Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Том 18, № 1 (2023)
Научные обзоры
Методы оценки жизнеспособности клеток, культивируемых in vitro в 2D- и 3D-структурах
Аннотация
На протяжении последних десятилетий методы оценки жизнеспособности клеток являются важным исследовательским инструментом в клеточной биологии, тканевой инженерии и регенеративной медицине. Кроме того, оценка жизнеспособности клеток обязательна при производстве и контроле качества клеточных продуктов для биомедицинских нужд.
Методы оценки жизнеспособности клеток можно широко классифицировать по механизму, лежащему в их основе, а также по способу оценки полученных результатов. Представлены варианты наиболее часто используемых тестов и протоколов для оценки жизнеспособности клеток. Приведены их преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать при планировании экспериментов, например, при разработке клеточных препаратов для регенеративной медицины.
Показаны основные факторы, влияющие на выбор метода оценки жизнеспособности клеток: эффективность, быстрота исполнения, безопасность, воспроизводимость, сохранность/целостность образца, совместимость протокола исследования с биоматериалом и типом клеточной линии. Отдельно рассмотрены тесты, которые можно применять не только для 2D-клеточных структур, но и для 3D-клеточных конструкций, получивших в последнее время широкое распространение благодаря более точному моделированию биологических процессов.
5-21
Генные технологии в доклинических исследованиях ишемического инсульта
Аннотация
Ишемический инсульт является одной из ведущих причин смерти и инвалидности во всём мире. Настоящий обзор посвящён анализу достижений в приложении генных технологий к исследованию ишемического инсульта в эксперименте.
С использованием экспериментальной ишемии мозга продолжаются исследования эффективности применения генетических конструкций с доставкой генов, кодирующих преимущественно нейротрофические и ангиогенные факторы. Прямая генная терапия доказала свою эффективность при экспериментальном ишемическом инсульте. Способ доставки генетических конструкций с целевыми генами в ишемизированный мозг с помощью клеточных носителей имеет преимущества комбинированного действия генов и трансплантируемых клеток. Исследования на моделях ишемического инсульта с клеточными носителями, сверхэкспрессирующими различные нейротрофические и ангиогенные факторы, подтверждают безопасность и эффективность данного подхода, что позволяет рассматривать клеточно-опосредованную доставку трансгенов в качестве многообещающего способа лечения инсульта.
Другая значимая область применения генных технологий, которая также затронута в обзоре, связана с опто- и хемогенетическими методами, позволившими получить новые данные по клеточным и молекулярным механизмам патогенеза ишемического инсульта.
Проведена сравнительная оценка эффективности прямого введения ряда трансгенов и их клеточно-опосредованной доставки по трём основным критериям: объёму инфаркта, плотности капилляров и двигательной активности.
23-40
Оригинальные исследования
Жидкостная биопсия плазмы и желчи с выявлением внеклеточной опухолевой ДНК при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы: пилотное исследование
Аннотация
Введение. Жидкостная биопсия плазмы по внеклеточной опухолевой ДНК является одной из наиболее перспективных диагностических технологий при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы, однако ввиду низкой концентрации данного биомаркёра в плазме его выявляемость оказывается ниже ожидаемой. В то же время у ряда пациентов с данным заболеванием наблюдаются нарушения оттока желчи, при которых возможно взятие этого уникального биоматериала для анализа.
Цель исследования — сравнение диагностического потенциала жидкостной биопсии по внеклеточной опухолевой ДНК желчи и плазмы у пациентов с протоковой аденокарциномой.
Материал и методы. В пилотное исследование включены 15 пациентов с впервые выявленной протоковой аденокарциномой поджелудочной железы и нарушениями оттока желчи. Внеклеточную ДНК выделяли из 5 мл плазмы и 5 мл желчи. Анализ внеклеточной опухолевой ДНК проводили с использованием цифровой капельной ПЦР по мутациям гена KRAS G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D и Q61H (183A>C), Q61H (183A>T), Q61K, Q61L, Q61R. Порог ложноположительных капель определяли при анализе внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы 15 здоровых добровольцев.
Результаты. В образцах желчи внеклеточная опухолевая ДНК была выявлена у 13 из 15 пациентов, в то время как среди образцов плазмы положительными оказались лишь 9 из 15. Причём не было ни одного случая, когда бы она выявлялась в плазме, но не в соответствующем образце желчи. Уровни опухолевой ДНК в желчи были статистически значимо выше, чем в плазме: 538,0 (4,1–1960,0) против 4,4 (0–27,6) копий/мл (p=0,005).
Заключение. Жидкостная биопсия желчи у пациентов с нарушениями её оттока может служить многообещающей альтернативой плазме благодаря содержанию большего количества внеклеточной опухолевой ДНК в данном биоматериале.
41-51
Экспрессия гена нестина в стромальных предшественниках из костного мозга человека
Аннотация
Введение. Иерархия стромальных предшественников из костного мозга охарактеризована скудно, в культуре выделяют мультипотентные мезенхимные стромальные клетки и колониеобразующие единицы фибробластов. До настоящего времени не найдены уникальные сочетания поверхностных антигенов для мезенхимных стволовых клеток, что затрудняет получение их чистой популяции. Часто в качестве маркёра этих клеток используют экспрессию гена нестина.
Цель работы — оценить уровень экспрессии гена нестина в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках и в колониеобразующих единицах фибробластов и охарактеризовать изменение его экспрессии при переходе от олигопотентных клеток-предшественниц к монопотентным.
Материалы и методы. Стромальные предшественники проанализировали в образцах костного мозга, полученных от 19 доноров стандартными методами. Из тех же образцов костного мозга было суммарно получено 296 индивидуальных клонов колониеобразующих единиц фибробластов. В клетках анализировали способность к дифференцировкам в жировом и костном направлениях, а также относительный уровень экспрессии гена нестина.
Результаты. Средний относительный уровень экспрессии нестина статистически значимо не отличается в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках (0,41±0,13) и в суммарной популяции колониеобразующих единиц фибробластов (0,24±0,05). В индивидуальных клонах колониеобразующих единиц фибробластов экспрессия нестина была статистически незначимо выше, чем в суммарной популяции (0,31±0,04). При анализе колониеобразующих единиц фибробластов, различающихся по дифференцировочному потенциалу, наивысшая экспрессия нестина выявлена в группе монопотентных остеогенных предшественников, тогда как в олигопотентных предшественниках его экспрессия была статистически значимо ниже.
Заключение. Экспрессия гена нестина в мезенхимных стромальных предшественниках из костного мозга не является специфичной для мезенхимных стволовых клеток и не может быть использована в качестве уникального маркёра этого типа клеток. По нашим данным, высокий уровень экспрессии нестина скорее идентифицирует монопотентные остеогенные предшественники.
53-60
Биохимические показатели спермоплазмы и морфофункциональные особенности сперматозоидов у ВИЧ-инфицированных мужчин
Аннотация
Обоснование. Проблема мужского бесплодия особенно затрагивает мужчин с ВИЧ-инфекцией, так как объём спермы и подвижность сперматозоидов снижаются при высокоактивной антиретровирусной терапии.
Цель исследования — анализ метаболических показателей спермоплазмы, спермограммы и морфологии сперматозоидов у ВИЧ-инфицированных мужчин.
Материалы и методы. В исследование включили 47 пациентов (возраст — 25–46 лет), находившихся под наблюдением в клинике профессора М.А. Флоровой (Самара). Сформированы 2 группы: основная (n=22) — ВИЧ-инфицированные пациенты, желающие иметь детей, с неопределяемой вирусной нагрузкой (40–50 копий/мл) и принимающие антиретровирусную терапию; контроль (n=25) — клинически здоровые мужчины, имеющие одного ребёнка. Взятие материала и исследование эякулята проводили согласно стандартизованным методикам, предложенным экспертами ВОЗ.
Результаты. У ВИЧ-инфицированных мужчин подвижность сперматозоидов оказалась низкой (количество прогрессивно-подвижных сперматозоидов — 28,50±3,72%), концентрация сперматозоидов — в два раза ниже по сравнению с контрольной группой, а морфологические характеристики их — значительно хуже, чем в контроле: чаще всего выявлялась патология головки (21,75±1,10%) и шейки сперматозоида (22,30±1,18%), что отрицательно сказывается на оплодотворяющей способности.
У ВИЧ-инфицированных мужчин отмечены изменения в метаболическом обмене: активность креатинфосфокиназы как в спермоплазме (661,95±1,08 Ед/л), так и в плазме крови (76,90±1,09 Ед/л) — ниже, чем в контрольной группе (844,25±0,13 и 79,50±1,37 Ед/л соответственно), концентрация глюкозы (8,07±1,14 ммоль/л) — в 2 раза выше, чем в контрольной группе (3,06±1,09 ммоль/л), концентрации кальция (6,53±0,01 моль/л) и натрия (119,20±1,23 моль/л) незначительно превышали показатели в группе здоровых пациентов (5,55±0,08 и 116,85±0,01 моль/л соответственно). При электронно-микроскопическом анализе обнаружена фрагментация ДНК сперматозоидов, причём наибольший процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК выявлен у мужчин с ВИЧ-инфекцией (более 23%).
Заключение. Выявлено, что у в естественных условиях у ВИЧ-инфицированных мужчин оплодотворение в большинстве случаев невозможно. Исследование формирует основу для будущей комплексной оценки состояния репродуктивной функции у ВИЧ-инфицированных мужчин для оценки их фертильности и необходимости применения вспомогательных репродуктивных технологий.
61-67
Клеточная модель для экспериментального изучения патогенеза кератоконуса
Аннотация
Введение. Нарушение микроэлементного окружения играет роль в развитии ряда дегенеративно-дистрофических заболеваний роговицы, так как металлозависимые ферменты метаболизируют соединительно-тканные структуры, влияя тем самым на их свойства. Так, при кератоконусе ткань роговицы обеднена железом, медью и цинком, что может быть первопричиной нарушения её биомеханических свойств. Моделирование кератоконуса сложно и не воспроизводимо на животных, поэтому актуальна разработка клеточных моделей. Для создания патологических условий, характерных для кератоконуса, необходимо снизить концентрацию нескольких минеральных элементов.
Цель исследования — разработка клеточной модели для изучения патогенеза кератоконуса. Включает решение следующих задач: 1) разработка тканеинженерной конструкции, моделирующей строму роговицы в норме; 2) разработка способа селективного обеднения питательной среды элементами, вовлечёнными в патогенез кератоконуса; 3) оценка возможности роста полученной тканеинженерной конструкции на обеднённой питательной среде.
Материал и методы. Тканеинженерные конструкции формировали из первичной культуры кератоцитов человека тремя способами: на силиконе, на мембране, без носителя. Морфологию моделей оценивали методами световой и электронной микроскопии. Обеднение по цинку проводили декатионизацией фетальной бычьей сыворотки ионообменными смолами двух типов; концентрацию микроэлементов оценивали методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.
Результаты. Оптимальной для последующего изучения была выбрана форма клеточных пластов без носителя. Обработка смолой Chelex 100 позволила на порядок снизить концентрацию цинка в питательной среде. Апробировано культивирование кератоцитов в форме клеточных пластов на обеднённой по цинку среде.
Заключение. Выбранную тканеинженерную конструкцию можно рассматривать в качестве клеточной модели стромы роговицы при состоянии обеднения по цинку, характерном для кератоконуса.
69-77
Культивирование лимбальных стволовых клеток на биополимерном носителе (предварительное сообщение)
Аннотация
Обоснование. Лимбальная недостаточность является трудноизлечимой патологией, при которой консервативные методы не всегда эффективны, а хирургия лимитирована количеством и доступностью тканей. В связи с этим важен поиск альтернативных методов лечения. На сегодняшний день наиболее перспективным подходом является трансплантация тканеинженерных конструкций, состоящих из культивированных лимбальных стволовых клеток (ЛСК) в составе биополимерных носителей.
Цель исследования — получить и охарактеризовать тканеинженерную конструкцию из культивированных ЛСК и коллагеновой мембраны.
Материалы и методы. Последовательная серия экспериментов выполнена на базе НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова и Института биологии развития им. Н.К. Кольцова в сотрудничестве с ООО «ИМТЕК». В качестве источника стволовых клеток лимбальной зоны роговицы использованы 2 кролика породы шиншилла (средний возраст — 6 мес, средняя масса тела — 3,5 кг). Стволовые клетки выделены и выращены in vitro модифицированным авторами способом. Полученные клетки культивировали в течение 14 дней и пересаживали на коллагеновую мембрану, которую затем исследовали с помощью методов иммуногистохимии.
Результаты. Клетки, выделенные из биоптата, представляли собой смесь клеток фибробластного типа и клеток с характеристиками ЛСК. Они сохраняли высокую выживаемость, пролиферативную активность, фенотип и стволовость на коллагеновом носителе.
Заключение. Полученная тканеинженерная конструкция может быть использована для дальнейшей пересадки на поражённый глаз с лимбальной недостаточностью в условиях эксперимента.
79-88