Идентификация Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae и Xanthomonas translucens в зерне пшеницы методом ПЦР

Фитосанитарными требованиями крупнейших импортеров российского зерна - Е гипта, Турции, Бангладеша, Нигерии и Пакистана - регулируются возбудители бактериозов зерновых культур Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas syringae и Xanthomonas translucens , что вызывает необходимость в разработке быстрых методов их диагностики. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), зарекомендовавший себя в испытательных лабораториях как самый быстрый и надежный, требует оптимальной подготовки тестируемого материала. Цель исследования - оптимизация процесса подготовки проб семян для последующего выявления и идентификации P. fuscovaginae , P. syringae и X. translucens методом ПЦР. Образцы зерна пшеницы замачивали в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 2 часов и заражали суспензиями культур P. fuscovaginae , P. syringae pv. coronafaciens и X. translucens в различных концентрациях. Затем зараженные образцы зерна измельчали и подвергали двухэтапному центрифугированию. Из полученных аналитических проб выделяли ДНК и проводили видоспецифичную для каждого вида бактерий ПЦР. В результате установлено, что двухчасового замачивания семян и их обработки гомогенизатором достаточно, чтобы эффективно разрушить каждое зерно в пробе и обеспечить выход бактерий в жидкую часть пробы. Первое низкоскоростное центрифугирование позволило эффективно осадить измельченное зерно и удалить лишний крахмал из надосадочной жидкости. Высокоскоростное центрифугирование надосадочной жидкости позволило получить концентрированную микробиоту, содержащуюся в образце зерна. Использование набора для выделения ДНК «Проба-ГС», АгроДиагностика (Россия) позволило получить ДНК достаточного качества для проведения ПЦР. С помощью набора Pseudomonas fuscovaginae-РВ, Синтол (Россия) и праймеров PsyF/PsyR и 4F1/4R 1 успешно обнаружена ДНК P. Fuscovaginae, P. syringae и X. translucens соответственно в каждом из зараженных этими бактериями образце в концентрациях 103 КОЕ/мл. Отмечено отсутствие ингибирования ПЦР при использовании изложенных методов подготовки проб и тестирования. Метод удаления крахмала из проб для молекулярной диагностики фитопатогенов, насколько нам известно, использовался впервые. Применение использованных в работе методов позволит проводить диагностику значимых для экспорта зерна возбудителей бактериозов в течение одного дня.