Экспрессия RIPK3 в фибробластах в модели кожной раны in vivo и in vitro: противоречивый результат

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени; ВКМ – внеклеточный матрикс; RIPK3 – Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3, взаимодействующая с рецептором серин/треониновая протеинкиназа 3; ПФА – параформальдегид; ДЭГ – дифференциально экспрессируемый ген; Vim – Vimentin, виментин; ЛПС – липополисахарид; Fn – Fibronectin, фибронектин; FAP – Fibroblast activation protein-α, белок активации фибробластов альфа; Col1a1 – Collagen type I alpha 1, коллаген I типа альфа-1; UMAP – Uniform Manifold Approximation and Projection, алгоритм аппроксимации и проекции равномерного многообразия.

ВВЕДЕНИЕ

Нарушения заживления ран кожи представляют значительную медицинскую проблему. К таким нарушениям относятся патологии, связанные с фибротическими процессами, в основе которых лежат чрезмерная пролиферация фибробластов и избыточный синтез внеклеточного матрикса (ВКМ) – гипертрофические и келоидные рубцы. На сегодняшний день разработаны подходы к лечению ран кожи [1], но проблема аномалий регенерации, таких, как фиброз, все еще не решена.

Протеинкиназа RIPK3 (Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3) – важный участник молекулярного пути некроптоза – запрограммированной клеточной гибели с морфологическими признаками некроза. Известно, что RIPK3 вместе с протеинкиназой RIPK1 передает сигнал от таких рецепторов, как TNFR, FasR, TRAILR, TLR3, TLR4 и INFAR1, на белок MLKL, что приводит к гибели клетки [2, 3].

RIPK3 не только участвует в некроптозе, но и выполняет неканонические функции, например, в апоптозе и воспалении. Так, в дендритных клетках RIPK3 участвует в продукции цитокинов [4]. За последнее время опубликованы данные о возможном участии RIPK3 в развитии фибротических процессов, например, в почках или легких [5, 6], в то же время в предварительных экспериментах нашей лаборатории экспрессия RIPK3 была обнаружена в коже мыши и человека [7]. Поэтому целью нашей работы стало изучение экспрессии RIPK3 в модели фибротических процессов в коже мыши и человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Биологический материал

В работе использовали 30 половозрелых самцов мышей линии C57Bl/6. Мышей содержали при температуре +23°С с неограниченным доступом к питьевой воде и корму (соответствуют ГОСТ 33215-2014). Все манипуляции с животными проводили под общим наркозом в соответствии с «Правилами для проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Россия, 2010) и «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012) с одобрения Комиссии по биоэтике ИБР РАН (протоколы № 51 от 09.09.2021 и № 62 от 01.09.2022) при неукоснительном соблюдении этических принципов, установленных Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 2006).

Помимо биологического материала мышей использовали по одному образцу келоидной ткани и нормальной кожи груди человека. Фрагменты кожи человека были получены после оперативного вмешательства с добровольного информированного согласия пациента, работа с культурами клеток проводилась с одобрения Комиссии по биоэтике ИБР РАН.

Выделение клеток из ран и неповрежденной дермы мышей

Биоматериал промывали в растворе Хэнкса c добавлением раствора амфотерицина В (ОАО «Синтез», Россия) и раствора сульфата гентамицина (компания «БиоФармГарант», Россия). Затем ткани измельчали и помещали в 0.2% раствор диспазы (Gibco, каталожный номер 17105-041). Образцы инкубировали в термостате в течение 30 мин при +37°С. Далее с фрагментов ткани стерильно снимали эпидермис. Затем биоматериал ран помещали в 0.2% раствор коллагеназы I (Worthington Biochemical, каталожный номер LS004197) и IV (Gibco, каталожный номер 1704-019), а кожи в 0.2% раствор коллагеназы IV (Gibco, каталожный номер 1704-019). Далее полученный раствор центрифугировали при +4°С и трижды промывали стерильным ледяным раствором DPBS, после чего пипетировали осадок.

Культивирование клеток мыши

Суспензию клеток, выделенных из нормальной дермы мыши, фильтровали через сито с диаметром пор 100 мкм. Далее клетки, выделенные из раневого ложа и из нормальной дермы, ресуспендировали в среде DMEM и DMEM Advanced соответственно, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% глутамина и 1% пенициллина–стрептомицина, после чего высевали в 96-луночное плато. Из клеток, достигших монослоя, выделяли РНК.

Культивирование клеток человека

Фибробласты человека были предоставлены УНУ «Коллекция клеточных культур для биотехнологических и биомедицинских исследований (общебиологического и биомедицинского направления)» Института биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН.

Фибробласты человека от трех различных доноров культивировали в 6-луночных планшетах по 3 × 10⁵ клеток на лунку, с использованием среды DMEM («ПанЭко») с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина. Через 24 ч после введения в культуру клетки переводили на среду Opti-MEM с 1% эмбриональной телячьей сыворотки [5]. Затем через 60 мин клетки переводили в среду, содержащую TGF-β в концентрации 0.1, 1, 2, 5, 10 нг/мл [5], липополисахарид (ЛПС) – 1, 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл [8], а также смесь TGF-β (10 нг/мл) и ЛПС (100 нг/мл). Через 24 ч клетки фиксировали и окрашивали антителами к RIPK3 по стандартному протоколу лаборатории. Далее эксперимент повторяли, но TGF-β добавляли в концентрации 1 и 10 нг/мл, а ЛПС – 10 и 100 нг/мл. Через 24 ч выделяли тотальную РНК, используя колонки.

Модель раны кожи мыши

Методологически мы опирались на работу [9], в которой использовали модели большой (квадратная рана площадью 1 см²) и малой раны мыши (круглая рана диаметром 4 мм). Нам требовалось смоделировать малую рану, однако выделить фибробласты на стадии пролиферации из раны диаметром 4 мм не представляется возможным, из-за ее малых размеров, поэтому мы использовали рану диаметром 8 мм.

Мышь наркотизировали путем внутрибрюшинного введения препарата Авертин. Для удаления шерсти в области операционного поля использовали крем для депиляции Veet (Франция). Далее при помощи трафарета на кожу спины мыши наносили по пять окружностей диаметром 8 мм, после чего иссекали ткань в границах нанесенных окружностей. Получившиеся раны накрывали пластырем (Tegaderm^tm). Мышей выводили из эксперимента на 10-й день после операции. В качестве биологического контроля использовали нормальную кожу спины мышей.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Препараты раны кожи на предметных стеклах и культуру клеток на пластике фиксировали с помощью 4% раствора ПФА в течение 10 мин, после чего промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS, 3 раза по 5 мин). Затем на образцы наносили блокирующий раствор (5% сыворотки крови осла, 1% Triton на PBS) и инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при комнатной температуре. Далее блокирующий раствор удаляли и наносили раствор первичных антител, после чего инкубировали во влажной камере при температуре +4°С в течение минимум 12 ч.

Затем образцы промывали в PBS, после чего на них наносили раствор вторичных антител и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего ядра докрашивали DAPI и заключали в среду BrightMount/Plus (Abcam, Британия).

В работе использовали первичные антитела к RIPK3 (Sigma, каталожный номер HPA055087, разведение 1 : 500) и Vimentin (Abcam, каталожный номер ab24525, разведение 1 : 500), а также вторичные антитела AlexaFluor 488 (Abcam, Ab150173, разведение 1 : 500), AlexaFluor 594 (A21207, Invitrogen, разведение 1 : 500) и AlexaFluor 660 (A21074, Invitrogen, разведение 1 : 500). В качестве положительного контроля для антител к RIPK3 был выбран лимфоузел, для антител к Vimentin выбраны фибробласты. В качестве отрицательного контроля использован биоматериал без окрашивания первичными антителами.

Флуоресцентная микроскопия

Для флуоресцентной микроскопии и получения фотографий препаратов, окрашенных антителами, использовали микроскоп Leica DMI6000. Фотографии обрабатывали и анализировали при помощи программного обеспечения BZ-II Analyzer (Keyence), LAS X (Leica), ImageJ (FiJi) и STATISTICA (StatSoft).

Выделение РНК, обратная транскрипция, ПЦР с гель-электрофорезом и ПЦР-РВ

РНК из клеток выделяли на колонках (Biolabmix и Zymo Research) согласно рекомендациям производителя (США, Россия). Далее проводили обработку ДНКазой (ThermoFisher и Zymo Research), затем синтезировали кДНК с помощью набора для обратной транскрипции MMLV RT kit («Евроген») с олиго(dT)праймером согласно протоколу, предоставленному производителем. ПЦР-анализ с детекцией в реальном времени проводили с применением смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR («Евроген») по инструкциям производителя на приборе LightCycler 96 (Roche, Швейцария). Обычную ПЦР проводили с применением смеси для ПЦР ScreenMix («Евроген») согласно инструкции производителя на приборе T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Горизонтальный электрофорез проводили в 2% агарозном геле, после чего визуализировали результаты на ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad).

Праймеры подбирали в программах PrimerBlast и PrimerSelect (табл. 1). Уровни экспрессии генов нормировали по экспрессии генов домашнего хозяйства – бета-актина (Actb) у мышей и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) у человека.

 

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР

Праймер	Последовательность прямого праймера	Последовательность обратного праймера
hu FN1	GCACCACCCCAGACATTACT	CGGGACTCAGGTTATCAAAAGTG
hu FAP	ATGGGCTGGTGGATTCTTTGT	ATGTTTGTAGCCATCCTTGTCACT
hu COL1A1	CCCCTGGAAAGAATGGAGATGA	CAAACCACTGAAACCTCTGTGTC
hu GAPDH	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT	TTCTCAGCCTTGACGGTGC
hu RIPK3	ATGCTGCTGTCTCCACGGTAA	AAAGCCATCCATTTCTGTCCCTC
mo Actb	ACCCGCCACCAGTTCG	AGCATCGTCGCCCGC
mo Acta2	CATTGGGATGGAGTCAGCGG	GACAGGACGTTGTTAGCATAGAGA
mo Acta2	CCCTGAAGAGCATCCGACAC	CAGAGTCCAGCACAATACCAGT
mo Fn1	GAGGAAGAAGACAGGACAGGAA	GTCAGAGTCGCACTGGTAGAA
mo Fap	AAGAAGCTCAAAGACGGGGG	TGCAAGGACCACCATACACTT
mo Ripk3	ACACGGCACTCCTTGGTATC	CTTGAGGCAGTAGTTCTTGGTG
mo Col1a1	TGACTGGAAGAGCGGAGAGTA	GGCTGAGTAGGGAACACACA

 

Измерение интенсивности флуоресценции окрашенных культур фибробластов человека

Среднюю интенсивность флуоресценции измеряли с помощью программы ImageJ (FiJi). Для сравнительного анализа интенсивности флуоресценции применяли съемку на одинаковой экспозиции различных образцов фибробластов, окрашенных флуоресцентными антителами, после чего проводили измерения в 30 точках 3–5 полей зрения контрольной и экспериментальной групп. Результаты анализировали в программе GraphPad Prism 8 (США).

Анализ экспрессии гена RIPK3 в данных RNA-seq

Сбор данных. Три набора данных были извлечены из базы данных NCBI GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Набор GSE113619 содержит данные массового секвенирования РНК из 27 образцов нормальной кожи человека (контроль) и 37 образцов кожи людей, имеющих наследственную склонность к образованию келоидных рубцов, с учетом биологических повторностей [10]. Набор GSE130973 включает данные секвенирования РНК индивидуальных клеток пяти образцов нормальной кожи человека [11]. Набор GSE163973 содержит данные секвенирования РНК индивидуальных клеток из трех образцов келоидного рубца человека [12].

Анализ дифференциальной экспрессии генов. Дифференциальную экспрессию генов в данных массового секвенирования РНК анализировали с использованием R-пакета Edger [13].

Обработка и анализ данных секвенирования РНК индивидуальных клеток. Для обработки и анализа данных использовали R-пакет Seurat v4.1.1 [14]. Фибробласты из наборов данных GSE113619 и GSE163973 были интегрированы методом канонического корреляционного анализа (CCA). Снижение размерности данных выполняли методом главных компонент (РСА) на 3000 высоковариабельных генах (HGV). Поиск ближайших соседей выполнен с помощью функции FindNeighbors на первых 30 PC’s. Кластеризация выполнена с помощью функции FindClusters с параметром resolution =0.1.

Статистический анализ

Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения Excel, GraphPad Prism 8 (США). Для сравнения нескольких групп применяли однофакторный дисперсионный анализ Краскела–Уоллиса. Для сравнения двух групп использовали U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимым данные считали при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия RIPK3 в рубцовой ткани и в нормальной коже человека

Иммунофлуоресцентное окрашивание келоида человека выявило экспрессию RIPK3 во множественных Vimentin+-клетках (рис. 1А). При этом в дерме нормальной кожи обнаружены единичные RIPK3+-клетки (рис. 1Б).

Чтобы оценить изменения уровня экспрессии гена RIPK3 в фибробластах келоидного рубца in vivo, мы проанализировали данные секвенирования РНК образцов кожи человека. Для начала использовали данные массового секвенирования РНК, полученные Onoufriadis и соавт. (GSE113619), чтобы выяснить, относится ли RIPK3 к дифференциально экспрессируемым генам (ДЭГ) при сравнении нормальной кожи и кожи индивидов с наследственной склонностью к образованию келоидов [10]. Набор данных содержал 27 образцов нормальной кожи и 37 образцов кожи лиц с наследственной склонностью к образованию келоидов. Сравнение экспрессии генов в нормальной коже и в коже лиц с наследственной склонностью к образованию келоидов показало, что RIPK3 не является ДЭГ (logFC=-0.07619307, Padjusted = 1). Из рис. 1Ж видно, что распределение счетов этого гена в нормальной коже (светло-фиолетовая диаграмма размаха) не отличается от распределения в коже людей с наследственной склонностью к формированию келоидов (светло-золотистая диаграмма размаха). В обоих случаях медиана распределения счетов равна 1.

 

Рис. 1. Паттерны экспрессии RIPK3 в коже человека. Препараты келоидного рубца человека (А) и нормальной дермы (Б), иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к Vim (красный) и RIPK3 (зеленый), ядра докрашены DAPI, увеличение ×20, масштабные отрезки 100 мкм. В – График UMAP-кластеров клеток с аннотацией из образцов нормальной кожи (слева) и распределение RIPK3+-клеток в этих данных (справа). Г – График UMAP-кластеров клеток с аннотацией из образцов нормального шрама и келоидного рубца (слева), распределение RIPK3+-клеток в этих данных (справа). Д – График UMAP-кластеров клеток в фибробластах из образцов нормальной кожи и келоидного рубца (слева) и распределение RIPK3+-клеток в этих данных (справа). Е – Процент RIPK3+-клеток в фибробластах нормальной кожи и келоидного рубца среди четырех кластеров клеток (справа) и сравнение долей RIPK3+-клеток во всех фибробластах из нормальной кожи и келоидного рубца (слева), ***Р-значениe < 0.001 (точный тест Фишера). Ж – Распределение счетов гена RIPK3 в данных массового секвенирования РНК в образцах нормальной кожи и кожи лиц с наследственной склонностью к образованию келоидных рубцов

 

Низкий уровень экспрессии RIPK3 в данных массового секвенирования РНК потенциально можно объяснить немногочисленной специфической популяцией клеток, где этот ген активен. Поэтому мы проанализировали результаты секвенирования РНК индивидуальных клеток нормальной кожи и келоидного рубца. Образцы нормальной кожи взяли из работы Solé-Boldo и соавт. (GSE130973) и визуально оценили экспрессию RIPK3 среди клеток различных типов [11]. В нормальной коже экспрессию гена RIPK3, т.е. RIPK3+-клетки, удалось детектировать в крайне незначительном количестве (рис. 1В). Данные секвенирования РНК индивидуальных клеток в келоидном рубце были взяты из работы Deng и соавт. (GSE163973) [12]. Если визуально оценивать представленность RIPK3+-клеток, то можно заметить, что таких клеток достаточно много среди эндотелиальных клеток и фибробластов келоидного рубца (рис. 1Г). Чтобы провести сравнительный анализ фибробластов из здоровой кожи и келоидного рубца, анализируемые данные были объединены и интегрированы. Всего объект содержал 11710 клеток, 5948 из которых соответствовали фибробластам нормальной кожи, а 5762 – фибробластам келоидного рубца. Мы получили четыре кластера клеток фибробластов, как и в работе Solé-Boldo и соавт., и оценили распределение RIPK3+-клеток по кластерам. Как уже показано на наборах данных, содержащих все типы клеток кожи (рис. 1В,Г), среди фибробластов келоидного рубца увеличивается количество RIPK3+-клеток (рис. 1Д). При этом RIPK3+-фибробласты не формируют отдельный кластер, а возникают произвольным образом. Далее мы сравнили гены с дифференциальной экспрессией в клетках нормальной кожи и келоидного рубца. Как и в случае с данными массового секвенирования РНК (рис. 1Ж), RIPK3 нельзя отнести к генам ДЭГ, экспрессия которых различается в фибробластах нормальной кожи и келоидного рубца. Более того, из-за небольшого количества клеток, экспрессирующих этот ген, он не учитывается в анализе.

Тем не менее, мы видим, что процент RIPK3+-клеток в фибробластах келоидного рубца значительно больше, чем в фибробластах нормальной кожи среди всех полученных кластеров клеток (рис. 1Е, слева). Разница в количестве RIPK3+-фибробластов (28 из 5948 для клеток нормальной кожи, 318 из 5762 для клеток келоида) является статистически значимой (точный тест Фишера, P-значение < 0.001) (рис. 1Е, справа). Таким образом, экспрессия гена RIPK3 в фибробластах келоидного рубца не увеличивается в RIPK3+-клетках и соответствует определенному физиологическому уровню, как и в фибробластах нормальной кожи. При этом значительное (более чем в 10 раз) увеличение числа клеток, которые экспрессируют ген RIPK3, может быть связано с переходом фибробластов в активированное состояние.

Экспрессия RIPK3 в ране и в нормальной коже мыши

Моделирование фибротических процессов кожи на лабораторных мышах не предполагает полного переноса процессов, происходящих в организме человека, на мышь, учитывая существенные морфофункциональные различия в ее строении у мыши и человека [15]. Например, для мышей характерно наличие мышцы panniculus carnosus, обуславливающей быструю регенерацию раны путем сокращения, а также индуцированный ранением неогенез волос, что не характерно для кожи человека. Тем не менее, имеются работы по изучению фибротических процессов на мышах. Так, согласно данным Lim и соавт. и Ito и соавт., процессы, происходящие в малых и больших ранах, сопровождаются активацией различных сигнальных путей, и поэтому имеют разный результат [9, 16]. В работе Lim и соавт. регенерация больших ран – от 1 см² и больше – сопровождалась повышением экспрессии Shh и, как следствие, рано-индуцированным неогенезом волос в раневом ложе, после чего заканчивалась полным структурно-функциональным восстановлением кожи. При заживлении малых ран повышения экспрессии Shh не происходило и, как следствие, не наблюдалось рано-индуцированного неогенеза волоса, вместо этого имел место фиброз. Поэтому мы использовали модель малой раны мыши. Исходя из того, что избыточное рубцевание может возникать вследствие усиленной фазы пролиферации [17], а сам рубец морфофункционально напоминает рану в стадии пролиферации, мы определили временную точку в регенерации раны мыши, когда она находится в стадии пролиферации – 10 сутки после нанесения раны. На препаратах раны мыши в данной временной точке мы наблюдали закрытие раны гиперпролиферирующим эпидермисом, грануляционную ткань с преобладанием клеточного компонента над волокнами и отсутствие волосяных фолликулов, что можно рассматривать как незрелый рубец.

Иммунофлуоресцентное исследование выявили RIPK3+Vim+, RIPK3-Vim+, RIPK3+Vim-, RIPK3-Vim–-клетки в раневом ложе мыши на 10 сутки регенерации и в нормальной коже (рис. 2А). В ране преобладала субпопуляция клеток RIPK3+Vim+, RIPK3+Vim+-клеток в раневом ложе было достоверно больше, чем в нормальной коже (рис. 2А,В). В свою очередь, в нормальной дерме доминировала RIPK3-Vim+-субпопуляция клеток, их было достоверно больше, чем в ране (рис. 2Б,В). Этот результат свидетельствует о том, что RIPK3+ мезенхимных клеток в ране было достоверно больше, чем в нормальной дерме. Вместе с тем, виментин экспрессируют не только фибробласты, но и эндотелиоциты и некоторые клетки воспаления. ПЦР с гель-электрофорезом первичной культуры клеток, выделенных из раневого ложа мыши, выявила экспрессию маркеров синтеза внеклеточного матрикса (ВКМ) и формирования миофибробластов – процессов, имеющих место при фиброзе: Acta2, Fap, Col1a1 и Fn1, а также на Ripk3 (рис. 2Г). Кроме того, эти клетки имели морфологию фибробластов. На основании полученных результатов мы сделали вывод о том, что RIPK3+-клетки раневого ложа мыши являются фибробластами. В то же время методом ПЦР-РВ не были показаны достоверные различия в экспрессии генов Ripk3, Fap и Fn1 в культуре клеток раневого ложа и культуре клеток, выделенных из нормальной дермы, что могло быть вызвано сменой фенотипа фибробластов при культивировании на пластике (рис. 2Д). Возможно, введение фибробластов нормальной дермы в культуру и их прикрепление к пластику приводит к их активации de novo, тогда как фибробласты грануляционной ткани уже активированы и продолжают активно пролиферировать в культуре, после чего профиль экспрессии соответствующих генов снижается.

 

Рис. 2. Паттерны экспрессии RIPK3 в коже мыши. Препараты раны в стадии пролиферации (А) и нормальной кожи мыши (Б), иммунофлуоресцентное окрашивание антителами против Vim (зеленый) и RIPK3 (желтый), ядра докрашены DAPI, увеличение ×20, масштабные отрезки 100 мкм. B – Статистический анализ субпопуляций клеток в нормальной дерме и раневом ложе мыши, *P <0.05 (U-критерий Манна–Уитни). Экспрессия маркеров синтеза ВКМ и Ripk3: Г – в культуре клеток раневого ложа мыши, ПЦР с гель-электрофорезом; Д – в культуре клеток раневого ложа и нормальной дермы, ПЦР-РВ, P>0.05 (U-критерий Манна–Уитни, данные экспрессии генов представлены в виде средних значений с разбросом в виде ошибки среднего)

 

Экспрессия RIPK3 в дермальных фибробластах человека под воздействием TGF-β1 и ЛПС в модели in vitro

Согласно данным Imamura, в фибробластах эмбриона мыши линии NIH 3T3 TGF-β вызывал дозозависимое увеличение экспрессии RIPK3 [5]. Показано также, что после воздействия TGF-β1 на фибробласты RIPK3 может активировать серин/треониновую протеинкиназу AKT, которая в свою очередь может фосфорилировать АТР-цитратлиазу (ACL), участвующую в активации фибробластов [18–20].

В то же время возможен и другой путь регуляции RIPK3 в фибротических процессах. В работе Guo и соавт. предполагается роль передачи сигналов TLR4/NF-κB в активации фибробластов, что приводит к развитию миомы матки. ЛПС индуцировал в фибробластах CD90+ экспрессию коллагена 1, TGF-β и FAP [8]. При этом известно, что ЛПС активирует экспрессию RIPK3. Таким образом, можно предположить, что RIPK3 участвует в ЛПС-индуцированной активации сигнального пути TLR4/NF-κB в фибробластах [21].

Анализ дермальных фибробластов человека, окрашенных антителами к RIPK3, показал, что воздействие TGF-β в концентрации 0.1, 1, 2, 5 нг/мл (рис. 3А) и ЛПС – 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл (рис. 3Б) приводит к достоверному увеличению интенсивности флуоресценции, что говорит о том, что экспрессия RIPK3 может регулироваться TGF-β1 и/или сигналами TLR4/NF-κB. Однако сравнение результатов ПЦР-РВ на RIPK3 не выявило достоверных различий между контрольными и опытными клетками (рис. 3Г). Вместе с тем, ПЦР-РВ-анализ маркеров активированных фибробластов FAP, FN1 и COL1A1 не показал значимых различий между экспериментальными группами и контролем. Такой результат также может быть связан с изменением фенотипа клеток в условиях 2D. Известно, что фенотип фибробластов изменяется в зависимости от субстрата. Так показано, что при культивировании на гидрогелях с различной жесткостью фибробласты легких мыши могут приобретать различные фенотипы – с высоким уровнем экспрессии α-SMA (α-SMA Hi) и FAP (FAP Hi). В случае α-SMA Hi наблюдается прямая корреляция экспрессии генов с жесткостью субстрата, в случае FAP Hi – обратная [22]. Кроме того, наше исследование проведено на первичных дермальных фибробластах человека и мыши, которые по своим свойствам отличаются от клеток, использованных в работах, на которые мы опирались методологически и концептуально. Так, исследование Imamura было выполнено на эмбриональных фибробластах мыши линии NIH 3T3 и фибробластах почки человека, в работе Guo и соавт использованы фибробласты миомы матки человека [5, 8]. Таким образом, модель фиброза in vitro могла оказаться не самой подходящей для исследования активации фибробластов дермы человека и роли RIPK3 в ней. Для дальнейшего понимания функций RIPK3 в заживлении ран необходимо разработать другую модель in vitro. Возможно, перспективным для решения данной проблемы может быть, например, культивирование фибробластов в коллагеновом геле или в органоидах, учитывающих эпителиально-мезенхимальные взаимодействия.

 

Рис. 3. Паттерны экспрессии RIPK3 и маркеров синтеза ВКМ в дермальных фибробластах человека. Фибробласты дермы человека, культивированные в среде, содержащей TGF-β (А), ЛПС (Б) и без воздействия (В), окрашенные антителами к RIPK3; ядра докрашены DAPI, увеличение ×20 (слева), масштабные отрезки 100 мкм. Статистический анализ интенсивности флуоресценции выполнен с использованием критерия Краскела–Уоллиса, *P <0.05, ***P <0.001, данные интенсивности флуоресценции представлены в виде средних значений с разбросом в виде ошибки среднего (справа). Экспрессия маркеров синтеза ВКМ и RIPK3 под воздействием TGF-β и ЛПС в культуре фибробластов дермы человека, ПЦР-РВ P> 0.05 (U-критерий Манна–Уитни), данные экспрессии генов представлены в виде средних значений с разбросом в виде ошибки среднего (Г)

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биоинформатический анализ данных показал, что ткань келоидного рубца человека содержит значительно больше RIPK3+-фибробластов, чем нормальная кожа. RIPK3+Vim+-клетки обнаружены в раневом ложе мыши, а также в келоиде человека. Во время регенерации кожи мыши количество Vimentin+RIPK3+-клеток было достоверно выше, чем в нормальной дерме. Экспрессия Ripk3 и маркеров синтеза ВКМ Acta2, Fap, Col1a1 и Fn1 в клетках, выделенных из раневого ложа мыши, свидетельствует о том, что эти клетки являются фибробластами. Интенсивность флуоресценции при окрашивании антителами к RIPK3-фибробластам человека, обработанным ЛПС в концентрации 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл и TGF-β в концентрации 0.1, 1, 2, 5 нг/мл была достоверно выше, чем в контроле. Не обнаружено достоверных различий в определенном методом ПЦР-РВ уровне экспрессии генов маркеров синтеза ВКМ – FAP, FN1 и COL1A1 и RIPK3 – в дермальных фибробластах человека, обработанных этими веществами, и в контроле. Этот результат является противоречивым и требует дальнейших исследований. Возможно, экспрессия RIPK3 в раневых фибробластах не связана напрямую с фибротическими процессами, а RIPK3 играет другую, пока неизвестную, роль в заживлении ран.

Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ИБГ РАН за возможность выполнения биоинформатического анализа, а также Л.Ш. Измайловой и О.И. Сутягиной за консультации.

Работа выполнена в рамках проекта № 21-74-30015 Российского научного фонда.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

И. С. Изюмов

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Email: gohin@list.ru
Россия, 119334, Москва

М. С. Шитова

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Email: mashitik@gmail.com
Россия, 119334, Москва

М. С. Сабиров

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Email: mariosabirov@gmail.com
Россия, 119334, Москва

С. А. Шелег

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Email: sonchesshel@yandex.ru
Россия, 119334, Москва

О. Л. Черкашина

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Email: olgalcher@gmail.com
Россия, 119334, Москва

Е. П. Калабушева

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Email: kalabushevae@gmail.com
Россия, 119334, Москва

Е. А. Воротеляк

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: vorotelyak@yandex.ru
Россия, 119334, Москва; 119234, Москва

Е. И. Моргун

Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: lady.morgun2016@yandex.ru
Россия, 119334, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы