Смещение репертуара генов зародышевой линии В-клеточных рецепторов при рассеянном склерозе

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ РС – рассеянный склероз; ЦНС – центральная нервная система; ВАРС – высокоактивный рассеянный склероз; ДРС – доброкачественный рассеянный склероз; Breg – регуляторная В-клетка.

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) является наиболее распространенным хроническим аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), диагностированным более чем у 2.3 миллиона человек по всему миру [1]. Механизм запуска этой тяжелой патологии, в частности механизм иммуноопосредованной нейродегенерации, до сих пор не установлен, что существенно затрудняет поиск стратегии лечения РС [2–4]. Ранее мы показали, что в репертуар антител больных РС входят антитела, кросс-реактивные к белкам вируса Эпштейна–Барр, и определили их структурно-функциональные особенности [5, 6]. С момента открытия РС основная роль в патогенезе этого заболевания отводилась исключительно Т-клеточному звену иммунитета. Однако за последнее десятилетие накоплено множество доказательств, подтверждающих непосредственное участие В-клеток в развитии аутоиммунных процессов, в том числе и при РС [7]. Несмотря на длительность изучения РС, его точная этиология все еще неизвестна. В основе механизмов вирусной индукции заболевания могут лежать молекулярная мимикрия и перекрестная реактивность с последующим увеличением числа узнаваемых эпитопов (epitope spreading) между Т- и В-клетками [5, 8–13]. У пациентов с РС повышен титр аутореактивных антител, специфически связывающих компоненты миелиновой оболочки, у них обнаружены также каталитические иммуноглобулины, гидролизующие основной белок миелина – один из характерных аутоантигенов при РС [14–16].

В последние годы регуляторные В-клетки (Breg) привлекают все большее внимание исследователей [17, 18]. Фундаментальный интерес к этому компоненту гуморального иммунитета обусловлен стремлением понять, как именно В-клетки участвуют в подавлении воспалительного ответа, на какой стадии созревания В-клетка приобретает регуляторные функции и как на это влияет специфичность В-клеточного рецептора. С практической точки зрения Breg привлекают внимание как клетки, непосредственно участвующие в развитии аутоиммунных и лимфопролиферативных патологий. Однако на сегодняшний день невозможно прийти к однозначному выводу, какие процессы происходят при возникновении аутоиммунного воспаления: изменение количества В-регуляторных клеток, нарушение их функций или сочетание двух этих явлений. Также имеется ограниченная информация о специфичности Breg, хотя и показано, что для их правильного функционирования необходим В-клеточный рецептор [19]. Неясно, сопутствуют ли развитию аутоиммунного ответа нарушения в созревании генов иммуноглобулинов Breg, являются ли эти клетки аутореактивными? Неизвестно, на какой стадии развития происходят наиболее значимые изменения в пуле Breg: у наивных, транзиторных или зрелых В-клеток. Ранее мы обнаружили повышенное содержание транзиторных Breg в периферической крови пациентов с РС [20]. При этом тяжелая цепь иммуноглобулинов транзиторных Breg при развитии РС содержит меньшее количество гипермутаций, чем у здоровых доноров.

В представленной работе мы решили прояснить, отличаются ли структуры В-клеточных рецепторов в одной из наиболее полно описанных субпопуляций транзиторных Breg CD19⁺CD24^highCD38^high у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Анализ широкомасштабного секвенирования иммуноглобулиновых последовательностей отобранных В-клеток (BCR-Seq) показал, что распределение целого ряда генов зародышевой линии у больных РС отличается от распределения у здорового человека. Причем анализ общего пула В-клеток периферической крови и субпопуляции регуляторных транзиторных В-клеток у обследованных нами пациентов выявляет как превышение, так и уменьшение встречаемости различных генов зародышевой линии по сравнению со здоровыми донорами. Важно отметить, что это различие более выражено у пациентов со злокачественным типом течения РС – высокоактивным РС (ВАРС) [21] в сравнении с пациентами с доброкачественным течением РС (ДРС) [22].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пациенты с РС и здоровые доноры

Произведен забор периферической крови у девяти пациентов 6 неврологического отделения Научного центра неврологии (Москва, Россия) с РС в возрасте 23–61 года (40.0 ± 9.1) и шести здоровых доноров (табл. 1). Тяжесть заболевания, оцененная по шкале EDSS, варьировала от 1.5 до 8.5 балла. Значения EDSS от 0 до 10 вычисляли по шкале Куртцке EDSS (англ. Expanded Disability Status Scale – расширенная шкала оценки степени инвалидизации) [23]. В исследование вошли пять пациентов с высокоактивным РС (ВАРС) [21] и четыре пациента с доброкачественным течением РС (ДРС) [22]. Были собраны данные о течении болезни, продолжительности и истории лечения (табл. 1). Исследование одобрено локальным этическим комитетом Научного центра неврологии и проводилось в полном соответствии с Декларацией WMA Хельсинки, ICH GCP и местным законодательством. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие после обсуждения протокола исследования.

 

Таблица 1. Пациенты с РС и здоровые доноры, участвующие в исследовании

	Форма РС1	Возраст, лет	Пол	EDSS2	Терапия3	Длительность заболевания, лет
РС1	ДРС	56	Жен.	2.5	Без лечения	11
РС2	ДРС	61	Жен.	3	Без лечения	26
РС3	ДРС	43	Жен.	1.5	Без лечения	12
РС4	ДРС	36	Муж.	2.5	Без лечения	14
РС5	ВАРС	33	Муж.	6	IFNβ1b (2006–2011; 2014–2017).	12
РС6	ВАРС	23	Муж.	5	Без лечения	3
РС7	ВАРС	37	Жен.	5	IFNβ1b (2014–2016). ГА (2016–2017).	5
РС8	ВАРС	29	Жен.	8	ГА (2012–2014). IVIG (2014). IFNβ1b (2015–2016).	12
РС9	ВАРС	39	Жен.	8.5	Без лечения	8
К1	Здоровый	24	Жен.	-	-	-
К2	Здоровый	40	Жен.	-	-	-
К3	Здоровый	36	Муж.	-	-	-
К4	Здоровый	27	Жен.	-	-	-
К5	Здоровый	42	Жен.	-	-	-
К6	Здоровый	25	Жен.	-	-	-

¹ РС – пациент с доброкачественным РС; ВАРС – пациент с высокоактивным РС.

² EDSS – расширенная шкала оценки степени инвалидизации (expanded disability status scale).

³ IFNβ1b – интерферон-β-1b; ГА – глатирамера ацетат; IVIG – внутривенный иммуноглобулин.

 

Выделение В-клеток из периферической крови

Мононуклеарные клетки периферической крови пациентов с РС и здоровых доноров получены путем седиментационного обогащения в градиенте фиколла. Остаточную эритроцитарную фракцию удаляли с помощью лизирующего буфера ACK. Полученные мононуклеарные клетки фильтровали через 40-мм нейлоновый фильтр и окрашивали флуоресцентными антителами: α-CD19-PE-Cy7, α-CD24-PE, α-CD38-APC, α-CD45-APC-Cy7 (Bio-legend, США), и красителем мертвых клеток sytox green dead cell stain (ThermoFisher Scientific, США) в течение 60 мин при +4ºC в темноте. Популяции регуляторных транзиторных В-клеток (CD19⁺CD24^highCD38^high) и общего пула В-клеток (CD19⁺) отбирали непосредственно в микроцентрифужные пробирки с лизирующим буфером Qiazol (Qiagen, Германия). Сортинг клеток проводили с помощью проточного флуориметра BD FACSAria III.

Подготовка библиотек для секвенирования вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов (RT-PCR)

РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию (RT) проводили с набором MMLV RT с oligo(dT) и случайными праймерами в соответствии с инструкциями производителя («Евроген», Россия). Для амплификации вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека VH и VL использовали 15 прямых праймеров для VH и четыре обратных праймера для J-фрагмента генов тяжелой цепи человека, 13 прямых праймеров Vκ, два обратных праймера Jκ для легкой каппа-цепи, 16 прямых праймеров Vλ и три обратных праймера Jλ для легкой лямбда-цепи [24]. 15 прямых праймеров VH использовали по отдельности в каждом образце в 50 мкл реакционной смеси с эквимолярной смесью четырех обратных праймеров JH. 13 праймеров Vκ и 16 праймеров Vλ использовали по отдельности для амплификации генов VL с соответствующей смесью двух обратных праймеров Vκ или трех обратных праймеров Vλ в 50 мкл реакционной смеси для каждого образца. В качестве матрицы в каждой реакции ПЦР использовали 0.02 мкг кДНК и набор Hot Start Taq Master Mix («Евроген»). Условия ПЦР были следующими: 1 шаг (94°C – 3 мин); 1 цикл (94°C – 25 с, 62°C – 25 с, 72°C – 25 с); 2 цикла (94°C – 25 с, 60°C – 25 с, 72°C – 25 с); 2 цикла (94°C – 25 с, 58°C – 25 с, 72°C – 25 с); 3 цикла (94°C – 25 с, 56°C – 25 с, 72°C – 25 с); 3 цикла (94°C – 25 с, 54°C – 25 с, 72°C – 25 с); 30 циклов (94°C – 25 с, 52°C – 25 с, 72°C – 25 с); и финальная элонгация (72°C – 4 мин). Смеси ПЦР 15 образцов для генов VH, 13 образцов для генов Vκ и 16 образцов для генов Vλ были объединены по отдельности для генов VH, Vκ и Vλ и сконцентрированы до 50–80 мкл с использованием Amicon 30 кДа (Merck, Millipore). Продукты ПЦР (около 400 п.н.) VH, Vκ и Vλ наносили на 1.5% агарозные гели и очищали с помощью набора для очистки ДНК из агарозного геля (Monarch, NEB).

Глубокое секвенирование вариабельных фрагментов генов VH, Vκ и Vλ иммуноглобулинов

Очищенный ПЦР-продукт (1 мкг) VH, Vκ и Vλ лигировали с адаптерами NEBNext Multiplex Oligos с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra для Illumina (NEB). Библиотеки секвенировали на Miseq с использованием набора для секвенирования 2×300 п.н. (Illumina) в ЦКП «Геномика» СО РАН (ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск, Россия).

Анализ данных высокопроизводительного секвенирования

Данные высокопроизводительного секвенирования анализировали с использованием программы MiXCR [25] в два этапа. Сначала исходные данные обрабатывали с помощью алгоритма MiXCR по умолчанию (выравнивание, сборка, экспорт) с использованием библиотеки IMGT в качестве референса на гены зародышевых линий. Полученные прочтения, успешно выровненные с генами зародышевой линии и содержащие полную целевую последовательность гена иммуноглобулина (CDR1 + FR2 + CDR2 + FR3 + CDR3), подвергали повторной выборке для нормирования различных количеств прочтений. При анализе частоты встречаемости генов зародышевой линии не учитывали мутации в вариабельных фрагментах VH, Vκ и Vλ.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы Prism 6 с использованием теста Манна–Уитни и парного t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы появляется все больше свидетельств, доказывающих значимость В-клеток в регуляции аутоиммунных заболеваний, включая РС [26, 27]. Тем не менее, субпопуляции Breg у пациентов с РС все еще недостаточно охарактеризованы. На текущий момент опубликовано чрезвычайно мало данных о специфичности и последовательности их В-клеточных рецепторов. Чтобы глубже понять природу развития и охарактеризовать процесс созревания Breg, мы проанализировали субпопуляцию CD19⁺CD24^highCD38^high – один из наиболее подтвержденных фенотипических портретов транзиторных Breg, находящихся на промежуточной стадии между незрелыми клетками костного мозга и полностью зрелыми наивными В-клетками периферической крови и вторичных лимфоидных тканей [28, 29]. Образцы периферической крови получены от 9 больных c РС и шести условно здоровых доноров (табл. 1). Мононуклеарные клетки окрашивали антителами к поверхностным маркерам CD19, CD24 и CD38. Общий пул CD19⁺ B-клеток и субпопуляцию транзиторных Breg CD19⁺CD24^highCD38^high сортировали по отдельности для последующего выделения РНК и анализа последовательностей В-клеточных рецепторов. Для этого последовательности генов вариабельных фрагментов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей иммуноглобулинов каждого пациента были амплифицированы с кДНК, синтезированной на основе выделенной РНК, после чего проводили широкомасштабное секвенирование генов вариабельных фрагментов VH, Vκ и Vλ. Целевое секвенирование репертуара иммуноглобулинов общего пула В-клеток и субпопуляции транзиторных Breg было выполнено с покрытием не менее пяти функциональных прочтений на отобранную клетку. После всех этапов биоинформатической фильтрации было получено в среднем по 83100 функциональных последовательностей тяжелой цепи, 37591 – каппа-цепи и 34565 последовательностей лямбда-цепи общего пула CD19⁺ клеток и субпопуляции CD19⁺CD24^highCD38^high транзиторных Breg каждого индивида. Последовательности доступны на репозитории ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-10859).

Частоту встречаемости генов зародышевой линии VH, Vκ, Vλ мы анализировали с использованием праймеров, способных амплифицировать практически все возможные варианты функциональных фрагментов V_HDJ_H, V_κJ_κ и V_λJ_λ. При сравнении распределения генов IgVH у пациентов с РС и условно здоровых доноров амплифицировались все семь функциональных семейств VH. Гены зародышевой линии IGHV3 наиболее часто встречались у пациентов с РС и здоровых доноров как в общем пуле В-клеток, так и в субпопуляции транзиторных Breg. Последовательности иммуноглобулинов, относящихся к генам зародышевой линии IGHV2-26, IGHV2-5, IGHV2-70, представленные в небольшом количестве практически у каждого здорового индивида, исчезают при развитии РС (рис. 1). Необходимо отметить, что при более тяжелой форме заболевания (ВАРС) смещение репертуара генов иммуноглобулинов по сравнению с условно здоровыми донорами более значительно, чем в случае сравнения ДРС и условно здоровых доноров. Гермлайн IGHV3-66 встречается у здоровых доноров и ДРС на сопоставимом уровне, но практически полностью исчезает у пациентов с ВАРС. Один из наиболее распространенных гермлайнов IGHV5-51 выявлен у всех анализируемых доноров, но в случае развития РС частота встречаемости этого гена зародышевой линии также значимо снижается. При этом единственный ген IGHV4-31, наоборот, при РС чаще встречается как в общем пуле В-клеток, так и в субпопуляции транзиторных Breg. Это коррелирует с ранее опубликованными данными о повышенном содержании семейства IGHV4 в репертуаре В-клеток из периферической крови и цереброспинальной жидкости пациентов с РС [30, 31].

 

Рис. 1. Частота встречаемости генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные фрагменты тяжелой цепи (VH) иммуноглобулинов у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Проанализировано 49 функциональных генов VH в группах пациентов с РС, с доброкачественным течением РС (ДРС) и с высокоактивным РС (ВАРС). Контроль (К) – частота встречаемости генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Сравнивали распределение репертуара генов зародышевой линии между общим пулом В-клеток периферической крови (CD19⁺) и транзиторными Breg (tBreg) с фенотипом CD19⁺CD24^highCD38^high. Cравнение пациентов с разными типами течения РС и условно здоровых доноров изображено на гистограммах, где приведено среднее для каждой группы пациентов значение (mean±SD) доли последовательностей Ig, относящихся к указанному гену зародышевой линии. Справа от гистограммы приведена доля иммуноглобулиновых последовательностей, относящихся к указанному гену зародышевой линии, по отдельности для каждого пациента; сравниваются общий пул периферических В-клеток (total – серые точки) и субпопуляция транзиторных регуляторных В-клеток (tBreg – зеленые точки). Приведены данные только для тех генов зародышевой линии, у которых выявлены статистически значимые различия хотя бы одного анализируемого параметра (сравнение разных типов течения РС против условно здоровых доноров – тест Манна–Уитни; сравнение общего пула В-клеток с субпопуляцией транзиторных Breg (tBreg) – парный t-тест; изображены только статистически значимые значения p-value)

 

Репертуар генов, кодирующих легкие цепи иммуноглобулинов Breg, различается также у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Гермлайн IGKV1-12, встречающийся в норме примерно в 2% иммуноглобулиновых последовательностей, падает ниже 1% при ВАРС (рис. 2). При более легком течении заболевания (ДРС) частота этого гена не отличается от частоты у условно здоровых доноров. Ген зародышевой линии IGKV1-33 встречается реже уже не только у пациентов с ВАРС, но и в объединенной группе больных РС, включающей оба течения заболевания. Гены IGKV2D-24, IGKV3-11 и IGKV6D-21, наоборот, значительно чаще встречаются у пациентов с ВАРС, чем у условно здоровых доноров. Гены IGKV2D-29, IGKV3D-20 и IGKV6-21 встречаются чаще как у пациентов с ВАРС, так и в группе РС в целом. Следует заметить, что распределение генов зародышевой линии, кодирующих легкую каппа-цепь, в популяции транзиторных Breg не отличается статистически значимо у пациентов с ДРС и условно здоровых доноров.

 

Рис. 2. Частота встречаемости генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные фрагменты легкой каппа-цепи (Vκ) иммуноглобулинов у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Проанализирован 41 функциональный ген Vκ у пациентов с РС, пациентов с доброкачественным течением РС (ДРС) и высокоактивным РС (ВАРС). Контроль (К) – частота встречаемости генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Сравнивали распределение репертуара генов зародышевой линии между общим пулом В-клеток периферической крови (CD19⁺) и транзиторными Breg (tBreg) с фенотипом CD19⁺CD24^highCD38^high. Cравнение пациентов с разными типами течения РС и условно здоровых доноров изображено на гистограммах, где приведено среднее для каждой группы пациентов значение (mean±SD) доли последовательностей Ig, относящихся к указанному гену зародышевой линии. Справа от гистограммы приведена доля иммуноглобулиновых последовательностей, относящихся к указанному гену зародышевой линии, по отдельности для каждого пациента; сравниваются общий пул периферических В-клеток (total – серые точки) и субпопуляция транзиторных регуляторных В-клеток (tBreg – зеленые точки). Приведены данные только для тех генов зародышевой линии, у которых выявлены статистически значимые различия хотя бы одного анализируемого параметра (сравнение разных типов течения РС против условно здоровых доноров – тест Манна–Уитни; сравнение общего пула В-клеток с субпопуляцией транзиторных Breg (tBreg) – парный t-тест; изображены только статистически значимые значения p-value)

 

При анализе изотипа лямбда легкой цепи аналогично наблюдаются различия в распределении генов зародышевой линии (рис. 3). Гермлайн IGLV1-36 практически не встречается у здоровых доноров и ДРС, но его частота резко возрастает до 0.5% у пациентов с ВАРС. Частота встречаемости генов зародышевой линии IGLV1-44 и IGLV3-21 повышена при любом типе течения РС, однако статистически значимые различия наблюдаются только между пациентами с ВАРС и условно здоровыми донорами. Распределение гермлайнов IGLV2-8, IGLV2-14 и IGLV2-23 не различается между пациентами с ДРС и условно здоровыми донорами, но их частота резко падает при развитии ВАРС. Интересно, что представленность гена зародышевой линии IGLV7-43, наоборот, находится примерно на одинаковом уровне у пациентов с ВАРС и условно здоровых доноров, но резко уменьшается у пациентов с ДРС.

 

Рис. 3. Частота встречаемости генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные фрагменты легкой лямбда-цепи (Vλ) иммуноглобулинов у пациентов с РС и условно здоровых доноров. Проанализировано 26 функциональных Vλ генов у пациентов с РС, пациентов с доброкачественным течением РС (ДРС) и высокоактивным РС (ВАРС). Контроль (К) – частота встречаемости генов иммуноглобулинов у условно здоровых доноров. Сравнивали распределение репертуара генов зародышевой линии между общим пулом В-клеток периферической крови (CD19⁺) и транзиторными Breg (tBreg) с фенотипом CD19⁺CD24^highCD38^high. Cравнение пациентов с разными типами течения РС и условно здоровых доноров изображено на гистограммах, где приведено среднее для каждой группы пациентов значение (mean±SD) доли последовательностей Ig, относящихся к указанному гену зародышевой линии. Справа от гистограммы приведена доля иммуноглобулиновых последовательностей, относящихся к указанному гену зародышевой линии, по отдельности для каждого пациента; сравниваются общий пул периферических В-клеток (total – серые точки) и субпопуляция транзиторных регуляторных В-клеток (tBreg – зеленые точки). Приведены данные только для тех генов зародышевой линии, у которых выявлены статистически значимые различия хотя бы одного анализируемого параметра (сравнение разных типов течения РС против условно здоровых доноров – тест Манна–Уитни; сравнение общего пула В-клеток с субпопуляцией транзиторных Breg (tBreg) – парный t-тест; изображены только статистически значимые значения p-value)

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунологические исследования XXI века подтвердили ключевую роль В-регуляторного звена в поддержании иммунотолерантности, контроле и подавлении воспалительного ответа. На сегодняшний день все еще остается множество открытых вопросов о точном механизме регуляции, но очевидно, что нарушения в количестве Breg и их функционировании приводят к возникновению целого ряда иммунологических патологий, среди которых особенно выделяется РС. Детальное прояснение механизмов регуляции воспалительного ответа Breg позволит не только определить этиологию аутоиммунных патологий, но и может способствовать созданию терапии на основе Breg в ближайшем будущем. Иммуноглобулины, экспонированные как антиген-специфичные рецепторы на поверхности В-клеток, а также в виде секретируемых антител играют важную роль в иммунном ответе. Прогресс последних лет в области широкомасштабного секвенирования позволяет исследовать репертуары иммуноглобулинов с беспрецедентно высоким уровнем детализации [32]. Таким образом, изучение структуры и функций иммуноглобулинов, их специфичности и эпигенетического статуса представляется чрезвычайно важным для понимания фундаментальных основ возникновения и прогрессии РС. В последние годы обнаруживается все больше закономерностей и стереотипных ответов антител, когда у разных индивидов вырабатываются иммуноглобулины, распознающие определенные антигенные эпитопы с использованием одних и тех же генов IgV [32–34]. Другими словами, определенные зародышевые линии иммуноглобулинов проявляют тропность к определенным антигенам. Соответственно, вариации использования некоторых генов зародышевой линии могут быть связаны с различной способностью организма генерировать эффективный иммунный ответ, что может проявляться в виде предрасположенности к различным заболеваниям, в том числе и аутоиммунной природы. Вполне вероятно, что различия в частоте встречаемости генов зародышевой линии у каждого конкретного индивида могут быть результатом противовирусного или аутоиммунного ответа организма. До начала антигензависимой дифференцировки В-клеток, обусловленной соматической гипермутацией генов иммуноглобулинов, разнообразие незрелых В-клеток, к которым относятся и транзиторные Breg, практически полностью обусловлено конфигурацией генов зародышевой линии организма (V(D)J-рекомбинация). Поэтому детальное изучение репертуара иммуноглобулинов незрелых В-клеток у пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями, в том числе РС, поможет обнаружить, какие именно перестройки в генах зародышевой линии способны приводить к функциональным нарушениям иммунной системы.

В настоящей работе показано, что распределение генов зародышевой линии иммуноглобулинов в популяции транзиторных Breg у больных РС отличается от распределения у условно здорового человека. Особенно значимые отличия наблюдаются для гермлайнов IGLV1-44 и IGHV2-5. Ген лямбда-цепи IGLV1-44 практически не представлен в субпопуляции транзиторных Breg условно здорового человека, но достоверно проявляется у пациентов с РС. При РС гермлайн IGHV4-31 встречается чаще как в общем пуле В-клеток, так и в субпопуляции транзиторных Breg. С зародышевыми линиями IGHV2-26, IGHV2-5, IGHV2-70 тяжелой цепи наблюдается обратная картина – эти гермлайны, представленные, хоть и в небольшом количестве, практически у каждого здорового индивида, исчезают при развитии РС. При этом отличия от нормальных значений увеличиваются в случае более тяжелой формы заболевания. Интересно отметить, что ранее мы обнаружили также более существенные отличия в количестве транзиторных Breg и уровне их зрелости у пациентов с ВАРС по сравнению с ДРС и условно здоровыми донорами [20]. Таким образом, нами показано, что более значимые сдвиги в репертуаре субпопуляции транзиторных В-регуляторных клеток с фенотипом CD19⁺CD24^highCD38^high ассоциированы с осложненным течением РС. В целом, для всех зародышевых линий, кроме IGLV1-44, мы наблюдаем сходную картину – если при развитии РС изменяется частота встречаемости данного гена в общем пуле циркулирующих В-клеток, то сходная картина выявляется также и у транзиторных В-регуляторных клеток. Таким образом, отклонения в распределении генов иммуноглобулиновых рецепторов при развитии аутоиммунной патологии РС могут быть предопределены генетически и происходят уже на ранней стадии созревания В-клеток. Дальнейшее развитие этой гипотезы требует расширения когорт пациентов, а также изучения различий в структуре и специфичности В-клеточных рецепторов других субпопуляций Breg.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 18-74-10079 «Самособирающиеся генетически кодируемые наноконтейнеры как инструмент лечения рассеянного склероза», гранта РФФИ № 17-00-00229 (получение периферической крови больных рассеянным склерозом и здоровых доноров) и проекта 075-15-2021-1033 (13.2251.21.0111) в терминах широкомасштабного секвенирования.

Клеточный сортинг проводили с использованием оборудования, предоставленного ИБХ Центром коллективного пользования (ЦКП ИБХ РАН), поддержан Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (075-15-2020-807).

Об авторах

Яков А. Ломакин

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 117997

Лейла Александровна Овчинникова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: leyla_ovchinnikova@yahoo.com
Россия, Москва, 117997

М. Н. Захарова

Научный центр неврологии

Email: lomakin@ibch.ru

6 неврологическое отделение

Россия, Москва, 125367

М. В. Иванова

Научный центр неврологии

Email: lomakin@ibch.ru

6 неврологическое отделение

Россия, Москва, 125367

Т. О. Симанив

Научный центр неврологии

Email: lomakin@ibch.ru

6 неврологическое отделение

Россия, Москва, 125367

М. Р. Кабилов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Новосибирск, 630090

Н. А. Быкова

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 119991

В. С. Мухина

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 119991; Москва, 127051

А. Н. Каминская

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 117997

А. Е. Тупикин

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Новосибирск, 630090

М. Ю. Захарова

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 117997

А. В. Фаворов

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 119991

С. Н. Иллариошкин

Научный центр неврологии

Email: lomakin@ibch.ru

6 неврологическое отделение

Россия, Москва, 125367

А. А. Белогуров

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава России

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 117997; Москва, 127473

А. Г. Габибов

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: lomakin@ibch.ru
Россия, Москва, 117997; Москва, 119991

Список литературы

Дополнительные файлы