Том 20, № 1 (2025)

Область регенеративной медицины, в которой используют клетки в качестве терапевтических средств для восстановления тканей и органов, активно развивается во всём мире. Применение клеточной терапии особенно актуально для лечения дефектов суставного хряща, так как из-за особенностей строения хрящевой ткани её регенеративные способности снижены. Поскольку препараты на основе клеток являются сложными для стандартизации объектами по сравнению с традиционными лекарственными средствами, процесс оценки их безопасности и эффективности имеет свои нюансы при планировании доклинических и клинических исследований.

В большинстве случаев основой при изготовлении клеточных продуктов, используемых на сегодняшний день для лечения хондральных дефектов суставов, становятся аутологичные хондроциты и мезенхимальные стволовые/стромальные клетки, полученные из различных тканей. Клеточные продукты, дошедшие до этапов клинического применения, различаются как по методу получения готового препарата, так и по типу используемых клеток, а также по наличию в составе готового продукта матриксов в качестве носителя для клеток. Кроме того, в клинике используется различная хирургическая техника, применяемая врачами во время операций по взятию биопсии для производства и последующей имплантации готовых клеточных продуктов. Каждый препарат для клеточной терапии заболеваний хрящевой ткани имеет свои показания к применению, достоинства и недостатки, что делает актуальным сравнительный анализ средств, используемых в клинической практике. Это позволит врачам оценить возможность применения наиболее подходящей терапии, а исследователям — потенциально расширить спектр нозологий для подобных препаратов или усовершенствовать их.

В данном обзоре рассматриваются некоторые из клеточных продуктов, дошедших до стадий клинических исследований и одобренных для применения в терапии повреждений хрящевой ткани суставов.

Обоснование. Соматическое клонирование овец представляет большой интерес с точки зрения сохранения генетических ресурсов, биомедицины и биофармацевтики, но его эффективность остаётся крайне низкой. Способом повышения результативности этой технологии является оптимизация её отдельных этапов, в частности процедуры энуклеации ооцитов и переноса в перивителлиновое пространство полученных цитопластов соматической клетки (СК) — nuclear transfer (NT). Химический агент цитохалазин Б повышает устойчивость ооцита к внешним деформациям и облегчает проведение микроманипуляций. Однако вопрос его использования в технологии клонирования остаётся дискуссионным.

Цель исследования — оценить эффективность соматического клонирования овец (Ovis aries) при использовании цитохалазина Б в период подготовки созревших ооцитов перед NT в зависимости от продолжительности данной процедуры.

Материалы и методы. Для NT использовали ооциты, созревшие in vitro и имеющие в своем перивителлиновом пространстве первое полярное тельце (ППТ). Первую группу ооцитов с ППТ перед процедурой NT инкубировали в течение 20 мин в среде, содержащей 7,5 мкг/мл цитохалазина Б (опыт); другая часть их хранилась в среде аналогичного состава в отсутствие цитохалазина Б (контроль). NT выполняли с использованием инвертированного микроскопа, совмещённого с микроманипуляционной системой Narishige (Narishige Scientific Inst. Lab., Япония). Хромосомы яйцеклетки удаляли вслепую аспирацией ППТ и прилежащей к нему части цитоплазмы. СК инъецировали непосредственно в перивителлиновое пространство энуклеированного ооцита. Электрослияние являлось способом объединения комплексов ооцит–СК. Образовавшиеся в результате электрического воздействия цитогибриды активировали иономицином, подвергали одновременной обработке 6-(диметиламино)пурином и циклогексимидом, после чего культивировали в течение 2 дней для эмбрионального развития.

Результаты. Результативность NT (количество комплексов ооцит–СК относительно числа ооцитов с ППТ) и уровень слияния (количество образовавшихся цитогибридов относительно числа комплексов ооцит–СК) не различались между контрольной и опытной группами и находились на уровне 96–97 и 33–35% соответственно. В контрольной группе доля раздробившихся цитогибридов после 2 дней культивирования составила 35,7±7,7%. Предварительная инкубация ооцитов в присутствии цитохалазина Б повышала данный показатель до 59,7±6,9% (p <0,0029). Влияние обработки ооцитов цитохалазином Б на показатели эффективности клонирования, тем не менее, зависело от длительности NT: наблюдалось снижение уровня слияния (p=0,002) и уменьшение доли клонированных эмбрионов (от числа комплексов ооцит–СК) в случае превышения продолжительности процедуры более 40 мин (p=0,041).

Заключение. Кратковременное культивирование созревших ооцитов в присутствии цитохалазина Б перед процедурой NT повышает выход клонированных эмбрионов, при этом увеличение продолжительности данной процедуры оказывает негативный эффект на показатели результативности соматического клонирования овец.

Обоснование. Белок активации фибробластов альфа (fibroblast activation protein alpha, FAPα) является ключевым маркёром активированных стромальных клеток, которые играют важную роль в репарации и восстановлении целостности тканей после повреждений. По-видимому, FAPα участвует в регуляции функций стромальных клеток, особенно при развитии фиброза. Однако мало что известно о тканевых различиях в экспрессии и возможных сплайс-вариантах этого белка в стромальных клетках.

Цель исследования — установить тканеспецифичность экспрессии FAPα, включая синтез продуктов альтернативного сплайсинга, в стромальных клетках человека, выделенных из разных источников.

Методы. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени анализировали экспрессию отдельных участков гена, кодирующих функциональные домены белка FAPα, в стромальных клетках человека, выделенных из пяти тканевых источников, которые различаются по эмбриональному происхождению и репаративным реакциям на повреждение (кожа, подкожная жировая ткань, жировая ткань орбиты, лёгкие, эндометрий). Для активации стромальных клеток использовали ключевой профибротический фактор — трансформирующий фактор роста бета.

Результаты. В стромальных клетках из кожи, лёгких и жировой ткани отмечается низкая фоновая экспрессия всех последовательностей рибонуклеиновой кислоты (РНК), кодирующих функциональные домены FAPα, которые отвечают за конфигурацию белка или за его ферментативные функции. Их экспрессия значимо (в 2–2,5 раза) повышается при индукции активации стромальных клеток с помощью трансформирующего фактора роста бета. В эндометриальных мезенхимных стромальных клетках экспрессия этих участков крайне низка и сопоставима с уровнем экспрессии в эпителиальных клетках, что указывает на наличие тканеспецифичности экспрессии гена FAPα в стромальных клетках. Во всех линиях стромальных клеток наблюдается повышение относительного уровня экспрессии последовательности РНК, кодирующей трансмембранный домен FAPα.

Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что в проанализированных клеточных линиях альтернативный сплайсинг FAPα либо отсутствует, либо проявляется с очень низкой вероятностью при их активации в виде относительного повышения экспрессии участка гена, кодирующего трансмембранный домен FAPα. Вероятнее всего, исследуемые стромальные клетки синтезируют матричную РНК, несущую все исходные экзоны и кодирующую преимущественно полный белок FAPα (включает в себя все функциональные домены).