Молекулярные механизмы гемопоэза дрозофилы

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГО – гемопоэтический орган (lymph glands); ДC – дорсальный сосуд (dorsal vessel); ППГ – препрогемоциты; ПГ – прогемоциты; ПроПГ – промежуточные прогемоциты; ЗСЦ – задний сигнальный центр (posterior signaling center); МЗ – медуллярная зона (medullary zone); КЗ – корковая зона (cortical zone); ПЗ – промежуточная зона (intermediate zone); ПЛ – плазматоциты (PL); КК – кристаллические клетки (СС); ЛМ – ламеллоциты (LM); АФК – активные формы кислорода; АМП – антимикробные пептиды; ВКМ – внеклеточный матрикс; UAS – активирующая последовательность (upstream activation sequence); scRNAseq – секвенирование РНК одиночных клеток (single-cell RNA sequencing); ГСК – гемопоэтические стволовые клетки; СК – стволовые клетки; АМГК – аортально-мезонефрально-гонадный комплекс; Odd – Odd-skiped; Crq – Сroquemort; ТФ – транскрипционный фактор; Antp – Antennapedia; NimC1 – Nimrod C1; Col – Collier; Hth – Homothorax; Tin – Tinman; Pnr – Pannier; FGFR – рецептор фактора роста фибробластов; Htl – Heartless; Dpp – Decapentaplegic; Wg – Wingless; Hh – Hedgehog; Ser – Serrate; Dome – Domeless; E-кад – Е-кадгерин; Vkg – Viking; Hml – Hemollectin; PPO – профенолоксидаза; Lz – Lozenge; Hnt – Hindsight; Fz – Frizzled; Dot – Dorothy; Mad – mothers against dpp; Sd – Scalloped; Ptc – Patched; Ci – Cubitus interruptus; EGFR – рецептор эпидермального ростового фактора; TGF-beta – трансформирующий фактор роста бета; PCP – planar cell polarity; FGF – фактор роста фибробластов; Upd1–3 – Unpaired 1–3; FoxO – forkhead box protein O; Adgf-A – аденозиндезаминаза ростового фактора-A; AdoR – рецептор аденозина; PKA – протеинкиназа A.

ВВЕДЕНИЕ

Плодовая мушка Drosophila melanogaster является модельным организмом, который широко используется в генетических исследованиях в клеточной биологии, биологии развития и иммунологии. Более 100 лет прошло с того момента, когда Томас Хант Морган начал использовать эту модельную систему в генетических исследованиях [1, 2]. При проведении генетических и биомедицинских исследований дрозофила имеет ряд преимуществ, в число которых входят (1) минимальный набор хромосом – всего четыре пары, три из которых (X/Y, II, III) содержат практически все гены данного организма. (2) Полностью секвенированный и аннотированный геном дрозофилы состоит приблизительно из 13767 генов и характеризуется минимальным количеством дуплицированных генов и минимальной генной избыточностью. (3) Хорошо разработаны методы получения мутантных линий дрозофилы – с помощью химического, изотопного, транспозонного (Р-элемент) и CRISPR/Cas9-опосредованного мутагенеза, UAS/Gal4-опосредованной системы условной инактивации экспрессии генов с помощью интерферирующих РНК (RNAi) и эктопической экспрессии генов, а также линий с визуализацией интересующих тканей [3–11]. Методы направленной инактивации гена позволяют использовать подходы обратной генетики, которые заключаются в инактивации интересующего гена с исследованием его фенотипа/функции в живом организме. На дрозофиле можно проводить обширные генетические скрининги с использованием методов прямой генетики: идентификации мутаций и функций гена после обнаружения интересующего фенотипа [12–14], и модифицированных генетических скринингов, направленных на определение генов, вовлеченных в интересующий процесс [15–17]. (4) Международные центры хранения обширных коллекций мутантных линий дрозофилы, включая коллекции генетических делеций, точечных мутаций и линий Р-транспозонов, CRISPR/Cas9, промоторов-Gal4, UAS-RNAi и UAS-трансгенов. (5) Стабильная система поддержания мутаций с помощью балансирующих хромосом и комбинирование мутаций с использованием мейотической рекомбинации. (6) Возможность исследования фенотипа на уровне организма in vivo. (7) Мушка имеет короткий жизненный цикл (30 дней), удобные и относительно недорогие условия содержания и оборудования для поддержания и хранения мутантных линий дрозофилы. Недостатками данной модельной системы являются: (1) огромная эволюционная дистанция между насекомыми и млекопитающими и, соответственно, недостаточная гомология на генетическом и физиологическом уровнях; (2) малый размер организма и трудоемкость работы с тканями дрозофилы; (3) ограниченная возможность использования биохимических и иммунохимических методов.

В качестве модельной системы дрозофила интенсивно используется в течение последних 50 лет практически во всех областях современной биологии, начиная с расшифровки молекулярного механизма апоптоза и заканчивая механизмами старения [3, 18–23]. В свою очередь, данная система широко используется для исследования молекулярных механизмов кроветворения, или гемопоэза и гуморального и клеточного ответов врожденного иммунитета. Термин кроветворение, или гемопоэз, обозначающий процесс образования, развития и созревания клеток крови, исторически относится к клеткам крови позвоночных животных. Гемопоэз позвоночных теплокровных животных поддерживается гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК), которые дают начало ряду мультипотентных и ограниченных гемопоэтических предшественников, дифференцирующихся во все виды клеток крови: эритроциты, тромбоциты, лейкоциты и лимфоциты. У беспозвоночных целомических организмов, к которым относится дрозофила, внутренняя полость тела содержит целомическую жидкость, или гемолимфу, содержащую гемоциты – аналоги клеток крови теплокровных организмов [24–27]. Гемопоэз дрозофилы — это процесс поддержания мультипотентных прогениторных клеток и их дифференцировки в три типа зрелых гемоцитов, происходящий в нескольких частях организма в течение стадий жизненного цикла. Важно отметить, что гемоциты насекомых функционально гомологичны миелоидным клеткам врожденного иммунитета позвоночных, параллельно возникшим в эволюции [28].

Двукрылые насекомые имеют четыре стадии жизненного цикла: эмбриональную, личиночную, стадии куколки и имаго. Основными биологическими функциями гемоцитов дрозофилы являются защитная, включающая неспецифические гуморальный и клеточный иммунные ответы, участие в регенеративных процессах, а также функция чистильщика от погибших клеток в процессе онтогенеза. У дрозофилы известны три линии зрелых клеток гемолимфы: плазматоциты, кристаллические клетки и ламеллоциты. На личиночной стадии наблюдается значительный рост и морфогенетические изменения организма, сопровождающиеся активной защитой от патогенных микроорганизмов. На этой стадии, которая широко используется для исследования гемопоэза, процесс гемопоэза происходит в гемопоэтическом органе (ГО), в котором можно наблюдать временную и пространственную динамику поддержания прогениторных клеток и их дифференцировки во все типы зрелых гемоцитов. Изучение гемопоэза дрозофилы показало, что механизм поддержания мультипотентных предшественников гемоцитов у дрозофилы и ГСК у млекопитающих существенно различается. Гемопоэтическая система дрозофилы не имеет (или пока не обнаружены) bona fide мультипотентных стволовых клеток, аналогичных клеткам позвоночных, у которых такие клетки поддерживаются на протяжении всей жизни. Использование преимуществ генетической модельной системы дрозофилы позволило существенно продвинуться в расшифровке и понимании молекулярных механизмов гемопоэза. Исследования двух последних десятилетий показали, что молекулярные механизмы поддержания прогениторных клеток и их дифференцировки в различные линии гемоцитов имеют некоторую аналогию с путями регуляции процессов дифференцировки миелоидных клеток млекопитающих [27, 29]. На сегодняшний день опубликован ряд исчерпывающих обзорных статей, освещающих многие вопросы данной области исследования [27, 29–34]. В настоящем обзоре обсуждаются основные достижения в исследовании молекулярных механизмов кроветворения в гемопоэтическом органе дрозофилы, что включает регуляцию поддержания мультипотентных прогениторных клеток и их дифференцировки с помощью транскрипционных факторов, сигнальных путей, метаболических и внешних факторов.

УЧАСТКИ ГЕМОПОЭЗА ДРОЗОФИЛЫ

Образование ранних клеток-предшественников, или препрогемоцитов, дрозофилы происходит в двух независимых участках мезодермы эмбриона – в головной и дорсальной мезодерме. Соответственно, кроветворение у дрозофилы происходит двумя независимыми путями или «волнами». В первом случае клетки головной мезодермы раннего эмбриона дают начало прогемоцитам эмбриона, которые далее поддерживаются и дифференцируются в зрелые линии гемоцитов, находящиеся в свободной циркуляции гемолимфы и называются циркулирующими гемоцитами [35–38]. Прогемоциты и их производные данного происхождения поддерживаются в циркулирующей гемолимфе на всех последующих стадиях жизненного цикла насекомого. Вторая волна гемопоэза происходит в дорсальной мезодерме, где формируется дорсальный «кровеносный» сосуд, или «аорта» (ДC, dorsal vessel), и гемопоэтический орган (первоначально названный lymph gland) (рис. 1), однако термин ГО наиболее точно соответствует данному органу [39–41]. ГО представлен парным тканевым образованием, состоящим из гемоцитов и их предшественников, ограниченных оболочкой внеклеточного матрикса. На личиночной стадии ГО является главным местом поддержания прогемоцитов и их дифференцировки в зрелые гемоциты. При этом гемоциты не покидают ГО до начала стадии куколки. Параллельно в гемолимфе на протяжении всех личиночных стадий находятся все типы циркулирующих гемоцитов. ГО распадается на начальной стадии куколки и высвободившиеся из него гемоциты смешиваются с циркулирующими гемоцитами. Таким образом, прогемоциты и гемоциты, происходящие из обеих участков мезодермы, сосуществуют на постличиночных стадиях жизненного цикла дрозофилы [36, 38, 42, 43].

Рис. 1. А – схема строения гемопоэтического органа или лимфатических желез (lymph gland) третьей личиночной стадии дрозофилы. ГО состоит из парных передних долей и парных задних долей, прикрепленных и взаимодействующих с клетками дорсального сосуда и клетками перикардия. Передние доли ГО являются модельной системой исследования гемопоэза дрозофилы. Передняя доля ГО состоит из популяции клеток заднего сигнального центра (ЗСЦ) или гемопоэтической ниши; медуллярной зоны, состоящей из популяций препрогемоцитов (ППГ) и прогемоцитов (ПГ); кортикальной зоны, состоящей из дифференцированных гемоцитов: плазматоцитов (ПЛ), кристаллических клеток (КК) и ламеллоцитов (ЛМ); и популяции промежуточных прогемоцитов (ПроПГ) промежуточной зоны (ПЗ). Б – схема генеза гемопоэтического органа. На ранней эмбриональной стадии клетки кардиогенной мезодермы, или гемангиобласты (ГАБ), дают начало клеткам гемопоэтической линии (ГЛ) и клеткам-предшественникам сердечно-сосудистой системы – кардиобластам (КБ). На последующих стадиях эмбриогенеза клетки гемопоэтической линии кардиогенной мезодермы формируют три пары грудных сегментов (thoracic segments). Передние два сегмента сливаются и дают начало препрогемоцитам (ППГ) и всем гемоцитам передней доли ГО, тогда как третий задний сегмент дает начало клеткам гемопоэтической ниши ЗСЦ (выделено зеленым). На первой личиночной стадии передние доли ГО содержат препрогемоциты, прогемоциты и клетки ЗСЦ. На второй личиночной стадии начинается дифференцировка прогемоцитов в промежуточные прогемоциты, которые дифференцируются в плазматоциты и кристаллические клетки, формируя кортиковую зону ГО (цветами выделены соответствующие линии гемоцитов как отмечено на панели Б'). На третьей личиночной стадии продолжается процесс дифференцировки ППГ в терминально дифференцированные линии гемоцитов, соответственно сопровождающийся ростом кортикальной зоны ГО. При этом прогемоциты МЗ поддерживаются в митотически покоящемся состоянии. Б' – схема гемопоэза, происходящего в гемопоэтическом органе дрозофилы. Указаны гемопоэтические прогениторные клетки и линии дифференцированных гемоцитов, в скобках указаны аббревиатуры подтипов соответствующих линий гемоцитов, обнаруженных с помощью метода scRNAseq.

ГЕМОЦИТЫ ДРОЗОФИЛЫ

Зрелые гемоциты дрозофилы представлены тремя морфологически различными типами. Плазматоциты (ПЛ) – фагоцитарные клетки, осуществляющие защитные, антимикробные и регуляторные функции, составляют примерно 90–95% гемоцитов. Кристаллические клетки (КК) – нефагоцитирующие клетки, составляющие 2–5% гемоцитов, принимают участие в процессах заживления ран, реакциях врожденного иммунитета и гипоксии. Третий тип гемоцитов – ламеллоциты (ЛМ) – гигантские специализированные клетки, которые дифференцируются только в ответ на внедрение паразитарных организмов или в ответ на повреждение тканей (рис. 1Б'). Эти типы клеток были выявлены в результате ультраструктурных исследований, а затем подтверждены по функциональной активности и молекулярным маркерам. На основании обширных исследований определены сигнальные пути и транскрипционные факторы, обеспечивающие спецификацию, дифференцировку и поддержание данных клеточных линий (см. обзоры [27, 29, 32]). Кроме того, с помощью метода секвенирования РНК единичных клеток (single-cell RNA sequencing, scRNAseq) обнаружено большое разнообразие подгрупп циркулирующих гемоцитов. С помощью нескольких экспериментальных подходов определены восемь подгрупп гемоцитов, выполняющих различные функции [44–47]. В ГО были идентифицированы также ранее не описанные типы клеток: ранние предшественники, или препрогемоциты (ППГ), и подтип плазматоцитов – адипогемоциты [43]. Однако на сегодняшний день многие недавно идентифицированные подгруппы гемоцитов остаются недостаточно охарактеризованными, и их молекулярные и функциональные особенности нуждаются в дальнейшем изучении.

Плазматоциты

Плазматоциты – основной тип клеток крови дрозофилы, осуществляющих защитные, иммунные и гомеостатические функции. Эти клетки представляют собой фагоциты, они участвуют в инактивации патогенных микроорганизмов и утилизации апоптотических клеток в процессе развития организма [26, 48–50]. Плазматоциты осуществляют фагоцитоз посредством рецепторов Сroquemort (Crq), Eater и Nimrod C1 (NimC1) [51–54] и выполняют защитные функции, секретируя антимикробные пептиды (АМП) (рис. 1Б', табл. 1) [55–57]. Данные клетки секретируют белки внеклеточного матрикса (ВКМ), коллаген IV, перлекан и ламинин А, способствуя формированию тканей [58, 59], а также фермент пероксидазин (Peroxidasin, Pxn) [60], удаляющий свободные радикалы. Отсутствие плазматоцитов в процессе эмбриогенеза вызывает дефекты органогенеза, ведущие к снижению жизнеспособности эмбрионов [61–64]. Идентификация с помощью scRNAseq молекулярных маркеров позволила выделить четыре подтипа плазматоцитов: PL1–4 (рис. 1Б') [43].

Таблица 1. Молекулярные маркеры и гены, вовлеченные в спецификацию и поддержание линий гемоцитов в процессе гемопоэза дрозофилы

Примечание. В столбцах 3 и 5 указаны гены человека, гомологичные соответствующим генам дрозофилы, указанным в столбцах 2 и 4. Синим отмечены гены, кодирующие негативные регуляторы соответствующих процессов гемопоэза.

Кристаллические клетки

Кристаллические клетки содержат, как следует из их названия, кристаллы профенолоксидаз 1 и 2 (PPO1 и 2), которые участвуют в реакции меланизации. Эти клетки вовлечены в защитные реакции при повреждении тканей, а также во врожденном иммунном ответе, в первую очередь, за счет активации биохимического каскада меланизации [65–68], функционально схожего с каскадом тромбообразования у млекопитающих. При меланизации наблюдается потемнение и отвердение поврежденных тканей, что сопряжено с продукцией активных форм кислорода (АФК), способствующих нейтрализации патогенов и заживлению поврежденных тканей (рис. 1Б') [55, 65, 66, 69]. Подавление меланизации задерживает заживление поврежденных тканей [70–72] и снижает восприимчивость к микробным инфекциям [65, 66]. КК не обладают фагоцитирующей активностью, они экспрессируют специфические молекулярные маркеры и пролиферируют под действием определенных сигналов (см. далее, рис. 1Б', табл. 1). С помощью scRNAseq выявлены два подтипа кристаллических клеток: СС1 и 2 [43].

Ламеллоциты

Ламеллоциты – это большие плоские клетки, дифференцировка которых индуцируется вследствие сигналов, вызванных внедрением паразитарных организмов или при повреждении тканей. Клеточный иммунный ответ у дрозофилы опосредуется именно ламеллоцитами и в основном направлен на инактивацию яиц паразитических ос (Leptopilina boulardi) посредством их инкапсуляции [73, 74]. Плазматоциты прикрепляются к поверхности инородного объекта, а затем дифференцируются в ламеллоциты [75]. Зрелые ламеллоциты экспрессируют специфичные молекулярные маркеры, они не способны делиться и фагоцитировать (рис. 1Б', табл. 1) [13, 26, 30, 51, 55, 66, 75–81]. При помощи scRNAseq в ГО выявлены два подтипа ламеллоцитов: LM1 и 2 [43].

Особенности стволовых клеток гемопоэтической системы дрозофилы: прогемоциты

Гемопоэтические стволовые клетки млекопитающих являются мультипотентными стволовыми клетками взрослого организма, способными к самообновлению и дифференцировке во все типы клеток крови. ГСК находятся в митотически покоящемся состоянии в гемопоэтических нишах, в костном мозге и других участках кроветворения, где под действием внешних факторов происходит их асимметричное деление, дальнейшее самообновление и дифференцировка [82–85]. ГСК способны к повторному заселению ниш и восполнению всего репертуара клеток крови. У дрозофилы к стволовым клеткам, способным к самообновлению на протяжении всей жизни, относятся мужские и женские стволовые клетки зародышевой линии, стволовые клетки кишечника и нейрональные стволовые клетки [86–89]. На сегодняшний день у дрозофилы не выявлены bona fide ГСК, но определены ранние мультипотентные прогениторные клетки или препрогемоциты, которые поддерживаются посредством сигналов из гемопоэтической ниши ГО и клеток ДС. Эти клетки активно пролиферируют и дают начало более дифференцированным клеткам: прогемоцитам. Прогемоциты находятся в митотически спокойном состоянии, они способны дифференцироваться во все типы гемоцитов [32, 38, 43, 90, 91]. Не установлено, способны ли препрогемоциты или прогемоциты к асимметричному делению [92, 93], в результате которого образуются стволовая и дифференцирующаяся дочерние клетки. Короткая продолжительность жизни дрозофилы и отсутствие необходимости поддержания и возобновления большого количества клеток крови говорят в пользу того, что механизм поддержания гемопоэтических прогениторных клеток у этого организма принципиально отличается от механизма у ГСК позвоночных.

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЙ ОРГАН ДРОЗОФИЛЫ: ЗОНЫ, КЛЕТКИ И МАРКЕРЫ

Генез гемопоэтического органа

С помощью клонального анализа установлено, что клетки-предшественники ГО и ДC образуются из общих клеток-предшественников, или так называемых гемангиобластов. В результате деления этих клеток образуются две дочерние клетки, одна из которых предшественник клеток сердечно-сосудистой системы (кардиобласты), дифференцирующихся в клетки ДC, а другая – предшественник клеток гемопоэтической линии, дающих начало гемоцитам [94]. Аналогичный механизм, вероятно, наблюдается у гемангиобластов аортально-мезонефрально-гонадного комплекса (АМГК) позвоночных, дающих начало клеткам гемопоэтической и сосудистой систем [95]. ГО образуется из трех грудных сегментов T1–T3, экспрессирующих ТФ Odd-skiped (Odd) и фактор GATA Serpent (Srp) (рис. 1, табл. 1) [94]. При этом под действием фактора Antennapedia (Antp) клетки сегмента T3 формируют так называемый задний сигнальный центр (ЗСЦ, posterior signaling center, PSC), состоящий примерно из 30–40 клеток (рис. 1Б) [96]. Эти клетки являются гемопоэтической нишей, контролирующей гемопоэз в ГО личинок [97]. В поддержании клеток ЗСЦ также участвует ТФ Collier (Col), который контролируется Antp [96, 97]. Сегменты T1–T2 формируют первичные доли ГО под действием кофактора Homothorax (Hth) (рис. 1Б) [96]. Для формирования клеток ГО необходимы гены факторов транскрипции Tinman (Tin) и GATA Pannier (Pnr), лиганд морфогена Decapentaplegic (Dpp) и рецептор фактора роста фибробластов Heartless (Htl). Кроме того, сигнальный путь Wnt/Wingless (Wnt/Wg) положительно регулирует спецификацию кардиогенной мезодермы [94].

СТРОЕНИЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОГО ОРГАНА

ГО – это парный орган, состоящий из четырех долей, расположенных вдоль аорты (рис. 1А). Основной является наибольшая передняя, или первичная доля. В ней происходят координированные процессы поддержания препрогемоцитов, прогемоцитов и их пролиферация и дифференцировка. Наименее изучены вторичные, третичные и четвертичные доли, они в несколько раз меньше и служат дополнительным источником гемоцитов при активации клеточного иммунного ответа [98]. Передняя доля ГО – наиболее структурированная часть органа, ее используют в качестве модели или основного объекта для изучения молекулярных механизмов гемопоэза у дрозофилы [41], и она, в частности, носит название ГО.

В передней доле ГО выделяют несколько зон, каждая из которых содержит функционально разные типы клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки: (1) ЗСЦ, функционирующая как ниша для регуляции самообновления и дифференцировки прогемоцитов; (2) медиально расположенная медуллярная или внутренняя зона (МЗ, medullary zone), состоящая из препрогемоцитов и прогемоцитов; (3) дистально расположенная корковая зона (КЗ, cortical zone), непосредственно в которой происходит дифференцировка и накопление зрелых гемоцитов (рис. 1) [41]; (4) промежуточная зона (ПЗ, intermediate zone), расположенная между медуллярной и кортикальными зонами, которая содержит промежуточные прогемоциты (ПроПО), экспрессирующие как маркеры прогемоцитов, так и маркеры зрелых гемоцитов (рис. 1 и 2, табл. 1) [43, 93, 99, 100].

Рис. 2. Схема участия и взаимодействия основных сигнальных путей в регуляции гемопоэза дрозофилы в гемопоэтическом органе. Поддержание и пролиферация клеток гемопоэтической ниши ЗСЦ (отмечено зеленым цветом) положительно контролируется Wg/Fz2/Myc и негативно контролируется Dpp/TGFβ. Поддержание и пролиферация препрогемоцитов (ППГ, серый) положительно контролируется сигналами Dpp, Notch, Pvf2/Pvr. Поддержание прогемоцитов (ПГ, синий) положительно контролируется сигналами Hh/PKA/Ci из гемопоэтической ниши, аутокринными сигналами Wnt/Fz/Fz2 и Ca2+ и негативно контролируется сигналом Adgf-A, идущим из дифференцированных гемоцитов КЗ (отмечено оранжевым цветом). Клетки ЗСЦ положительно контролируют экспрессию Adgf-A, посредством активации Pvr и STAT в дифференцированных гемоцитах КЗ, являясь звеном равновесного сигнала между клетками ниши ЗСЦ и зрелыми гемоцитами, контролирующими поддержание ПГ. Промежуточные прогемоциты (ПроПГ) обозначены желтым цветом. Дифференцировка и пролиферация плазматоцитов (ПЛ) положительно регулируется FGF/Htl/Ras и АФК/JNK/FoxO, кристаллических клеток (КК) – Ser/Notch, ламеллоцитов (ЛМ) – Spi/EGFR, Jak/Stat и АФК/JNK/FoxO (см. детали в тексте)

Как отмечено выше, первой зоной, возникающей как отдельная клеточная популяция, является ЗСЦ. Клетки ЗСЦ регулируют поддержание и дифференцировку прогемоцитов в первичной доле ГО на протяжении личиночных стадий. Эти клетки выполняют только сигнальные функции и не дифференцируются в гемоциты [43, 91, 96, 101–104]. Клетки ЗСЦ экспрессируют следующие молекулярные маркеры: Antp, Col, лиганд сигнального пути Hedgehog (Hh), лиганд рецептора Serrate (Ser) сигнального пути Notch (N), лиганд Wg сигнального пути Wg/Wnt (рис. 2, табл. 1) [96, 97, 99, 105].

До середины второй личиночной стадии в передней доле ГО представлены только прогемоциты Dome⁺, экспрессирующие репортер Domeless-Gal4 (Dome-Gal4), и популяция препрогемоцитов, не экспрессирующих данный репортер Dome^- (см. далее). Прогемоциты Dome⁺ поддерживаются на второй и третьей личиночных стадиях и дифференцируются в зрелые гемоциты, формируя КЗ [6, 41, 90, 91, 99, 106]. Определенная популяция прогемоцитов ГО способна самообновляться, одновременно продуцируя зрелые гемоциты [90]. С помощью клонального анализа показано, что в непосредственной близости к ЗСЦ могут находиться гемопоэтические «стволовые» клетки дрозофилы [90, 91]. Присутствие данной клеточной популяции, именуемой препрогемоциты, или PH1, подтверждено с помощью анализа scRNAseq [43]. Однако, как уже ранее указывалось, у «стволовых» клеток дрозофилы не описана функция самообновления и асимметричного деления, характерного для ГСК млекопитающих [92, 93, 107]. На первой личиночной стадии препрогемоциты Dome^- находятся в непосредственном соприкосновении с дорсальной аортой и ЗСЦ. Предполагается, что эти клетки дают начало прогемоцитам Dome⁺ [41, 43, 90, 91]. На первой и ранней второй личиночной стадиях происходит активный рост и деление прогемоцитов Dome⁺ [41, 91]. С использованием scRNAseq показано, что прогемоциты Dome⁺ являются гетерогенной популяцией, состоящей из двух подтипов клеток (PH2,3), что, вероятно, отражает иерархию их дифференцировки [43].

Пролиферация прогемоцитов Dome⁺ значительно снижается к середине второй личиночной стадии. При этом клетки на дистальном крае МЗ начинают дифференцироваться, что сопровождается снижением пролиферации, повышением гранулярности и отсутствием экспрессии Е-кадгерина (E-кад). Клетки МЗ, или прогемоциты Dome⁺, характеризуются высоким уровнем экспрессии лиганда Upd3 (сигнальный путь JAK/STAT), лиганда Wg, E-кад и АФК [41, 99, 100, 108] и низким уровнем экспрессии Col [102, 109, 110]. Белки внеклеточного матрикса (ВКМ), в том числе коллаген типа IV (Viking, Vkg) и перлекан Trol, имеют повышенную локализацию между клетками МЗ [106, 111].

Плазматоциты в КЗ экспрессируют следующие маркеры: Pxn, гемолектин (Hemollectin, Hml), Eater, антиген P1 или Nimrod-C (NimC) (рис. 1Б’, табл. 1) [41, 56, 81, 99, 112, 113]. С помощью scRNAseq в кортикальной зоне ГО идентифицированы четыре подтипа плазматоцитов [43]. Кристаллические клетки экспрессируют такие факторы транскрипции, как Lozenge (Lz) с Runt-доменом, Hindsight (Hnt), Sima/Hif-α, рецептор Frizzled2 (Fz2), PPO1 и PPO2 [65, 78, 114–116]. В норме без воздействия патогенных факторов ламеллоциты практически не образуются в КЗ. В ГО дифференцируются два подтипа ламеллоцитов, экспрессирующих L1/Atilla, Misshapen, интегрин α-PS4 и его партнер Myospheroid (рис. 1Б', табл. 1) [10, 43, 51, 55, 77, 80, 117].

Между прогемоцитами Dome⁺ и дифференцирующимися клетками Pxn⁺ медуллярной и кортикальных зон находится популяция клеток, которые одновременно экспрессируют маркеры обеих зон – это промежуточные прогемоциты (ПроПГ), которые представляют так называемую промежуточную зону (рис. 1, табл. 1) [34, 93, 99, 100, 118]. ПроПГ экспрессируют ранние маркеры дифференцировки Hml и Pxn, однако не экспрессируют зрелые маркеры плазматоцитов (P1) и кристаллических клеток (PPO1 и 2) [106], а также перестают экспрессировать Е-кадгерин. Последние исследования, проведенные методом scRNAseq, позволили более подробно охарактеризовать данную зону, в которую включили четыре стадии промежуточных прогемоцитов (PH4–6), ранние плазматоциты (PL1) и ранние кристаллические клетки (CC1) [43]. Показано также, что клетки популяции ПроПГ, характеризующиеся активацией митоза, дифференцируются в плазматоциты и КК под действием активации сигнальных путей: Ras/Raf или Ser/Notch соответственно [118]. Молекулярные механизмы, регулирующие данную популяцию, наименее охарактеризованы и требуют дальнейшего изучения.

СИГНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В ПОДДЕРЖАНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ПРЕПРОГЕМОЦИТОВ

В начале первой личиночной стадии в ГО находится популяция мультипотентных препрогемоцитов, представляющих собой самую раннюю постэмбриональную популяцию гемопоэтических препредшественников, которые, вероятнее всего, исчезают позднее первой личиночной стадии [91]. Для данных клеток характерно отсутствие экспрессии маркера прогемоцитов Dome, низкий уровень экспрессии маркера Dorothy (Dot) и активация сигнального пути Notch (Notch-GAL4, Su(H)-lacZ) и его целевого гена enhancer of split mβ (E(spl)mβ) (рис. 1, табл. 1) [43, 91]. Показано, что, помимо Notch, поддержание данных клеток регулируется лигандом-морфогеном Dpp, который секретируется клетками ниши ЗСЦ. Инактивация Dpp в ЗСЦ или подавление функции ТФ mothers against dpp (Mad) в препрогемоцитах Notch⁺ вызывает существенное уменьшение размера ГО к 3-й личиночной стадии. Таким образом, активация сигнальных путей Notch и Dpp необходима для пролиферации препрогемоцитов. Далее на 2-й и 3-й личиночных стадиях Dome^- препрогемоциты начинают экспрессировать ТФ Hand и Scalloped (Sd) [119]. Обнаружено, что эти клетки также экспрессируют лиганд Pvf2 рецептора Pvr (гомолог рецепторов PDGF/VEGF человека), и его экспрессия зависит от активности Sd. Инактивация Pvf2 в данных клетках ведет к подавлению их пролиферации и к существенному последующему снижению размера ГО. При этом эктопическая экспрессия Pvf2 в этих клетках восстанавливает пролиферативный дефект в ГО, частично утративших функцию Sd [119].

Показано также, что в поддержании ранних прогемоцитов Dome⁺ участвует кальций/кальмодулиновый сигнальный путь, который активируется через ионотропный рецептор γ-аминомасляной кислоты (ГАМКC-рецептор, GABABR). GABABR экспрессируется в клетках ЗСЦ. Кальций/кальмодулиновый путь в ЗСЦ участвует в регуляции пролиферации препрогемоцитов на ранних личиночных стадиях, не влияя на дифференцировку гемоцитов на третьей личиночной стадии. Нарушение кальций/кальмодулинового сигнального пути в клетках ЗСЦ вызывает значительное снижение пролиферации препрогемоцитов [120]. Таким образом, эти данные указывают, что в поддержании и пролиферации ранних препрогемоцитов Dome^- участвуют несколько сигнальных путей: сигнальные пути Notch, Dpp, Pvf2/Pvr (рис. 2). Интересно, что вовлеченность сразу нескольких сигнальных путей в регуляцию одного процесса может указывать на сложную систему регуляции и возможность взаимной компенсации разных сигнальных путей. Следует отметить, что технические сложности работы с ГО на первой личиночной стадии и недостаток маркеров затрудняют изучение популяций клеток Dome^-Sd⁺ и Dome^-Notch⁺ [91].

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ ПОДДЕРЖАНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ПРОГЕМОЦИТОВ

Как уже отмечалось, прогемоциты являются мультипотентными предшественниками всех типов гемоцитов. Поддержание мультипотентности и митотического покоя данных прогемоцитов контролируется множеством сигналов, происходящих из трех разных источников (рис. 2). Сигналы первого типа – это сигналы цитокинов и ростовых факторов, секретируемых клетками сигнальной ниши ЗСЦ. Второй тип сигналов – это аутокринные или паракринные сигналы, возникающие и принимаемые одной и той же популяцией клеток в МЗ ГО. Третий тип – сигналы от дифференцированных клеток кортикальной зоны ГО, направленные на поддержание и дифференцировку прогемоцитов МЗ. К четвертому типу можно отнести системные сигналы, исходящие от различных тканей вне гемопоэтического органа, которые образуются в ответ на воздействия внешней среды и воспринимаются через нишу ЗСЦ.

Характерной особенностью прогемоцитов МЗ является строго скоординированный контроль их пролиферации. На первой и ранней второй личиночной стадии практически все клетки ГО, исключая препрогемоциты и клетки ниши ЗСЦ, являются прогемоцитами Dome⁺ (рис. 1Б). На этих стадиях данные клетки интенсивно пролиферируют асинхронно. Затем, с началом появления дифференцированных клеток в поздней фазе второй личиночной стадии пролиферация прогемоцитов резко замедляется. Далее при формировании КЗ прогемоциты Dome⁺ практически перестают пролиферировать, в то время как клетки ПЗ и КЗ имеют более высокую скорость пролиферации на протяжении всей третьей личиночной стадии [41]. Таким образом, низкая скорость пролиферации и ее контроль коррелируют с поддержанием мультипотентного состояния прогемоцитов. Как уже отмечалось, известны четыре типа сигналов, необходимых для поддержания прогемоцитов дрозофилы: аутокринный сигнал, сигналы, исходящие из ниши ЗСЦ и от дифференцирующихся клеток, а также сигналы от других тканей организма. Потеря любого из этих сигналов ведет к потере мультипотентности прогемоцитов, вызывая их пролиферацию и, как следствие, дифференцировку [96, 103]. Важной особенностью прогемоцитов является корреляция между их пролиферацией и дифференцировкой. На сегодняшний день появляется все больше данных, указывающих, что только пролиферирующие прогемоциты способны принимать сигналы дифференцировки, в то время как покоящиеся прогемоциты не воспринимают данные сигналы. Исследование механизмов, регулирующих пролиферативную активность промежуточных прогемоцитов, должно способствовать большему пониманию данного вопроса.

СИГНАЛЫ, ИСХОДЯЩИЕ ИЗ НИШИ ЗАДНЕГО СИГНАЛЬНОГО ЦЕНТРА, РЕГУЛИРУЮТ ПОДДЕРЖАНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ПРОГЕМОЦИТОВ

Центральная роль сигнального пути Hh/Ptc/Ci в поддержании мультипотентного состояния прогемоцитов

Клетки ЗСЦ выполняют роль гемопоэтической ниши в ГО, они секретируют ряд сигнальных лигандов или ростовых факторов, при этом практически не экспрессируют соответствующие рецепторы. В то же время рецепторы данных лигандов экспрессируются в прогемоцитах, и инактивация соответствующих лигандов в клетках ЗСЦ подавляет поддержание прогемоцитов МЗ, вызывая их дифференцировку.

Лиганд Hh, связываясь со своим рецептором Patched (Ptc), вызывает активацию ТФ Cubitus interruptus (Ci). Hh экспрессируется исключительно в клетках ЗСЦ в ходе второй и третьей личиночных стадий (рис. 1, табл. 1). В то время как в прогемоцитах Dome⁺ на высоком уровне экспрессируется Ptc и активированный Ci, инактивация Hh не влияет на клетки ЗСЦ, но стимулирует дифференцировку прогемоцитов Dome⁺ во все три типа гемоцитов [96, 97, 102–104, 121–124]. Кроме того, подавление функции Ci вызывает дифференцировку прогемоцитов, подобно инактивации Hh в клетках ЗСЦ (рис. 2) [96, 121]. Этот процесс осуществляется в том числе за счет морфологических особенностей клеток ЗСЦ, протяженные псевдоподии которых проходят через несколько слоев прогемоцитов, что позволяет доставить лиганд глубоко внутрь медуллярной зоны [96, 102]. Показано также, что абляция клеток ЗСЦ с помощью индукции апоптоза не вызывает ожидаемой дифференцировки прогемоцитов, наблюдаемой при инактивации Hh [109, 110, 121]. Однако установлено, что популяция прогемоцитов Dome⁺ гетерогенна. Часть клеток Dome⁺ (Odd⁺ Col^-) отвечает на сигнал Hh, тогда как клетки Odd⁺ Col⁺ не чувствительны к данному сигналу [110, 121]. В связи с этим предполагается, что абляция клеток ЗСЦ не затрагивает отдельные прогемоциты. Возможно, что клетки Col⁺ являются отдельной популяцией прогемоцитов, которая контролируется сигналами из клеток дорсального сосуда [91, 119]. Установлено также, что ДС выполняет функцию дополнительной ниши. Так, лиганд Branchless (Bnl) (гомологичный фактору роста фибробластов, FGF), продуцируемый клетками ДС, активирует сигнальный путь FGF в прогемоцитах. Активация этого пути регулирует уровень внутриклеточного кальция и способствует поддержанию прогемоцитов в недифференцированном состоянии [125].

Подавление функции гена Roundabout (Robo) увеличивает количество клеток ЗСЦ, а также вызывает их распространение вглубь гемопоэтического органа. Эти события коррелируют со снижением дифференцировки плазматоцитов и кристаллических клеток [126]. При этом в ответ на патогенное вмешательство в клетках ЗСЦ происходит подавление активности фактора NF-kappaВ Relish сигнального пути Imd. Инактивация Relish проявляется нарушением цитоскелета клеток ЗСЦ в результате активации киназы Jun, что приводит к удерживанию лиганда Hh, тем самым нарушая поддержание прогемоцитов, вызывая их преждевременную дифференцировку и активацию клеточного иммунного ответа [127]. Показано также, что подавление передачи сигналов Ca²⁺ или нарушение межклеточных контактов между клетками ЗСЦ влияет на функции данных клеток и вызывает преждевременную дифференцировку прогемоцитов [128].

АФК регулирует дифференцировку ламеллоцитов через активацию сигнальных путей Spitz/EGFR и Toll/Dif в нише ЗСЦ

Помимо регуляции гемопоэза в ГО, клетки ЗСЦ регулируют дифференцировку ламеллоцитов внутри и вне ГО. Так, абляция клеток PSC при инактивации Col или индукции апоптоза предотвращает дифференцировку ламеллоцитов в ответ на заражение паразитическими осами [97, 109]. С помощью генетических методов установлено, что такое заражение приводит к существенному повышению уровня АФК в ЗСЦ и именно АФК являются ключевым сигналом, вызывающим дифференцировку ламеллоцитов [129]. В клетках ЗСЦ АФК в норме не детектируются, однако при заражении паразитическими осами уровень АФК в них резко возрастает. Искусственное повышение уровня АФК в клетках ЗСЦ за счет подавления работы дыхательной цепи митохондрий также приводит к масштабному увеличению количества ламеллоцитов в циркуляции и ГО [129]. При этом в обоих случаях удаление АФК с помощью митохондриальной супероксиддисмутазы 2 (SOD2) или каталазы подавляет образование ламеллоцитов в ГО и циркуляции. Кроме того, активация сигнального пути киназа Akt (Akt1)/FoxO в клетках ЗСЦ, усиливающего антиоксидантный ответ, также отменяет генерацию ламеллоцитов. Показано, что АФК активирует сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), обеспечивая дифференцировку ламеллоцитов. Инактивация Spitz (лиганд EGFR) в клетках ЗСЦ или функции EGFR в гемоцитах подавляет образование ламеллоцитов (рис. 2) [129]. Функции белков Star и Rhomboid, непосредственно участвующих в переносе, расщеплении и активации лиганда Spitz (переводят его в растворимую форму), необходимы для индукции ламеллоцитов. Помимо этого, высокий уровень АФК активирует сигнальный путь Toll в клетках ЗСЦ, что также способствует индукции ламеллоцитов в ответ на воздействие паразитических ос [130]. Потеря компонентов сигнального пути Toll посредством инактивации Dif и pelle нарушает образование ламеллоцитов. Наряду со множеством вопросов о природе генерации АФК в клетках ЗСЦ и сигналов в ответ на инвазию паразитарных организмов, нерешенным остается и вопрос взаимодействия сигнальных путей Spitz/EGFR и Toll/Dif в клетках ЗСЦ в регуляции дифференцировки ламеллоцитов.

ЛОКАЛЬНЫЕ СИГНАЛЫ, ПОДДЕРЖИВАЮЩИЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ СВОЙСТВА ПРОГЕМОЦИТОВ

Сигнальный путь Wg/Wnt/β-катенин поддерживает прогемоциты в мультипотентном состоянии

Одним из важных сигнальных путей, участвующих в поддержании мультипотентности и самообновлении гемопоэтических стволовых клеток млекопитающих, является сигнальный путь Wnt/β-катенин. Сигналы лигандов Wnt действуют как аутокринным, так и паракринным способом. В последнем случае лиганды секретируются из клеток гемопоэтической ниши и способствуют поддержанию идентичности ГСК. У дрозофилы, как и у млекопитающих, известно несколько генов, кодирующих лиганды Wnt (Wg, Wnt-2, -3/5, -4, -6, -8, -10), и два гена, кодирующих их рецепторы Fz и Fz2. Лиганды, связываясь с рецепторами, вызывают активацию или канонического пути через активацию ТФ β-катенина (Armadillo, Arm), или неканонического сигнального пути планарной клеточной полярности (англ. planar cell polarity), который вызывает активацию транскрипции посредством JNK. Канонический сигнальный путь Wg/Wnt/β-катенин участвует в поддержании мультипотентного состояния прогемоцитов (рис. 2, табл. 1) [99]. Так, рецептор Fz2, который передает сигнал по каноническому пути, экспрессируется на высоком уровне в прогемоцитах Dome⁺. Усиленная активация сигнального пути Wg/Wnt/β-катенина в прогемоцитах Dome⁺, обусловленная сверхэкспрессией лиганда Wg или конститутивно активной формы β-катенина, не позволяет данным клеткам дифференцироваться, стимулируя их поддержание в недифференцированном состоянии [99]. В свою очередь, ингибирование данного сигнального пути с помощью комбинации доминантно-негативных форм рецепторов Fz и Fz2 в прогемоцитах Dome⁺ вызывает нарушение зональности ГО, то есть кластеры дифференцированных клеток «перемешиваются» с кластерами прогемоцитов (рис. 2). Одновременная экспрессия доминантно-негативных форм Fz и Fz2 увеличивает количество промежуточных прогемоцитов ПЗ [99]. При этом подавляется экспрессия белка ЭКМ Е-кадгерина, который непосредственно вовлечен в поддержание прогемоцитов. Подавление экспрессии Е-кадгерина в прогемоцитах вызывает их дифференцировку, в то время как сверхэкспрессия Е-кадгерина способствует поддержанию прогемоцитов [41, 131]. Показано также, что активация сигнального пути Wg/Wnt/β-катенин в клетках Hml⁺ кортикальной зоны подавляет экспрессию белка ЭКМ Tig и влияет на созревание плазматоцитов [132, 133], что дополнительно указывает на функцию этого сигнального пути в клетках промежуточной зоны. Недавние исследования показали, что в прогемоцитах экспрессируется также лиганд Wnt6, экспрессия которого контролируется сигнальным путем Hh [134]. Важно отметить, что Wnt6 передает сигналы через новый неканонический Wnt-путь, опосредуемый рецептором LRP6 и подавляющим активность β-катенина. Взаимодействие цитозольного β-катенина с Е-кадгерином подавляет сигнальный путь EGFR в прогемоцитах. Таким образом, активация сигнального пути Wnt6/LRP6 ведет к задержке клеточного цикла в фазе G2, тем самым не позволяя прогемоцитам отвечать на сигналы к дифференцировке [134]. Однако активация сигнального пути EGFR в промежуточных прогемоцитах ПЗ снимает блокаду клеточного цикла путем активации бета-катенина и позволяет клеткам дифференцироваться посредством активации ТФ Pointed (Pnt) [134]. Таким образом, активация сигнальных путей: канонического Wg/бета-катенин и неканонического Wnt6 важна для поддержания прогемоцитов в мультипотентном состоянии, возможно, и в различных популяциях прогемоцитов, в том числе в популяции промежуточных прогемоцитов ПЗ.

Сигнальный путь кальций/кальмодулин участвует в поддержании прогемоцитов

Сигнальный путь кальций/кальмодулин участвует не только в ЗСЦ-зависимой регуляции пролиферации препрогемоцитов, но также и в поддержании прогемоцитов Dome⁺ (рис. 2). Подавление передачи сигналов кальция в прогемоцитах ГО приводит к увеличению количества дифференцированных гемоцитов. Напротив, активация сигналов кальция в прогемоцитах способствует их поддержанию и пролиферации, при этом образуется значительно меньше зрелых гемоцитов [120].

Активность фактора Collier важна для поддержания прогемоцитов

Транскрипционный фактор Col экспрессируется в прогемоцитах Dome⁺, а его инактивация в клетках приводит к дифференцировке данных клеток в плазматоциты и кристаллические клетки (табл. 1) [109, 110]. Экспрессия данного ТФ в прогемоцитах не контролируется сигналами из ЗСЦ. При этом Col негативно регулирует также дифференцировку ламеллоцитов. Понижение уровня Col наблюдается при усиленной дифференцировке ламеллоцитов, в то время как его эктопическая экспрессия в прогемоцитах предотвращает образование данных клеток. Остается не ясным, под действием какого сигнального пути активируется функция Col в прогемоцитах.

Сигнальные пути FGF и Gbb/TGF-beta способствуют дифференцировке прогемоцитов

В отличие от Wnt, активация сигнального пути FGF в прогемоцитах Dome⁺ вызывает их дифференцировку в зрелые гемоциты всех трех типов. Ингибирование сигнального пути FGF вызывает значительный рост прогемоцитов, при этом наблюдается подавление их дифференцировки. Интересно, что лиганд FGF Thisbe (Ths) и рецептор Htl экспрессируются в прогемоцитах и некоторых, вероятно, промежуточных прогемоцитах, экспрессирующих пероксидазин. Эктопическая экспрессия целевых для FGF транскрипционных факторов Pnt и Ush способствует дифференцировке прогемоцитов [135]. Таким образом, передача сигнала FGF через Htl, Ras/MAPK, Pnt и Ush способствует дифференцировке прогемоцитов (рис. 2). Показано также, что сигнальный путь TGF-beta через лиганд Glass bottom boat (Gbb) участвует в негативной регуляции дифференцировки ламеллоцитов и плазматоцитов КЗ за счет подавления сигнальных путей EGFR и JNK [136].

Сигнальный путь JAK/STAT участвует в поддержании прогемоцитов

Цитокины Unpaired 1–3 (Upd1–3), действуя через рецептор Dome, активируют киназу JAK и далее ТФ Stat92E, индуцируя транскрипцию целевых генов [102, 137]. Показано, что сигнальный путь JAK/STAT активирован в прогемоцитах Dome⁺ и участвует в поддержании их идентичности, предотвращая дифференцировку [41, 119, 137]. Активность ТФ Stat92E в прогемоцитах значительно ниже, чем в дифференцированных гемоцитах КЗ [138]. Однако функция ТФ Stat92E необходима для поддержания прогемоцитов. Инактивация Stat92E с помощью температурочувствительной мутации приводит к дифференцировке прогемоцитов [102]. При этом инактивация компонентов сигнального пути JAK/STAT, таких, как Dome или киназы JAK (hopscotch, hop), или Stat92E в прогемоцитах МЗ, не влияет на их поддержание [103, 139]. Показано, что ТФ Ush, регулируемый сигналами JAK/STAT, способствует экспрессии E-кадгерина и Ptc в прогемоцитах, участвуя тем самым в их поддержании и подавлении дифференцировки [131, 140]. Белок переноса эндосом Asrij (Arj) участвует в фосфорилировании и активации STAT. Инактивация Arj частично фенокопирует температурочувствительный аллель Stat92E – подавляет поддержание прогемоцитов, вызывая их дифференцировку [141, 142]. Кроме того, сигнальный путь JAK/STAT положительно регулирует дифференцировку прогемоцитов в ламеллоциты при индукции клеточного иммунного ответа (рис. 2, табл. 1) [137].

Активные формы кислорода участвуют в поддержании прогемоцитов

Основными источниками АФК в клетке являются дыхательная цепь митохондрии и мембранные NADPH-оксидазы (NOX). Эти системы генерируют супероксидный анион-радикал, который далее под действием супероксиддисмутаз превращается в пероксид водорода. Главными формами АФК в клетке являются пероксид водорода и супероксидный анион-радикал. АФК являются мощными окислителями, в высоких концентрациях, а также при нарушении антиоксидантной системы клетки они вызывают необратимые изменения макромолекул, приводящие к старению и гибели клетки. Однако сублетальные, физиологические концентрации АФК служат важными сигнальными посредниками, участвующими в посттрансляционных модификациях белков сигнальных путей и транскрипционных факторов, тем самым регулируя различные процессы в клетке [143, 144]. Неожиданно оказалось, что в норме в прогемоцитах Dome⁺ поддерживаются повышенные уровни АФК по сравнению с дифференцированными гемоцитами кортикальной зоны (рис. 2, табл. 1) [100]. Прогемоциты находятся в митотическом покое. По аналогии с покоящимися (quiescent) ГСК млекопитающих можно предположить, что эти клетки имеют низкую митохондриальную/дыхательную активность и, соответственно, низкие уровни АФК. Однако известно, что в миелоидных предшественниках млекопитающих уровень АФК существенно выше, чем в ГСК, и также повышается при дифференцировке клеток миелоидной линии. Неясным остается механизм генерации повышенных уровней АФК в прогемоцитах. Однако показано, что АФК функционируют как сигнальные молекулы в процессе дифференцировки прогемоцитов. Снижение базального уровня АФК в прогемоцитах Dome⁺ путем экспрессии антиоксидантных ферментов подавляет формирование зрелых гемоцитов. В то же время искусственная индукция избытка АФК и ослабление окислительного фосфорилирования посредством инактивации комплекса-1 дыхательной цепи митохондрий в прогемоцитах через активацию сигнального пути JNK приводят к их дифференцировке во все три типа зрелых гемоцитов [100]. Увеличение уровня АФК в прогемоцитах приводит также к снижению экспрессии E-кадгерина посредством активации сигнального пути JNK и ТФ Srp [145]. Эктопическая экспрессия ТФ FoxO сигнального пути JNK в прогемоцитах вызывает их дифференцировку в плазматоциты и кристаллические клетки [100, 145]. При этом одновременная активация FoxO и инактивация белков хроматина Polyhomeotic proximal (Ph-p) и Enhancer of polycomb (E(Pc)) вызывает дифференцировку прогемоцитов в ламеллоциты (рис. 2, табл. 1). Таким образом, умеренно высокий, но физиологически контролируемый уровень АФК необходим для поддержания прогемоцитов. Однако повышенная продукция митохондриальных АФК в прогемоцитах вызывает их дифференцировку через активацию сигнального пути JNK/FoxO. Важно отметить, что в данном контексте функция FoxO не опосредует регуляцию антиоксидантных генов. Обнаружено также, что предполагаемые прогемоциты, циркулирующие в целоме личинки дрозофилы вне гемопоэтического органа, также характеризуются высокой продукцией АФК. Эти прогемоциты недостаточно охарактеризованы, они отнесены к предшественникам по аналогии с прогемоцитами ГО, которые экспрессируют повышенные уровни АФК и лиганд Wg [17]. Эти клетки образуются в большом избытке в результате активности онкогенного химерного белка AML1-ETO, экспрессируемого в гемоцитах Hml⁺. Высокие уровни АФК в таких циркулирующих прогемоцитах способствуют их поддержанию и повышенной пролиферации. Так, эктопическая экспрессия антиоксидантных ферментов SOD2 или каталазы (Catalase, Cat), а также ТФ FoxO, активирующего их экспрессию, подавляет генерацию и избыточную пролиферацию гемоцитов и их предшественников, вызванную онкогеном AML1-ETO [17]. В данном случае наиболее вероятно, что сигнальный путь Akt1/FoxO канонически регулирует экспрессию антиоксидантных генов. Таким образом, наблюдается как сходство, так и значительные различия в регуляции поддержания прогемоцитов ГО и циркулирующих прогемоцитов под действием АФК.

Синтаза оксида азота (Nos), как недавно показано, специфически экспрессируется в прогемоцитах и через продукцию оксида азота (NO) участвует в посттрансляционном S-нитрозилировании белков по остаткам цистеина [146]. S-нитрозилирование белков совместно с цитозольным кальцием активирует Ire1-Xbp1-опосредованную реакцию на развернутый белок (unfolded protein response, UPR), необходимую для поддержания прогемоцитов в митотически неактивном состоянии путем их остановки в фазе G2 клеточного цикла [146]. Как уже отмечалось, такая блокировка клеточного цикла делает прогемоциты невосприимчивыми к паракринным факторам, вызывающим дифференцировку. Показано также, что S-нитрозилирование EGFR временно инактивирует данный рецептор и таким образом делает прогемоциты невосприимчивыми к соответствующим сигналам. Важно отметить, что Nos, экспрессирующаяся в прогемоцитах, не содержит редуктазный домен, но при этом способна генерировать NO [146]. В свою очередь, поскольку эти клетки имеют высокие уровни АФК, данная форма Nos может использовать АФК для синтеза NO. Таким образом, предполагается, что взаимодействие между АФК и NO может участвовать в поддержании соответствующих уровней АФК, генерировать NO и тем самым защищать прогемоциты от избыточной продукции АФК.

В целом, очевидна сложная сеть регулировки поддержания и дифференцировки прогемоцитов в ГО. В локальной регуляции данных процессов участвуют несколько сигнальных путей. При этом, вероятно, существует сложная сеть взаимодействий между компонентами данных сигнальных путей в определенных временных интервалах гемопоэза дрозофилы. При этом различные сигнальные пути способны вызывать дифференцировку клеток, что может указывать на повышенную пластичность клеток-предшественников дрозофилы. Помимо данных сигналов и сигналов из ниши ЗСЦ, поддержание прогемоцитов контролируется сигналами дифференцированных клеток, о чем будет сказано в следующем разделе.

РАВНОВЕСНЫЕ СИГНАЛЫ МЕЖДУ КЛЕТКАМИ НИШИ ЗСЦ И ЗРЕЛЫМИ ГЕМОЦИТАМИ КОРТИКАЛЬНОЙ ЗОНЫ РЕГУЛИРУЮТ ПОДДЕРЖАНИЕ ПРОГЕМОЦИТОВ

С использованием генетической системы дрозофилы обнаружен уникальный механизм регуляции поддержания прогениторных клеток. Установлено, что поддержание и дифференцировка прогемоцитов контролируются «равновесно» двумя механизмами: (1) непосредственно сигналом из клеток гемопоэтической ниши ЗСЦ и (2) сигналом дочерних дифференцированных клеток, который также контролируется дополнительным сигналом, исходящим из той же гемопоэтической ниши. Клетки ЗСЦ регулируют не только поддержание мультипотентного состояния прогемоцитов, но также поддержание и дифференцировку гемоцитов кортикальной зоны (рис. 2). Этот процесс регулируется сигнальным путем Pvf1/Pvr [103]. Лиганд Pvf1 секретируется в клетках ЗСЦ, в то время как рецептор Pvr экспрессируется на высоком уровне в клетках кортикальной зоны. Инактивация Pvf1 в клетках ЗСЦ не влияет на пролиферацию и количество клеток ЗСЦ, однако приводит к подавлению поддержания прогемоцитов, вызывая их дифференцировку. Аналогичный эффект наблюдается и в результате подавления функции рецептора Pvr в дифференцированных гемоцитах кортикальной зоны, вызывающей обширную дифференцировку прогемоцитов [103, 119]. Важно отметить, что лиганд Pvf1 переносится на большие расстояния через несколько клеток посредством транспортных везикул, включающих связанные, но не сигнализирующие комплексы Pvf1 и Pvr на поверхности прогемоцитов.

Далее с помощью генетических методов было показано, что Pvf1, взаимодействуя с Pvr гемоцитов кортикальной зоны, активирует STAT-зависимую экспрессию секретируемой аденозиндезаминазы ростового фактора-A (Adgf-A) (рис. 2). Этот фермент осуществляет дезаминирование аденозина, превращая внеклеточную сигнальную молекулу аденозина в инертный инозин [147, 148]. Удаление аденозина посредством Adgf-A в гемоцитах КЗ приводит к подавлению соответствующего сигнального пути через рецептор аденозина (AdoR), находящийся в прогемоцитах. В результате снижается активность сАМР-зависимой протеинкиназы A (PKA), что, в свою очередь, активирует транскрипционный фактор Ci, опосредующий поддержание прогемоцитов в мультипотентном состоянии. Важно отметить, что активация сигнального пути Hh/Ptc из ЗСЦ также ингибирует активность PKA в прогемоцитах, что приводит к активации Ci. Таким образом, Hh-зависимый сигнал из клеток ниши ЗСЦ и сигнал аденозина из дифференцированных гемоцитов КЗ синергически ингибируют активность PKA и активируют Ci, что приводит к поддержанию прогемоцитов в медуллярной зоне [96, 103]. Можно предположить, что аналогичный равновесный сигнал присутствует и в гемопоэтической системе млекопитающих.

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ПОДДЕРЖАНИИ ФУНКЦИИ КЛЕТОК НИШИ ЗСЦ

ТФ Antp и Col экспрессируются в клетках ЗСЦ на протяжении всех личиночных стадий. Данные клетки пролиферируют на ранней личиночной стадии и образуют кластер из 30–40 клеток, которые поддерживаются в течение третьей личиночной стадии (рис. 1). Antp непосредственно контролирует спецификацию, поддержание и рост данных клеток, активирует экспрессию Col, который, в свою очередь, участвует в поддержании экспрессии Antp [96, 97, 116]. Лиганд Serrate рецептора Notch экспрессируется позднее в определенной популяции клеток ЗСЦ. Serrate необходим для дифференцировки кристаллических клеток в КЗ [96, 97, 105].

Пролиферацию клеток ЗСЦ антагонистически регулируют два сигнальных пути – Wg и Dpp [99, 123]. Все компоненты сигнального пути Wg, Fz2, β-катенин/Arm и Disheveled (Dsh) экспрессируются в ЗСЦ. Активация Wg необходима для увеличения количества клеток ЗСЦ (рис. 2, табл. 1). Так, при блокировании функции Fz2 происходит существенное снижение количества клеток ЗСЦ, в то время как эктопическая экспрессия Wg приводит к значительному увеличению количества этих клеток [99]. В противоположность Wg подавление сигнального пути Dpp/TGF-beta вызывает увеличение количества клеток ЗСЦ [123]. Активация сигнального пути TGF-бета через лиганд Dpp активирует транскрипционные факторы Daughters against dpp (Dad) и Mad, которые экспрессируются в клетках ЗСЦ [123, 149]. Количество клеток ЗСЦ существенно увеличивается при подавлении данного пути в результате инактивации гепарансульфатпротеогликан-связывающего белка Dally like (Dlp) и, соответственно, pMad в данных клетках (рис. 2). Одновременное подавление сигнальных путей Wg и Dpp восстанавливает ЗСЦ до размера дикого типа. Регуляция количества клеток ЗСЦ с помощью Wg зависит от Myc, поскольку инактивация Myc отменяет увеличение клеток ЗСЦ, вызванное эктопической экспрессий Wg [123]. В свою очередь, ТФ семейства forkhead – Jumu – вовлечен в регуляцию Myc в процессе регуляции пролиферации клеток ЗСЦ [150]. Для детального понимания механизма взаимодействия данных сигнальных путей в регуляции пролиферации и функционирования клеток ЗСЦ требуются дальнейшие исследования.

Показано, что развитая сеть белков внеклеточного матрикса между клетками ЗСЦ и прогемоцитами важна для регуляции передачи сигналов Dpp и Wg в процессе гемопоэза в ГО и ответа на стрессовые воздействия [151]. Обнаружено, что септированные контакты между клетками ЗСЦ разрушаются при активации сигнальных путей Toll или Imd или в ответ на бактериальную инфекцию. В норме кластер клеток ЗСЦ непроницаем для крупномолекулярных красителей. Однако инактивация белков плотных септированных межклеточных контактов Coracle (Cora) или нейрексина IV (Neurexin IV, NrxIV) приводит к проницаемости клеток ЗСЦ. Повышенная проницаемость способствует увеличению числа клеток ЗСЦ, уменьшению количества прогемоцитов и способствует дифференцировке плазматоцитов и кристаллических клеток. Потеря такого барьера нарушает передачу сигналов лигандов Wg и Dpp [151] как внутри ниши, так и сигналов прогемоцитам. Показано также, что в регуляции секреции Hg участвуют щелевые контакты (gap junctions, GJ), а также Ca²⁺-сигнальный путь [128].

В дополнение к этому показано, что сигналы от соседствующих с ЗСЦ клеток ДС регулируют пролиферацию, функционирование и локализацию клеток ЗСЦ. Так, гликопротеин Slit секретируется клетками дорсального сосуда. Рецепторы данного белка Roundabout 1 и 2 (Robo 1 и 2) экспрессируются на клетках ЗСЦ. Взаимодействие Slit с Robo 1 и 2 регулирует пролиферацию и локализацию клеток ЗСЦ [33, 126, 152]. Подавление функции Robo в ЗСЦ или экспрессии Slit в клетках дорсального сосуда увеличивает количество клеток ЗСЦ и вызывает их распространение вглубь гемопоэтического органа, в том числе посредством подавления экспрессии E-кад [126]. В свою очередь, Robo активирует сигнальный путь Dpp/TGF-beta, что приводит к подавлению экспрессии ТФ Myc и пролиферации клеток ЗСЦ (рис. 2) [33, 123, 126].

Важным открытием стало то, что сигналы извне, а именно от нервной и гуморальной систем, непосредственно влияют на состояние и функцию клеток гемопоэтической ниши ЗСЦ. Инсулиноподобные пептиды, экспрессирующиеся в нейронах, клетках глии и жирового тела [153], регулируют пролиферацию и рост клеток ЗСЦ посредством активации инсулинового сигнального пути [31, 32, 104, 122, 154]. Ингибирование данного сигнального пути в результате инактивации различных его компонентов: инсулинового рецептора (InR) или Akt1, или фосфоинозитид-зависимой киназы 1 (Pdk1), или фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), уменьшает количество клеток ЗСЦ. Кроме того, показано, что в этом процессе участвует активация сигнального пути рапамицина. Дальнейшие исследования позволят более детально установить взаимодействия между обнаруженными сигнальными путями в регуляции поддержания и функционирования клеток гемопоэтической ниши, которая является центром, регулирующим гемопоэз в ГО дрозофилы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние 20 лет был достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, регулирующих гемопоэз дрозофилы. Генетически наиболее совершенная модельная система дрозофилы позволила охарактеризовать сложные взаимодействия между сигнальными путями и транскрипционными факторами, участвующими в регуляции поддержания и дифференцировки мультипотентных клеток предшественников гемоцитов: препрогемоцитов и прогемоцитов. Данные клетки дифференцируются в процессе развития личинки в три типа зрелых гемоцитов: плазматоциты, кристаллические клетки и ламеллоциты. Показано, что у насекомых, как и у млекопитающих, в поддержании и регуляции дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников главную роль играет гемопоэтическая ниша – клетки ЗСЦ. Детерминация судьбы клеток гемопоэтической ниши происходит параллельно со спецификацией гемопоэтических предшественников в гемопоэтическом органе. На протяжении личиночных стадий клетки ЗСЦ координируют поддержание и дифференцировку прогемоцитов с помощью секретируемых лигандов: Hh, Pvf1, Ser, Wg/Wnt, активируя соответствующие сигнальные пути в предшественниках гемоцитов. Эти сигналы участвуют в том числе в поддержании аутокринных и паракринных сигналов (Wnt/ бета-катенин, кальциевая сигнализация, АФК, Stat92E) в прогемоцитах, активируя или подавляя поддержание прогемоцитов в недифференцированном состоянии. Прогемоциты находятся в митотически покоящимся состоянии в медуллярной зоне гемопоэтического органа. Помимо этого, показана двусторонняя, равновесная регуляция поддержания прогемоцитов с помощью сигналов от дифференцированных клеток (Pvr, Adgf-A, AdoR, PKA) и клеток гемопоэтической ниши (Hh, Pvf1). Недавние исследования с использованием секвенирования транскриптома единичных клеток показали наличие промежуточных стадий дифференцировки прогемоцитов и неохарактеризованных популяций зрелых гемоцитов. Дифференцировка прогемоцитов происходит в так называемой промежуточной зоне, где клетки начинают делиться и становятся восприимчивыми к сигналам дифференцировки. Однако данный механизм требует дальнейшей расшифровки. Кроме того, недавние исследования показали, что клетки дорсального сосуда также служат своего рода гемопоэтической нишей, участвуя в поддержании прогемоцитов. До настоящего времени у дрозофилы не выявлены гемопоэтические стволовые клетки, способные самообновляться с помощью асимметрического деления. Однако определена наиболее наивная популяция препрогемоцитов, клетки которой регулируются клетками гемопоэтической ниши с помощью активации сигнальных путей Notch, Dpp, Pvf2/Pvr. Показано также, что, помимо поддержания предшественников гемоцитов, клетки гемопоэтической ниши участвуют в регуляции клеточного иммунного ответа и клеток, опосредующих меланизацию и инактивацию патогенных объектов с помощью сигнальных путей Spi/EGFR, Toll и Ser/Notch. На основании результатов рассмотренных исследований получена уникальная картина взаимодействия молекулярных механизмов, регулирующих гемопоэз одного из представителей артропод. Генетическая система дрозофилы позволила и позволяет с высоким разрешением, по некоторым параметрам опережая модельную систему мыши, расшифровать молекулярные события, регулирующие гемопоэз.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Соглашения № 075-15-2021-1075 с Минобранауки от 28-09-2021.

Об авторах

С. А. Синенко

Автор, ответственный за переписку.
Email: s.sinenko@incras.ru
Россия, Санкт-Петербург, 194064

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. А – схема строения гемопоэтического органа или лимфатических желез (lymph gland) третьей личиночной стадии дрозофилы. ГО состоит из парных передних долей и парных задних долей, прикрепленных и взаимодействующих с клетками дорсального сосуда и клетками перикардия. Передние доли ГО являются модельной системой исследования гемопоэза дрозофилы. Передняя доля ГО состоит из популяции клеток заднего сигнального центра (ЗСЦ) или гемопоэтической ниши; медуллярной зоны, состоящей из популяций препрогемоцитов (ППГ) и прогемоцитов (ПГ); кортикальной зоны, состоящей из дифференцированных гемоцитов: плазматоцитов (ПЛ), кристаллических клеток (КК) и ламеллоцитов (ЛМ); и популяции промежуточных прогемоцитов (ПроПГ) промежуточной зоны (ПЗ). Б – схема генеза гемопоэтического органа. На ранней эмбриональной стадии клетки кардиогенной мезодермы, или гемангиобласты (ГАБ), дают начало клеткам гемопоэтической линии (ГЛ) и клеткам-предшественникам сердечно-сосудистой системы – кардиобластам (КБ). На последующих стадиях эмбриогенеза клетки гемопоэтической линии кардиогенной мезодермы формируют три пары грудных сегментов (thoracic segments). Передние два сегмента сливаются и дают начало препрогемоцитам (ППГ) и всем гемоцитам передней доли ГО, тогда как третий задний сегмент дает начало клеткам гемопоэтической ниши ЗСЦ (выделено зеленым). На первой личиночной стадии передние доли ГО содержат препрогемоциты, прогемоциты и клетки ЗСЦ. На второй личиночной стадии начинается дифференцировка прогемоцитов в промежуточные прогемоциты, которые дифференцируются в плазматоциты и кристаллические клетки, формируя кортиковую зону ГО (цветами выделены соответствующие линии гемоцитов как отмечено на панели Б'). На третьей личиночной стадии продолжается процесс дифференцировки ППГ в терминально дифференцированные линии гемоцитов, соответственно сопровождающийся ростом кортикальной зоны ГО. При этом прогемоциты МЗ поддерживаются в митотически покоящемся состоянии. Б' – схема гемопоэза, происходящего в гемопоэтическом органе дрозофилы. Указаны гемопоэтические прогениторные клетки и линии дифференцированных гемоцитов, в скобках указаны аббревиатуры подтипов соответствующих линий гемоцитов, обнаруженных с помощью метода scRNAseq.

Скачать (747KB)

Метаданные

3. Рис. 2. Схема участия и взаимодействия основных сигнальных путей в регуляции гемопоэза дрозофилы в гемопоэтическом органе. Поддержание и пролиферация клеток гемопоэтической ниши ЗСЦ (отмечено зеленым цветом) положительно контролируется Wg/Fz2/Myc и негативно контролируется Dpp/TGFβ. Поддержание и пролиферация препрогемоцитов (ППГ, серый) положительно контролируется сигналами Dpp, Notch, Pvf2/Pvr. Поддержание прогемоцитов (ПГ, синий) положительно контролируется сигналами Hh/PKA/Ci из гемопоэтической ниши, аутокринными сигналами Wnt/Fz/Fz2 и Ca2+ и негативно контролируется сигналом Adgf-A, идущим из дифференцированных гемоцитов КЗ (отмечено оранжевым цветом). Клетки ЗСЦ положительно контролируют экспрессию Adgf-A, посредством активации Pvr и STAT в дифференцированных гемоцитах КЗ, являясь звеном равновесного сигнала между клетками ниши ЗСЦ и зрелыми гемоцитами, контролирующими поддержание ПГ. Промежуточные прогемоциты (ПроПГ) обозначены желтым цветом. Дифференцировка и пролиферация плазматоцитов (ПЛ) положительно регулируется FGF/Htl/Ras и АФК/JNK/FoxO, кристаллических клеток (КК) – Ser/Notch, ламеллоцитов (ЛМ) – Spi/EGFR, Jak/Stat и АФК/JNK/FoxO (см. детали в тексте)

Скачать (422KB)

Метаданные