Аденоассоциированные вирусы в генной терапии спинальных мышечных атрофий: тренд или триумф?

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Большинство созданных к настоящему времени эффективных препаратов для генной терапии (ГТ) моногенных (в том числе орфанных), онкологических, нейродегенеративных заболеваний и болезней системы крови базируется на использовании рекомбинантных векторов, получаемых методами генной инженерии на основе широкого спектра вирусов. Получаемые таким образом векторы для ГТ лишены генов, ассоциированных или напрямую определяющих патогенность вирусов дикого типа, а также способность к репликации, что обеспечивает безопасность создаваемых препаратов. Следует сразу же отметить, что использование интегрирующих в геном ретро- и лентивирусов, а также технологий редактирования генома хотя и является активно прогрессирующим разделом ГТ, однако не находится в фокусе настоящего обзора.

Генная терапия с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (ААВ) — относительно новое, однако очень быстро развивающееся направление, успехам и проблематике которого посвящено данное сообщение. С точки зрения ГТ моногенных наследственных заболеваний вообще и нейромышечных заболеваний в частности большой интерес представляет использование ААВ. Эти вирусы за последние годы заслужили репутацию одной из наиболее эффективных и гибких платформ для доставки нуклеиновых кислот в клетки человека.

СТРОЕНИЕ, ТКАНЕВОЙ ТРОПИЗМ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ И ВЫБОР ПРОМОТОРА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА

Строение генома ААВ

Аденоассоциированный вирус — небольшой вирус (20–25 нм), относящийся к семейству Parvoviridae. Геном ААВ дикого типа представлен одноцепочечной ДНК длиной около 4,7 кб и включает несколько облигатных элементов, обеспечивающих в обычном жизненном цикле его репликацию при условии коинфекции аденовирусом, что послужило основанием для использования термина «аденоассоциированный» [1]. К таким элементам относятся:

• гены репликации (Rep), кодирующие четыре неструктурных белка (Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40), которые участвуют в репликации, контроле транскрипции, интеграции и инкапсуляции;
• ген вирусного кофактора, который кодирует активирующий сборку белок (AAP);
• структурные капсидные гены (Cap или Vp1, Vp2 и Vp3).

Рекомбинантные ААВ создаются путём удаления всех открытых рамок считывания из вирусного генома, что приводит к его преобразованию в дефектный по репликации вирус или вектор. Отсутствие вирусных генов, во-первых, значительно улучшает безопасность и, во-вторых, обеспечивает ёмкость вектора, которая в случае ААВ не может превышать 4,5–4,7 тыс. пар нуклеотидов из-за маленького размера капсидов данного вида вирусов.

Единственные геномные фрагменты, которые не удаляются из ААВ при создании вектора — это два инвертированных концевых повтора (ITRs). ITRs необходимы для репликации вирусной ДНК или трансгена. Минимальные ITRs имеют сайт связывания с вирусным белком Rep, который способствует включению генома вектора в предварительно сформированную капсидную частицу.

Капсид ААВ и его вклад в тропизм получаемых векторов

Капсидная оболочка ААВ служит защитой от нуклеаз, от распознавания системой врождённого иммунитета, а также определяет тропизм вириона. Всего известно 13 серотипов ААВ, которые отличаются экспрессируемыми поверхностными антигенами и аминокислотными последовательностями [1, 2], причём серотипы характеризуются выраженным тканевым тропизмом. С точки зрения разработки препарата для ГТ подбор вектора с определённым тропизмом позволяет сконцентрировать трансдукцию в клетках конкретной ткани и уменьшить доставку в нецелевые органы.

Из основных 11 серотипов (от ААВ1 до ААВ11), клонированных к настоящему времени, лучше всего охарактеризован ААВ2. Считается, что он обладает хорошим профилем безопасности и эффективности, а также хорошей пакующей ёмкостью и высокой трансдуцирующей способностью. ААВ2 часто используют в качестве основы для создания гибридных векторов, в которых ITRs одного серотипа упакованы в капсид другого серотипа для изменения его тропизма к тканям. Многообещающие новые варианты ААВ выделены из макак-резусов — ААВrh10 и ААВrh74. Они имеют высокую эффективность трансдукции, и по сравнению с ААВ2 у человека гораздо реже присутствует предсуществующий иммунитет против данных серотипов [3, 4].

Трансдукция ААВ происходит путём взаимодействия капсида с гликанами и протеогликанами, например гепарансульфатом, экспрессируемым в различных тканях. За первичным связыванием следует взаимодействие с более специфичными мембранными рецепторами и интернализация вируса. Среди этих рецепторов известны рецептор фактора роста фибробластов 1 (FGFR1) для ААВ2 [5], рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR), для ААВ2 и ААВ3 [6], рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) для ААВ5 [7], а также универсальный AAVR-рецептор [8].

Наиболее часто для разработки генотерапевтических препаратов используют серотип ААВ2, однако для лечения заболеваний нервной системы применяют векторы на основе ААВ9 и ААВ8. Кроме того, на этапе клинических исследований находятся препараты с новыми капсидами AAV-LK03, SPK-100 и AAV-HSC15, однако их безопасность ещё недостаточно охарактеризована.

Варианты промоторов для экспрессии трансгена и их эффективность

В качестве промоторов чаще всего используют CMV (промотор цитомегаловируса), CBA (промотор бета-актина цыплёнка) и CAG (синтетический промотор, состоящий из энхансера CMV, промотора CBA и акцептора сплайсинга бета-глобина кролика). Для более специфичной доставки генов применяют нативные промоторы организма-реципиента [9, 10]. Введение высоких доз векторов с нативными промоторами не приводит к развитию серьёзных нежелательных явлений (в дозе до 2×10¹⁴ вирусных частиц на килограмм), однако исследования на животных моделях показывают, что большое количество копий вектора ААВ9 может вызывать серьёзную токсичность [11]. Насколько наличие нативного промотора влияет на конечное количество вирусных частиц в трансдуцируемой ткани и безопасность вектора, неизвестно. Из-за высокой токсичности и недостаточной эффективности была прекращена разработка препарата BIIB089, предназначенного для лечения спинальной мышечной атрофии (СМА), информация о структуре использованного вектора недоступна [12, 13].

Для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) чаще всего используют промоторы CMV и CAG. В исследованиях также показано, что два других промотора, mPGK и hSYN, обеспечивают более сильную экспрессию трансгена в головном и спинном мозге по сравнению с CAG и CMV [14], однако их внедрение в клинику происходит медленно. Подобным образом первый нейрон-специфичный промотор NSE использовался в клинических исследованиях для доставки гена GAD, кодирующего декарбоксилазу глутаминовой кислоты, у пациентов с болезнью Паркинсона в 2005 году, однако, чтобы перейти к II фазе в начале 2021 года, потребовалось более 15 лет [13, 15].

АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСЫ КАК ИНСТРУМЕНТ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Актуальное состояние генной терапии с использованием ААВ

Исторически первым препаратом для ГТ путём доставки целевого гена с помощью ААВ был Glybera (алипоген типарвовек*¹, alipogene tiparvovec; Uniqure NV, Нидерланды), получивший разрешение на продажу от Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) в 2012 году [16]. Этот препарат предназначался для лечения наследственного дефицита липопротеинлипазы, однако в 2017 году был изъят из продажи в связи с низким спросом и слишком высокими затратами на производство [17].

Одобрение Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) в 2017 году воретиген непарвовека* (voretigene neparvovec, Лукстурна; Spark Therapeutics, США) [18] на основе модифицированного ААВ2, а в 2019 году — онасемноген абепарвовека (onasemnogene abeparvovec, Золгенсма; Novartis, Швейцария) [19] на базе ААВ9 значительно усилило интерес к генной терапии ААВ. Сейчас данные препараты одобрены не только в США, но и в ЕС, Великобритании, Австралии, Канаде и Южной Корее, а Золгенсма — также в Израиле, Тайване, Бразилии и Японии. В 2022 году ЕМА был одобрен эладокаген эксупарвовек* (eladocagene exuparvovec, Upstaza; PTC Therapeutics, США) [20]. Препарат представляет собой вектор AAV2, несущий ген, который кодирует L-декарбоксилазу ароматических аминокислот (hAADC), и предназначен для лечения состояний, связанных с наследственным дефицитом данного фермента. В 2022 году для лечения гемофилии в США одобрен энтранакоген дизапарворовек* (etranacogene dezaparvovec, Hemgenix; Uniqure NV, Нидерланды) — препарат на основе ААВ5, несущий ген IX фактора свёртывания крови и предназначенный для ГТ гемофилии В [21]. Летом 2023 года FDA также одобрен валоктокоген роксапарвовек* (valoctocogene roxaparvovec, Роктавиан; BioMarin Pharmaceutical, США), который использует в качестве вектора ААВ2, несущий фактор свёртывания крови VIII для лечения гемофилии А [22]. Кроме того, для лечения миодистрофии Дюшенна одобрен диландистроген моксипарвовек* (delandistrogene moxeparvovec-rokl, Elevidys; Sarepta Therapeutics, США). Препарат представляет собой рекомбинантный ААВ вектор, несущий ген микродистрофина [23].

На этапе регистрации находится ленадоген нолпарвовек* (lenadogene nolparvovec, Genethon; GenSight Biologics S.A., Франция) — препарат на основе ААВ2 с геном ND4 для лечения наследственной атрофии зрительного нерва Лебера [24]. Ведётся разработка препарата резамириген билпарвовек* (resamirigene bilparvovec, AT132; Astellas Gene Therapies, США) для лечения Х-сцепленной миотубулярной миопатии, который представляет собой ААВ8, несущий ген миотубуларина 1 (MTM1). К сожалению, в клиническом исследовании данного препарата (ASPIRO) [25] у двух из 17 мальчиков, получавших АТ132 внутривенно в дозе 3×10¹⁴ вч (вирусных частиц) на килограмм массы тела, развилась фатальная печёночная недостаточность. Следует отметить, что эти два мальчика получили гораздо более высокую дозу (4,80×10¹⁵–7,74×10¹⁵ вч в сумме) из-за более высокой массы тела. Пока неясно, была ли печёночная недостаточность проявлением сопутствующих заболеваний или вызвана более высокой дозой ААВ [25], в связи с чем во втором квартале 2023 проведена встреча разработчиков препарата с FDA США, по итогам которой было принято решение продолжить проведение клинических исследований [24].

Вопросы иммуногенности и онкогенности векторов на основе ААВ

Рассмотрены механизмы иммунного ответа на ААВ и подходы к уменьшению иммуногенности. Одной из основных проблем использования вирусных векторов является их иммуногенность, что делает небезопасным повторное введение препаратов на их основе. В развитии иммунного ответа на ААВ участвуют оба звена врождённого иммунитета: гуморальный и клеточный. Активация гуморального иммунитета приводит к формированию капсид-специфичных антител, в том числе нейтрализующих. Предсуществующие, например из-за предыдущих контактов организма с ААВ дикого типа, антитела уменьшают или полностью нарушают трансдукцию терапевтическим вектором, тем самым снижая эффективность лечения. Антитела, которые образуются в ответ на первое введение генетического вектора, не влияют на ход трансдукции, однако не позволяют использовать ААВ данного серотипа повторно. Кроме того, может наблюдаться перекрёстная реактивность антител на ААВ других серотипов.

Клеточный иммунный ответ включает активацию цитотоксичных T-клеток примерно через 4–12 нед после введения генетического вектора. Исследования на животных моделях показывает, что развитие T-клеточного ответа опосредовано Toll-like рецепторами (TLR), распознающими антигены капсида ААВ [26, 27].

Возможность активации клеточного иммунитета при распознавании капсида ААВ является важным фактором, влияющим на безопасность и эффективность проводимой ГТ. Одним из проявлений такого ответа служит гепатотоксичность, которая наблюдалась в клиническом исследовании с использованием ААВ многих серотипов — ААВ2, ААВ8, ААВ10 [28] и ААВ9. In vitro исследования показывают, что активация иммунного ответа в печени опосредована специфичной для печени популяцией макрофагов — клетками Купфера [29]. Высокое сродство ААВ9 к клеткам печени значительно увеличивает риск гепатотоксичности, при этом у ряда пациентов может наблюдаться дозозависимый эффект развития нежелательных явлений. В клинических исследованиях [30–32] гепатотоксичность онасемноген абепарвовека предотвращалась профилактическим введением преднизолона. Актуальный протокол применения онасемноген абепарвовека также включает профилактическое назначение преднизолона в минимальных дозировках и с наименьшей продолжительностью курса, что не оказывает существенного влияния на состояние пациентов детского возраста.

Одно из преимуществ ААВ в качестве вектора для ГТ по сравнению с другими вирусами заключается в том, что он вызывает минимальный клеточный и гуморальный иммунный ответ. Основной иммунный ответ на ААВ проявляется в форме образования нейтрализующих антител (нАТ) к капсиду, что предотвращает связывание с рецептором и проникновение ААВ в клетку при повторном введении. Стоит отметить, что наличие нАТ не влияет на безопасность первичного применения ААВ, но значительно уменьшает эффективность.

Наиболее распространённым в популяции является иммунитет к серотипу ААВ2: 30–80% людей контактируют с ним в раннем детстве и в течение длительного периода имеют циркулирующие нАТ к нему. Сходная распространённость приобретённого иммунитета наблюдается к серотипу ААВ3. Реже встречаются нАТ к ААВ5 (у 10–20% популяции) и ААВ6 (до 30%), а наиболее редко происходит инфицирование ААВ7 и ААВ8 (не более 5–6%). Таким образом, у некоторого количества лиц в популяции могут выявляться нАТ к одному или нескольким серотипам ААВ [33, 34], что с учётом возможного перекрёстного иммунитета может снижать эффективность ГТ с использованием данного вируса.

Существует также механизм трансплацентарной передачи нАТ от матери. Так, например, нАТ к ААВ9 (преимущественно иммуноглобулины класса G) могут определяться в первые 6 нед от рождения ребёнка. Как правило, через 4–6 мес их титр становится неопределимым. В клиническом исследовании, изучавшем применение онасемноген абепарвовека на основе ААВ9 у пациентов со СМА, у 5,6% детей определялся повышенный уровень нАТ к ААВ9 (выше 1:50) при повторном тестировании. Поэтому в реальной клинической практике перед применением препаратов ГТ на основе ААВ определяется титр нАТ [35].

Обычно в клиническое исследование ААВ не включают пациентов с нАТ, однако гематоэнцефалический и гематоофтальмический барьеры «защищают» ЦНС и органы зрения от системного иммунитета, поэтому нет необходимости исключать таких пациентов. В связи с этим актуальными являются разработка и оптимизация методов локального введения генотерапевтических препаратов в ЦНС и другие иммунопривилегированные органы. Стоит отметить, что в зависимости от пути доставки может происходить системная утечка ААВ и из ЦНС, что наблюдалось во II фазе клинического исследования препарата, предназначенного для интрацеребровентрикулярной доставки гена GDNF с помощью ААВ2. Диссеминация вектора в спинномозговую жидкость привела к нежелательным явлениям и низкой терапевтической эффективности [36, 37].

Низкая онкогенность как ключевое преимущество ААВ

Плюсом в пользу выбора ААВ для доставки терапевтических генов является то, что они не встраиваются в геном хозяина (за исключением нескольких описанных у животных случаев) и присутствуют в клетке в виде эписомы. Это значительно снижает мутагенность векторов данного типа [2, 38].

Случаев прямого онкогенного действия ААВ у человека не описано [39], однако известны крайне редкие случаи интеграции трансгена ААВ в геном других млекопитающих [40, 41]. Было показано, что после системного введения ААВ2 и ААВ9 новорождённым мышам линии MPSVII с наследственным комбинированным дефицитом гексозаминидазы А и В (модель болезни Сандхоффа) по мере взросления животных наблюдалось повышение частоты гепатоцеллюлярной карциномы. Исследование генетического материала опухолей выявило встраивание генома ААВ в специфический локус мышиной хромосомы 12 (локус Rian), что привело к дисрегуляции экспрессии соседних генов. Это исследование стало важным с точки зрения представлений о мутагенезе, вызываемом ААВ, однако данный локус присутствует только у грызунов, что делает эту находку важной с точки зрения представлений об ААВ, но не противоречит имеющимся знаниям об их безопасности у человека [42, 43].

СПИНАЛЬНЫЕ МЫШЕЧНЫЕ АТРОФИИ КАК ОДНА ИЗ ОСНОВНЫХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Характеристика и этиология заболеваний из группы спинальных мышечных атрофий

Спинальные мышечные атрофии — группа наследственных заболеваний периферической нервной системы, характеризующихся повреждением моторных нейронов головного и спинного мозга. Похожим по патогенезу и клиническим проявлениям заболеванием является боковой амиотрофический склероз (БАС), при котором также происходит поражение верхних и нижних двигательных нейронов, развиваются паралич и мышечная атрофия [44]. Молекулярно-генетические механизмы БАС до конца не известны.

В большинстве случаев СМА обусловлена мутациями или делецией гена выживаемости моторных нейронов 1 (SMN1) и наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Данный ген расположен на 5q-хромосоме и кодирует белок выживания моторных нейронов (SMN) [45, 46]. Ген SMN1 имеет паралог SMN2, отличающийся сплайсингом в экзоне 7. SMN2 также кодирует белок SMN, однако при полной делеции SMN1 продукция SMN с SMN2 оказывается недостаточной. Тяжесть заболевания определяется количеством копий гена SMN2 (чем больше, тем слабее проявления СМА).

Более редкие случаи СМА вызваны повреждениями следующих генов: VAPB (20-я хромосома), DYNC1H1 (14-я хромосома), BICD2 (9-я хромосома) или UBA1 (X-хромосома).

Как и другие нервно-мышечные заболевания, при которых поражаются двигательные нейроны, СМА являются неизлечимыми моногенными заболеваниями, вызванными loss-of-function-мутациями (приводящими к снижению или отсутствию функции белка) в конкретном гене (или его делецией), поэтому они служат потенциальными мишенями для ГТ.

Выделяют следующие типы СМА [47]:

• тип 0 проявляется уже в пренатальном периоде в виде снижения активности плода; у новорождённых наблюдаются пороки сердца, арефлексия, смерть наступает вследствие дыхательной недостаточности в течение первых 6 мес жизни;
• тип I (инфантильная СМА, или болезнь Верднига–Гоффмана) также присутствует внутриутробно или проявляется в первые 6 мес жизни; наблюдаются мышечная гипотония, гипорефлексия, затруднённое сосание и глотание; без лечения большинство больных не доживают до двух лет;
• тип II (промежуточная форма, или болезнь Дубовица) впервые проявляется в возрасте 6–18 мес. Дети не могут сидеть, стоять и ходить без посторонней помощи; отмечаются нарушения дыхания, которые часто приводят к смерти в раннем возрасте;
• тип III (болезнь Кугельберга–Веландер) обычно проявляется между 18 мес и юношеским возрастом. Дети могут самостоятельно ходить, но испытывают проблемы с бегом, подъёмом по лестнице. Болезнь прогрессирует медленно, продолжительность жизни больше (иногда вплоть до обычной) по сравнению с другими типами, зависит от развития дыхательных осложнений. Другие осложнения включают искривление позвоночника и контрактуры.
• тип IV развивается во взрослом возрасте, проявляется в медленно прогрессирующей слабости и атрофии проксимальных мышц.

Разработанные подходы к лечению спинальной мышечной атрофии

Патогенетическое лечение СМА основано на увеличении уровня белка SMN и направлено на уменьшение симптомов или улучшение двигательной функции, а также предотвращение жизнеугрожающих осложнений.

На сегодняшний день FDA и EMA одобрены следующие препараты:

1. Нусинерсен (nusinersen, Спинраза; Biogen, США) — первый одобренный препарат для лечения всех типов СМА у педиатрических и взрослых пациентов. Это антисмысловой олигонуклеотид, ингибирующий сплайсинг экзона 7 мРНК гена SMN2, что приводит к синтезу длинной, более функциональной формы белка SMN [48]. Спинраза вводится интратекально, первые 4 дозы (после 1-й дозы — день 0) вводятся 1 раз в две недели (2-я и 3-я дозы) и на 63-й день от момента введения первой дозы (4-я доза). Поддерживающая терапия осуществляется путём разового введения препарата каждые 4 мес [49].
2. Рисдиплам (risdiplam, Эврисди; Genentech, США) — пероральный препарат для лечения СМА. Подобно нусинерсену, является модификатором сплайсинга SMN2 [50], однако в качестве действующего вещества используется не олигонуклеотид, а малая молекула. Рисдиплам предназначен для пациентов со СМА типа I, II или III или для пациентов, у которых имеется до четырёх копий гена SMN2 (EMA). FDA одобрило применение препарата у всех пациентов со СМА вне зависимости от числа копий гена SMN2.
3. Онасемноген абепарвовек (onasemnogene abeparovec, Золгенсма; Novartis, Швейцария) — препарат для генной терапии СМА, представляющий собой вектор на основе ААВ9, несущий ген SMN1. Препарат вводится путём разовой внутривенной инфузии. Терапия была одобрена FDA и EMA в 2019 году, однако показания отличаются. EMA одобрило применение Золгенсмы у пациентов с наследственными мутациями в гене SMN1: у которых либо диагностирована СМА типа I, либо имеется до трёх копий гена SMN2. FDA же одобрило препарат для применения у педиатрических пациентов в возрасте до двух лет с биаллельными мутациями в гене SMN1 [51, 52].

ААВ9 как оптимальный вектор для терапии спинальной мышечной атрофии

Как уже упоминалось, СМА вызваны мутацией в определённом гене, поэтому этиотропным методом лечения является именно ГТ. Ещё одним преимуществом ГТ при СМА является то, что ААВ-опосредованная трансдукция нервной ткани может привести к длительной экспрессии генов, поскольку зрелые нейроны представляют собой неделящиеся клетки и, следовательно, в них не происходит митозов, а также связанного с ними падения экспрессии с эписомных последовательностей, доставленных с помощью ААВ.

Единственный зарегистрированный вирусный препарат для ГТ СМА Золгенсма представляет собой вектор на основе ААВ9, несущий ген SMN1 под контролем CMV-энхансера и гибридного промотора куриного β-актина. Данный серотип ААВ обладает уникальными характеристиками [53], которые позволяют ему проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что и при других заболеваниях делает векторы на основе ААВ9 хорошими кандидатами для доставки генов в ЦНС с использованием относительно малоинвазивного внутривенного введения.

Системно введённый ААВ9 трансдуцирует в основном астроциты у взрослых мышей, а также нейроны и нижние мотонейроны у новорождённых животных [54]. Системное введение ААВ9-вектора при СМА обосновывается и тем, что ген-мутация в гене SMN1 приводит к повреждению не только мотонейронов спинномозговых ганглиев, но и кишечника, нервной системы, сердца [55], поджелудочной железы [56], а также скелетных мышц [57].

ААВ9-вектор, используемый в препарате Золгенсма, является самокомплементарным (двуцепочечным), что позволяет добиваться лучшей эффективности после однократного введения. На данный момент имеются данные об эффективности и безопасности терапии онасемноген абепарвовеком в среднем через 7,1 года после начала лечения: все 10 пациентов, получившие препарат в терапевтической дозе в исследовании START (NCT02122952), живы и не нуждаются в постоянной вентиляции лёгких, также у них наблюдается сохраняющаяся эффективность по сохранению ранее приобретённых или достижению новых моторных навыков [58–60]. В клиническом исследовании [61] были отмечены и нежелательные явления, вызванные введением препарата, которые ограничивались повышением уровня печёночных аминотрансфераз в сыворотке крови примерно через 3 нед после начала лечения, без других клинических проявлений. Указанное повышение активности печёночных ферментов эффективно купировалось с помощью преднизолона.

Результаты третьей фазы клинического исследования (STR1VE) показали эффективность препарата онасемноген абепарвовека относительно контроля (группа пациентов в исследовании, в котором изучалось естественное течение СМА). Способность сидеть без опоры в течение 30 с отмечена у 59% пациентов в возрасте 18 мес по сравнению с 0% в контрольной группе (р <0,0001); 90,9% пациентов к 14 мес были живы и не нуждались в постоянной вентиляции лёгких по сравнению с 25% в контрольной группе. Суммарно в двух клинических исследованиях приняли участие 54 пациента в возрасте младше 6 мес, 2 погибли по причинам, не связанным с препаратом [62, 63].

Применение онасемноген абепарвовека было также изучено у пациентов с доклинической стадией СМА в исследовании SPR1NT. Все 29 участников выжили и не нуждались в постоянной вентиляции лёгких, у них отмечалось соответствующее возрасту моторное развитие [64, 65].

Проблемные аспекты применения ААВ9 для лечения спинальной мышечной атрофии

Долгосрочные эффекты применения онасемноген абепарвовека продолжают изучаться в 15-летнем наблюдении за пациентами-участниками клинического исследования [66]. На данный момент возраст наиболее старшего пациента, включённого в исследования START, составляет 8,5 года (8 лет от момента введения препарата) [62]. По мнению ряда учёных, у некоторых пациентов возможно снижение эффективности проведённой терапии, что может быть связано с уменьшением экспрессии целевого гена в трансдуцированных клетках из-за их быстрого деления в растущем организме [67].

При системном введении ААВ9 имеет способность трансдуцировать разные клетки и ткани в организме. Для более адресной доставки именно в ЦНС имеет смысл использовать нейро- или астроцит-специфичные промоторы. Эта идея была проверена в исследовании A. Besse и соавт. [68]. Учёные сконструировали ААВ9-вектор, экспрессирующий SMN под контролем промотора синапсина человека (SYN) — AAV9-SYN-SMN, и изучили влияние интрацеребровентрикулярного введения (i.c.v.) AAV9-SYN-SMN на выживаемость и нервно-мышечные функции у нокаутных по SMN (SMNΔ7) мышей. В качестве контроля использовали ААВ9-вектор, также кодирующий SMN, под промотором фосфоглицераткиназы (PGK) — AAV9-PGK-SMN. Вектор AAV9-PGK-SMN вводили как внутривенно, так и интрацеребровентрикулярно, причём интрацеребровентрикулярное введение вызывало максимальную экспрессию SMN в тканях ЦНС: количество SMN было в 6–9 раз выше, чем в головном и спинном мозге мышей SMNΔ7, которым интрацеребровентрикулярно вводили вектор AAV9-SYN-SMN или внутривенно — вектор AAV9-PGK-SMN. Введение AAV9-SYN-SMN в максимальной дозе индуцировало экспрессию SMN в спинном и головном мозге на уровне, сравнимом с таковым после внутривенного введения AAV9-PGK-SMN. При этом эффективность вектора AAV9-SYN-SMN уступала AAV9-PGK-SMN, вводимому разными путями. Интересно, что уровни SMN в периферических тканях были приблизительно равными при введении как i.c.v., так и внутривенно.

Накопленные клинические данные показывают безопасность ААВ, что служит хорошим обоснованием для их использования с целью доставки терапевтических генов. Актуальным направлением является разработка новых способов повышения эффективности доставки и ГТ для заболеваний ЦНС.

ВОЗМОЖНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ

Подходы к модификации ААВ-векторов

Изменение последовательности белков капсида ААВ может значительно изменить эффективность трансдукции, что позволяет осуществлять различные модификации для управления трансдукцией и тканевым тропизмом. В настоящее время наиболее перспективными представляются следующие приёмы и подходы:

1. Вставка в капсиды специфичных пептидных лигандов для адресной доставки терапевтических генов в определённые клетки и ткани. Включение в капсид специальных пептидов обеспечивает узнавание и связывание вектора со специфическими белками на поверхности клеток, некоторые модификации пептидов-лигандов усиливают также проникновение вируса внутрь клетки [69]. На данный момент известны пептиды, которые повышают ААВ-трансдукцию клеток скелетных мышц [70], лёгких [71], кровеносных сосудов [72–74], островков поджелудочной железы [75], различных опухолевых клеток [76, 77] и др.

Несмотря на то, что вставка в капсид лигандов и пептидов способствует специфичному связыванию вектора с клеточными рецепторами и повышает эффективность трансдукции, эти модификации имеют ряд ограничений. Во-первых, место вставки ограничено определёнными сайтами на капсиде, модификация которых не должна отрицательно влиять на рецептор-опосредованное проникновение вируса. Следовательно, для рационального дизайна пептидных вставок требуются знания об устойчивых к модификации сайтах капсида. Во-вторых, специфичность многих пептидов или лигандов зависит от их конформации, нарушение правильной трёхмерной структуры при проведении вставки может привести к снижению эффективности по сравнению с немодифицированным вектором. В-третьих, модифицированный капсид может подвергаться нейтрализации уже существующими антителами.

2. Использование естественного разнообразия открытых серотипов ААВ с созданием мозаичных/химерных капсидов. Мозаичные векторы включают капсидные белки нескольких серотипов ААВ. Химерные ААВ создаются либо путём направленной эволюции, либо путём генной инженерии и изменения аминокислот капсида. Подход направленной эволюции включает использование либо подверженной ошибкам ПЦР, либо перетасовку ДНК. Подверженная ошибкам ПЦР проводится в специальных условиях, повышающих частоту ошибок полимеразы, что приводит к получению вариантов капсида со случайными мутациями. В методе перетасовки ДНК используются рестрикционные ферменты для фрагментации cap-генов выбранных серотипов. Затем эти фрагменты случайным образом рекомбинируются в полноразмерные капсидные гены, после чего происходит амплификация вариантов. После получения химерных капсидов проводят селективный скрининг с предпочтительным типом клеток и выбирают варианты с наиболее подходящими характеристиками [69, 78].

Генно-инженерный подход использует информацию о структуре и последовательности капсида для создания новых химерных вирусов путём переноса определённых остатков капсида или доменов от одного серотипа к другому для достижения желаемого фенотипа.

Изменение соотношения белков каждого из серотипов позволяет добиваться необходимой эффективности трансдукции определённого типа клеток. Например, в работе J.E. Rabinowitz и коллег [79] показано, что создание капсида на основе серотипов ААВ3 и ААВ5 в соотношениях 3:1 позволяет вирусной частице связываться как с гепарином, так и с муцином на поверхности клеток, в то время как сам ААВ3 связывается только с гепарином, а ААВ5 имеют тропизм только к муцину [79]. Целесообразно также создавать химерные векторы, включающие часть белков капсида от вируса дикого типа, а часть — от модифицированного пептидом-лигандом капсида. Это позволяет одновременно достигать тропизма к определённому типу ткани и сохранять высокую эффективность трансдукции [80].

3. Экзогенная модификация капсида. Эти подходы варьируются от использования биспецифических антител для связывания вируса с рецепторами и специфического захвата клетками [81] до биотинилирования с последующей конъюгацией таргетных лигандов [82, 83]. Кроме этого, для покрытия капсида применяют специальные обволакивающие вещества, которые используются для конъюгации с лигандами, а также могут препятствовать вирусной нейтрализации антителами [84, 85]. Значительно улучшает трансдукцию ААВ2/9 заключение векторов в оболочку из катионных липидов [86].
4. Использование тканеспецифичных промоторов. Ещё одним способом, позволяющим добиваться экспрессии терапевтического гена в определённом типе клеток, является подбор тканеспецифичных промоторов. Для специфичной экспрессии трансгена в нейронах предложено использование промоторов синапсина или CamKII [87–89], промоторов GFAP или ALDH1/1 — для экспрессии в астроцитах [90, 91], промотора основного белка миелина — для олигодендроцитов [92, 93].

Модификация ААВ9 как подход к созданию препаратов нового поколения для генной терапии спинальной мышечной атрофии

Важным для векторной трансдукции ЦНС открытием стало описание серотипа ААВ9, а именно его высокого тропизма к тканям нервной системы [54]. Была показана эффективная, обширная трансдукция спинного мозга и ЦНС после однократного внутривенного или интратекального введения вектора на основе ААВ9, что послужило толчком для исследования и разработки ГТ с использованием данного серотипа. Сейчас ААВ9 является «золотым стандартом вектора» для доставки в ЦНС при системном введении и широко используется в клинических исследованиях с минимальными признаками периферической или центральной токсичности [94].

Как уже упоминалось, лежащий в основе препарата онасемноген абепарвовек ААВ9 имеет тропизм ко многим тканям, и особенно — к клеткам печени, что может в ряде случаев приводить к нежелательному явлению в виде повышения печёночных трансаминаз. В работе N. Pulicherla и соавт. [95] авторы, используя метод подверженной ошибкам ПЦР, получили вектор, обладающий сниженным тропизмом к печени, но эффективно трансдуцирующий сердечные и скелетные мышцы. Модификации были направлены на GH-петлю (аминокислоты 390–627) — участок капсида, необходимый для связывания с рецепторами и влияющий на тропизм и иммуногенность вектора.

На основе подхода рациональной инженерии получен вариант капсида ААВ9.HR. Данный вектор не только сохраняет способность ААВ9 проникать через ГЭБ при внутривенном введении новорождённым мышам, но также имеет сниженную трансдукцию периферических тканей [96].

Метод целенаправленной эволюции ААВ на основе Cre-индуцированной рекомбинации (CREATE) позволил получить вектор AAV-PHP.B, который трансдуцировал клетки ЦНС взрослых мышей после внутривенного введения с эффективностью, в 40 раз превышающей эффективность трансдукции с использованием ААВ9. Помимо астроцитов данный вектор трансдуцировал CC1⁺-олигодендроциты и несколько подтипов нейронов [97]. Однако стоит упомянуть, что полученный серотип сохраняет высокую способность проникать через ГЭБ только у животных, обладающих рецептором Ly6A, и практически не применим для приматов и клинического использования [98].

Генная терапия других нервно-мышечных заболеваний

Различные нервно-мышечные расстройства моногенного происхождения изучаются в доклинических и клинических исследованиях с использованием ГТ.

Например, в основе развития семейного БАС лежит мутация в гене супероксиддисмутазы SOD1. Мутация в этом гене приводит к накоплению неправильно сформированного белка SOD1, что ведёт к повреждению клетки. Для лечения БАС было предложено использовать ААВ, несущий микроРНК, одной из мишеней которой является SOD1. Первое применение такого вектора у двух пациентов с БАС показало, что после его интратекальной инфузии наблюдалось снижение уровня SOD1 в тканях спинного мозга [99], однако клинического улучшения не было. Данный факт обусловил необходимость дальнейших исследований.

Спинальная мышечная атрофия с респираторным дистресс-синдромом 1-го типа (SMARD1) представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание двигательных нейронов, вызванное мутациями в гене IGHMBP2 (11q13). Заболевание поражает детей и в настоящее время неизлечимо. На мышиной модели было показано, что ГТ с помощью ААВ9 восстанавливает уровень целевого белка, двигательную функцию, нервно-мышечную физиологию и увеличивает продолжительность жизни животных [100], что позволило инициировать переход к клиническому исследованию данного препарата.

Миодистрофия Дюшенна вызвана мутациями в гене DMD, кодирующем субсарколеммальный белок дистрофин. Ген DMD очень большой (11,5 тыс. п.о.), что затрудняет его упаковку в вектор на основе ААВ. Однако исследования показали, что симптомы заболевания могут быть облегчены использованием более коротких форм белка дистрофина [101, 102]. На данный момент проводится несколько клинических исследований с использованием ААВ разных серотипов (ААВrh74, ААВ8 и ААВ9), кодирующих микро-/мини-дистрофин [103, 104]. Как уже упоминалось выше, в 2023 году FDA был одобрен препарат Elevidys на основе рекомбинантного капсида ААВrh74 [23].

Болезнь Помпе (болезнь накопления гликогена II) представляет собой мышечное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, вызванное мутациями в гене альфа-глюкозиевой кислоты (GAA), которое в течение многих лет лечили с помощью заместительной ферментной терапии. Заболевание поражает разные органы, в том числе сердце и ЦНС, и эффективность заместительной терапии оказывается недостаточной. В качестве альтернативы предложено использовать ГТ, которая показала эффективность на животных моделях (уменьшение накопления гликогена в миокарде и в мотонейронах) [105]. В настоящее время проводится несколько клинических исследований генозаместительной терапии векторами ААВ различных серотипов (ААВ1, ААВ2/8, ААВ9), несущих ген GAA и предназначенных для внутримышечного или внутривенного введения [104].

Ещё одним нейромышечным заболеванием-кандидатом для ГТ является тяжёлый тип врождённой миопатии — Х-сцепленная миотубулярная миопатия. Введение ААВ с геном миотубуларина (MTM1) собакам вызывало значительное улучшение мышечной силы и выживаемости [106]. Однако в клиническом исследовании у пациентов, получавших высокие дозы ААВ8 с геном MTM1, наблюдалась тяжёлая гепатотоксичность, которая стала причиной двух смертельных исходов. Точные механизмы, которые привели к этим нежелательным явлениям, до конца не известны: возможно, на развитие нежелательных явлений повлияли наличие у пациентов антител к ААВ или сопутствующие заболевания [107].

Развитие методов прямой генной терапии с доставкой в центральную нервную систему

Генная доставка в ЦНС и органы слуха/зрения является сложной задачей. Это связано с тем, что головной мозг, органы зрения, слуха и спинной мозг отделены физиологическими барьерами, такими как ГЭБ, которые сильно ограничивают доступ к ним. Для лечения нейросенсорных расстройств используют интраокулярное, интравитреальное, субконъюнктивальное и другие способы местного введения вектора в органы зрения или в ушную улитку. Для доставки терапевтических генов в мозг чаще всего используют прямую инфузию ААВ, даже несмотря на то, что другие стратегии доставки в спинномозговую жидкость (внутрицеребровентрикулярный, интрацистернальный и интратекальный пути) или в кровоток могут быть полезны для лечения мультифокальных заболеваний.

Местное введение препаратов в ЦНС включает хирургическую процедуру, во время которой пациент находится под анестезией и удерживается внутри стереотаксической рамы, в то время как кончик иглы или гибкий катетер из плавленого кварца вводится непосредственно в паренхиму через трепанационные отверстия, просверленные в черепе. Внутримозговая инъекция ААВ была первым способом векторной доставки. Она до сих используется в большинстве клинических исследований и, как правило, хорошо переносится [94, 108–111].

Интраназальная доставка является альтернативным и неинвазивным вариантом, потенциально подходящим для восстановления уровней терапевтических лизосомальных ферментов, которые после секреции могут диффундировать в ЦНС. Наконец, для лечения некоторых заболеваний двигательных нейронов используют внутримышечные или интраспинальные инъекции ААВ [94].

Местное введение вектора имеет значительные преимущества перед системным: во-первых, это позволяет создать максимальную концентрацию вектора в тканях-мишенях, а во-вторых — уменьшает широту биораспределения и связанные с ней риски иммуногенности и токсичности.

При заболеваниях двигательных нейронов в доклинических условиях на моделях БАС у мышей успешно применяют многоуровневые инъекции в паренхиму спинного мозга [112–114]. Однако трансляция таких подходов на более крупных млекопитающих и в клинических исследованиях затруднена из-за высоких рисков при хирургическом вмешательстве. Помимо риска вирусной или бактериальной инфекции, кровотечения и отёка, присущих любому нейрохирургическому вмешательству, основным ограничением, связанным со стереотаксической инъекцией ААВ, является ограниченное распространение вектора в паренхиме. Для упрощения диффузии вектора на животных моделях применяют технику доставки с усилением конвекции (CED) либо вводят вектор совместно с гепарином [115] или маннитолом [116]. На животных моделях также изучались интравентрикулярный, интрацистернальный и интратекальный пути введения векторов.

Как уже упоминалось, ГЭБ представляет собой сложный биологический барьер из последовательных слоёв эндотелиальных клеток головного мозга, соединённых плотными контактами, перицитов и астроцитов. Попытки нарушить его целостность для упрощения доставки терапевтических средств, например маннитола, связаны со значительными побочными эффектами [116, 117].

Отметим важное наблюдение: в зависимости от возраста организма введённый трансген экспрессируется в различных типах клеток. К примеру, установлено, что при введении вектора новорождённым мышам трансген экспрессируется в нейронах, а взрослым — в астроглии [54]. Сходные результаты были получены и на макаках-резус: после внутривенной инфузии ААВ9 новорождённым животным наблюдалась трансдукция нейронов, а при введении вектора молодым обезьянам трансдуцировалась преимущественно глия [54, 118, 119].

Ещё одним серотипом ААВ, способным проникать через ГЭБ при внутривенном введении, является вариант ААВrh10. Исследование Y. Tanguy и соавт. [120] показало, что эффективность трансдукции ААВrh10 выше, чем у ААВ9, в большей части центральной и периферической нервной системы. Интересно, что распределение ААВrh10 не увеличивалось при увеличении дозы вводимого вектора, тогда как при трансдукции ААВ9 наблюдается дозозависимый эффект. Данный факт свидетельствует о том, что два вектора имеют разные механизмы трансдукции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов являются ведущей платформой для доставки генов и лечения различных заболеваний человека. Использование новых биотехнологических методов для рациональной разработки капсидов аденоассоциированных вирусов и оптимизация дизайна генома внесли существенный вклад в развитие данной области генной терапии. Доклинические и клинические исследования показали эффективность генной терапии с использованием аденоассоциированных вирусов, что в совокупности с данными о безопасности данного типа вирусной доставки генов позволяет называть эти вирусы «идеальным терапевтическим вектором». Изучение природных свойств разных серотипов аденоассоциированных вирусов, а также целенаправленная модификация капсида позволяют эффективно трансдуцировать различные клетки и ткани организма, в том числе нервную. Важным этапом в развитии генной терапии с использованием аденоассоциированных вирусов стала регистрация онасемноген абепарвовека — генотерапевтического препарата для лечения спинальной мышечной атрофии, что послужило хорошим примером для активной разработки аналогичных средств терапии других нейромышечных заболеваний.

Стоит учитывать, что долгосрочные эффекты применения аденоассоциированных вирусов продолжают изучаться как с точки зрения эффективности, так и в отношении вопросов безопасности. Актуальными направлениями развития опосредованной этими вирусами генной терапии является создание новых модификаций капсида, изменение дизайна промоторов и энхансеров, а также изучение новых путей и способов доставки, которые обеспечат специфичный тканевой тропизм, повысят безопасность и позволят с высокой эффективностью лечить нервно-мышечные и нейродегенеративные заболевания.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Поисково-аналитическую работу и подготовку статьи осуществляли в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова. Публикация статьи в журнале проведена по заказу издательства «Эко-Вектор».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Е.А. Слободкина — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; Ж.А. Акопян — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; П.И. Макаревич — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The search and analytical work and the preparation of the article were carried out within the framework of the state assignment of the Lomonosov Moscow State University. The publication of the article in the journal сarried out by order the “Eco-Vector” publishing house.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contribution. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication). E.A. Slobodkina — literature review, collection and analysis of literary sources, writing and editing the article; Jh.A. Akopyan — literature review, collection and analysis of literary sources, writing and editing the article; P.I. Makarevich — literature review, collection and analysis of literary sources, writing and editing the article.

¹ Все отмеченные * лекарства не зарегистрированы в Государственном реестре лекарственных средств Российской Федерации. Режим доступа: https://grls.rosminzdrav.ru/GRLS.aspx

Об авторах

Екатерина Александровна Слободкина

Институт регенеративной медицины (Медицинский научно-образовательный центр Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова); Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: slobodkinaea@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4390-1864
SPIN-код: 5387-9096

канд. биол. наук

Россия, Москва; Москва

Жанна Алексеевна Акопян

Институт регенеративной медицины (Медицинский научно-образовательный центр Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова); Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: akopyanza@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0989-7825
SPIN-код: 4450-0324

канд. мед. наук

Россия, Москва; Москва

Павел Игоревич Макаревич

Институт регенеративной медицины (Медицинский научно-образовательный центр Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова); Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: makarevichpi@my.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8869-5190
SPIN-код: 7259-9180

канд. мед. наук

Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы