представленного в данном исследовании, так как на сегодняшний день существуют современные онлайн-ресурсы, позволяющие, к примеру, учитывать нюансы пространственного расположения белков, желаемую вероятность их расщепления и т. д. Одним из таких ресурсов является PeptideCutter (https://web.expasy.org/peptide_cutter/) [35] на базе Expasy — биоинформатического портала Швейцарского института биоинформатики. С помощью PeptideCutter можно предсказать потенциальные сайты расщепления в АК-последовательности для некоторых протеаз (каспазы 1–10, пепсин, трипсин, Arg-C протеиназа, Asp-N эндопептидаза, энтерокиназа, нейтрофильная эластаза, пролин-эндопептидаза) или химических веществ. Тем не менее онлайн-инструменты на сегодняшний день предоставляют информацию лишь о небольшом количестве энзимов, а также существуют ограничения в доступе к некоторым из них. Таким образом, «ручной» биоинформатический анализ все еще актуален и востребован, а также демонстрирует свою применимость в проведении первичного скрининга потенциала сырья и в процессе определения подходящих энзимов для извлечения антимикробных соединений из организмов Sus scrofa и Bos taurus.

4. Выводы

Антимикробные соединения животного происхождения, в частности АМП, являются актуальными объектами исследований уже долгое время, и могут стать хорошей альтернативой антимикробным препаратам антибиотической природы. Тем не менее извлечение эндогенных АМП является затруднительным процессом и требует применения принципов направленной энзиматической обработки на основании знаний о строении предшественников данных соединений. По итогам поиска антимикробных соединений в базе данных The Antimicrobial Peptide Database было выявлено 18 антимикробных пептидов Sus scrofa и 40 антимикробных пептидов Bos taurus. Согласно результатам определения сайтов расщепления в препропептидных предшественниках АМП для трипсина, эластазы и коллагеназы, энзимы были распределены от менее предпочтительного к более предпочтительному для высвобождения АМП следующим образом: бактериальная коллагеназа (тип I) ≤ трипсин < нейтрофильная эластаза. Такой порядок обоснован не только количеством подходящих сайтов расщепления и их точностью, но и действием ферментов внутри зрелых АМП: важно учитывать, что энзимы могут «разрезать» сами пептиды, снижая тем самым их антимикробную активность. Кроме того, известно, что активность трипсина выше с С-конца препропептида, где и локализовано большинство антимикробных пептидов у Sus scrofa и Bos taurus. Проведенный биоинформатический анализ показал эффективность как в проведении первичного скрининга потенциала сырья, так и при определении подходящих энзимов для направленного извлечения антимикробных соединений из организмов Sus scrofa и Bos taurus.

×

Об авторах

Е. К. Полищук

ФНЦ пищевых систем им. В. М. Горбатова

Автор, ответственный за переписку.
Email: e.politchuk@fncps.ru
ORCID iD: 0000-0003-2719-9649

младший научный сотрудник, Экспериментальная клиника-лаборатория биологически активных веществ животного происхождения

Россия, Москва

Е. А. Котенкова

Федеральный научный центр пищевых систем им. В. М. Горбатова

Email: lazovlena92@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1864-8115

кандидат технических наук, старший научный сотрудник, Экспериментальная клиника- лаборатория биологически активных веществ животного происхождения

Россия, Москва

Список литературы

  1. Saga, T., Yamaguchi, K. (2009). History of antimicrobial agents and resistant bacteria. Japan Medical Association Journal, 52(2), 103–108.
  2. Gensini, G. F., Conti, A. A., Lippi, D. (2007). The contributions of Paul Ehrlich to infectious disease. Journal of Infection, 54(3), 221–224. https://doi.org/10.1016/j.jinf.2004.05.022
  3. Wang, J., Dou, X., Song, J., Lyu, Y., Zhu, X., Xu, L. et al. (2019). Antimicrobial peptides: Promising alternatives in the post feeding antibiotic era. Medicinal Research Reviews, 39(3), 831–859. https://doi.org/10.1002/med.21542
  4. Magana, M., Pushpanathan, M., Santos, A. L., Leanse, L., Fernandez, M., Ioannidis, A. et al. (2020). The value of antimicrobial peptides in the age of resistance. The Lancet Infectious Diseases, 20(9), e216–e230. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(20)30327-3
  5. Bechinger, B., Gorr, S.-U. (2017). Antimicrobial peptides: Mechanisms of action and resistance. Journal of Dental Research, 96(3), 254–260. https://doi.org/10.1177/0022034516679973
  6. APD3: Antimicrobial Peptide Database. Retrieved from https://aps.unmc.edu/. Accessed January 24, 2024.
  7. Katedra Biochemii Żywności. Bioactive peptide databases. Retrieved from https:// biochemia.uwm.edu.pl/bioactive-peptide-databases/. Accessed January 24, 2024.
  8. Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. (2020). Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology, 11, Article 582779. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.582779
  9. Bhattacharjya, S., Mohid, S. A., Bhunia, A. (2022). Atomic-resolution structures and mode of action of clinically relevant antimicrobial peptides. International Journal of Molecular Sciences, 23(9), Article 4558. https://doi.org/10.3390/ijms23094558
  10. Reddy, K. V. R., Yedery, R. D., Aranha, C. (2004). Antimicrobial peptides: Premises and promises. International Journal of Antimicrobial Agents, 24(6), 536–547. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2004.09.005
  11. Hanson, M. A., Lemaitre, B., Unckless, R. L. (2019). Dynamic evolution of antimicrobial peptides underscores trade-offs between immunity and ecological fitness. Frontiers in Immunology, 10, Article 2620. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02620
  12. Zhang, L.-J., Gallo, R. L. (2016). Antimicrobial peptides. Current Biology, 26(1), R14–R19. https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.11.017
  13. Keymanesh, K., Soltani, S., Sardari, S. (2009). Application of antimicrobial peptides in agriculture and food industry. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25(6), 933–944. https://doi.org/10.1007/s11274-009-9984-7
  14. Barashkova, A. S., Rogozhin, E. A. (2020). Isolation of antimicrobial peptides from different plant sources: Does a general extraction method exist? Plant Methods, 16(1), Article 143. https://doi.org/10.1186/s13007-020-00687-1
  15. Sultana, A., Luo, H., Ramakrishna, S. (2021). Harvesting of antimicrobial peptides from insect (Hermetia illucens) and its applications in the food packaging. Applied Sciences, 11(15), Article 6991. https://doi.org/10.3390/app11156991
  16. Vizioli, J., Salzet, M. (2002). Antimicrobial peptides from animals: Focus on invertebrates. Trends in Pharmacological Sciences, 23(11), 494–496. https://doi.org/10.1016/S0165-6147(02)02105-3
  17. UniProt Protein Database. Retrieved from http://www.uniprot.org/. Accessed January 24, 2024.
  18. Dau, T., Bartolomucci, G., Rappsilber, J. (2020). Proteomics using protease alternatives to trypsin benefits from sequential digestion with trypsin. Analytical Chemistry, 92(14), 9523–9527. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00478
  19. Trypsin-1. Retrieved from https://www.uniprot.org/uniprot/P07477. Accessed January 25, 2024.
  20. Bioinformatics explained: Proteolytic cleavage. QIAGEN Digital Insights. Retrieved from https://resources.qiagenbioinformatics.com/manuals/clcgenomicsworkbench/650/BE_Proteolytic_cleavage.html. Accessed February 6, 2024.
  21. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Overgaard, M. T., Nielsen, C. G., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. (2015). Comparative evaluation of the antimicrobial activity of different antimicrobial peptides against a range of pathogenic bacteria. PLoS ONE, 10(12), Article e0144611. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144611
  22. Daneshi, M., Caton, J. S., Caixeta, L. S., Eftekhari, Z., Ward, A. K. (2023). Expression, regulation, and function of -defensins in the bovine mammary glands: Current knowledge and future perspectives. Animals, 13(21), Article 3372. https://doi.org/10.3390/ani13213372
  23. Elastase, neutrophil expressed. Retrieved from https://www.uniprot.org/uniprot/A0A286ZN14. Accessed January 24, 2024.
  24. Vizovišek, M., Vidmar, R., Fonović, M., Turk, B. (2016). Current trends and challenges in proteomic identification of protease substrates. Biochimie, 122, 77–87. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2015.10.017
  25. Degasperi, M., Sgarra, R., Mardirossian, M., Pacor, S., Maschio, M., Scocchi, M. (2022). Elastase-activated antimicrobial peptide for a safer pulmonary treatment of cystic fibrosis infections. Antibiotics, 11(3), Article 319. https://doi.org/10.3390/antibiotics11030319
  26. Collagenase ColG. Retrieved from https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q9X721/entry. Accessed February 6, 2024.
  27. Eckhard, U., Huesgen, P. F., Brandstetter, H., Overall, C. M. (2014). Proteomic protease specificity profiling of clostridial collagenases reveals their intrinsic nature as dedicated degraders of collagen. Journal of Proteomics, 100, 102–114. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2013.10.004
  28. Cantisani, M., Finamore, E., Mignogna, E., Falanga, A., Nicoletti, G. F., Pedone, C. et al. (2014). Structural insights into and activity analysis of the antimicrobial peptide myxinidin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 58(9), 5280–5290. https://doi.org/10.1128/AAC.02395-14
  29. Лукинова, E. A., Котенкова, E. A., Полищук, E. K. (2018). Изучение антимикробных свойств биологически активных веществ животного происхождения в зависимости от методологии их выделения. Теория и практика переработки мяса, 3(3), 27–35. https://doi.org/10.21323/2414-438X-2018-3-3-27-35
  30. Кораблева, Е. С., Берлов, У., Андреева, Ю. В., Кокряков, В. Н. (2007). Антимикробный пептид из лейкоцитов собаки: структурно-функциональные свойства. Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 3. Биология, 3, 80–88.
  31. Юхнев, В. А., Шартукова, М. А., Луговкина, Н. В., Кокряков, В. Н., Шамова, О. В. (2014). Поиск новых антимикробных пептидов из семейства кателицидинов и дефенсинов в лейкоцитах лося (Alces alces). Вестник СПбГУ. Серия 3. Биология, 1, 115–131.
  32. Wirnt, R. (1965). Trypsin. Chapter in a book: Methods of Enzymatic Analysis. Academic Press, 1965. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-395630-9.50146-8
  33. Creative Enzymes. Collagenase. Retrieved from https://www.creative-enzymes.com/similar/collagenase_148.html. Accessed February 5, 2024.
  34. Korkmaz, B., Gauthier, F. (2013). Elastase-2/Leukocyte Elastase. Chapter in a book: Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, 2013. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-382219-2.00587-1
  35. Expasy. PeptideCutter. Retrieved from https://web.expasy.org/peptide_cutter/. Accessed February 5, 2024.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Предпочтительный сайт расщепления для трипсина

Скачать (73KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Предпочтительный сайт расщепления для эластазы

Скачать (85KB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Предпочтительная последовательность для расщепления коллагеназой

Скачать (87KB)
Метаданные
5. Таблица 1. Действие трипсина на препропептидные предшественники некоторых АМП

Скачать (928KB)
Метаданные
6. Таблица 2. Действие эластазы на препропептидные предшественники некоторых АМП

Скачать (1MB)
Метаданные
7. Таблица 3. Действие коллагеназы на препропептидные предшественники некоторых АМП

Скачать (1MB)
Метаданные

© Пищевые системы, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».