Влияние нового соединения, проявляющего гипогликемическую активность, на процессы репродукции крыс-самок

Полный текст

Доклинические исследования новых фармакологических веществ, проявляющих гипогликемическую активность на процессы репродукции, представляют большой интерес и являются актуальными. Новое соединение дипиарон синтезировано ЗАО «ИИХР» Московская обл., г. Химки, Россия. Раннее проведенные исследования [1, 2, 3], показали наличие у него высокой гипогликемической активности и низкой токсичности [4]. При этом было установлено, что терапевтическая эффективность соединения проявляется в дозе 0,5 мг/кг, что составляет 1/800 от ЛД₅₀ [4].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследовать влияние дипиарона на процессы пре- и постнатального развития плодов.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 100 конвенциональных белых крысах самках 4-месячного возраста, закупленных в питомнике ГУП НИИГТиП МЗ РФ (г. Волгоград) и прошедших двухнедельный карантин до начала исследования. Содержание животных и проводимых манипуляций проводилось с учетом методических рекомендаций «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» 2012 г. [5]и Межгосударственного стандарта ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Для проведения исследования крысы самки были подразделены на 5 групп по 20 особей в каждой. На первом этапе исследования дипиарон вводили внутрижелудочно крысам самкам с 6-го по 16-й дни беременности в дозах 0,5 мг/кг (опытная 1-я группа) и 100 мг/кг (опытная 2-я группа). На втором этапе это соединение в дозе 100 мг/кг вводили внутрижелудочно крысам самкам с 6-го дня беременности и до родов (опытная 3-я группа). Крысам самкам контрольных групп (соответственно 1 и 2) в эти же сроки вводили внутрижелудочно дистиллированную воду, которую использовали в качестве растворителя исследуемого соединения.

Первым днем беременности у крыс самок, накануне спаренных с интактными самцами, считали день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке [5]. Забеременевших самок размещали по одной особи в пластиковые клетки на подстиле из мелких древесных стружек на весь период наблюдений. У этих крыс самок оценивали общее состояние и прирост массы тела. Измерение массы тела у них проводили на первый, шестой, шестнадцатый и двадцатый дни беременности. Вес тела выражали в г, а прирост относительно первого дня – в процентах. На 20-й день беременности крыс самок 1-й и 2-й опытных групп подвергали эвтаназии (метод дислокации шейных позвонков) и некропсии, а самок 3-й опытной группы оставляли до родов. При некропсии у беременных крыс самок 1-й и 2-й опытных групп выделяли яичники и рога матки, в которых подсчитывали количество желтых тел беременности, живых и резорбированных плодов, мест имплантаций. На основании полученных результатов рассчитывали эмбриональную гибель. После макроскопического обследования выделенных плодов проводили их взвешивание, измерение краниокаудального размера и определение пола. Затем часть плодов фиксировали в жидкости Буэна по методу Вильсона для изучения состояния внутренних органов, другую – фиксировали в этаноле 96^о, с последующим окрашиванием скелета ализарином, по методу Доусона для изучения состояния скелета [5]. За беременными крысами самками 3-й опытной группы продолжали проводить наблюдения до родоразрешения, а в последующем наблюдения вели за потомством крысят до достижения ими двухмесячного возраста. У развивающихся крысят отмечали: общее состояние, прирост массы тела, параметры формирования физического развития и сенсорно-двигательных рефлексов, а также двигательное и эмоциональное поведение (тест «открытое поле»), способность к обучению и запоминанию (тест «УРПИ») [5].

Полученные данные подвергали статистической обработке в программе Microsoft Exсel, с использованием t критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам наблюдений первого этапа исследований у крыс самок в 1-й и 2-й опытных группах относительно 1-й контрольной группы не обнаруживалось изменений в общем состоянии и поведении на протяжении всего периода беременности. Прирост массы тела у крыс самок в 1-й опытной группе был положительным и практически соответствовал контрольным показателям. У крыс самок 2-й опытной группы прирост массы тела статистически незначимо снижался в среднем на 22,5 Δ% по сравнению с контролем (табл. 1).

 

Таблица 1

Влияние дипиарона (внутрижелудочно, 6–16-й дни беременности) на прирост массы тела беременных крыс, г, М ± m (%)

Периоды измерений, дни	Контрольная группа 1 дистиллированная вода	Опытная группа 1 дипиарон, 0,5 мг/кг	Опытная группа 2 дипиарон, 100 мг/кг
Исход	229,00 ± 6,79	228,6 ± 4,4	227,10 ± 4,76
6	250,90 ± 5,57	249,40 ± 5,68	251,10 ± 6,82
16	290,10 ± 6,99 (26,7)	283,10 ± 5,58 (23,8)	274,20 ± 6,71 (20,7)
20	305,00 ± 7,83	302,80 ± 6,75	294,60 ± 9,13

 

По результатам проведения некропсии у крыс самок в 1-й опытной группе не обнаружено достоверных изменений, но отмечена тенденция снижения послеимплантационной гибели плодов в 2,3 раза (p > 0,05) и числа резорбций относительно контрольных значений (табл. 2). У крыс самок во 2-й опытной группе прослеживалась тенденция увеличения доимплантационной гибели пло-дов в 3,3 раза (p < 0,05), но снижения плодовитости на 34,9 % (p < 0,05) и отсутствие послеимплантационной гибели плодов. Наряду с этим необходимо отметить, что у выделенных плодов от самок этих опытных групп относительно контроля прослеживалась тенденция дозозависимого повышения массы тела на 4,8 % (p > 0,05) и 9,5 % (p > 0,05) соответственно и краниокаудальных размеров. Также при визуальном обследовании плодов в этих опытных группах не отмечено уродств, аномалий развития и подкожных геморрагий.

 

Таблица 2

Влияние дипиарона (внутрижелудочно, 6–16-й дни беременности) на процессы эмбрионального развития плодов, М ± m

Параметры на одну самку	Контрольная группа 1 дистиллированная вода	Опытная группа 1 дипиарон, 0,5 мг/кг	Опытная группа 2, дипиарон, 100 мг/кг
Желтые тела, абс.	12,60 ± 0,79	12,6 ± 0,6	11,30 ± 0,65
Места имплантаций, абс.	11,20 ± 0,76	10,30 ± 0,52	7,3 ± 0,4*
Резорбции, абс.	0,30 ± 0,15	0,1 ± 0,1	0,20 ± 0,13
Плоды, абс.	10,90 ± 0,62	10,20 ± 0,51	7,10 ± 0,31*
Доимплантационная гибель, %	10,6 ± 3,5	17,60 ± 3,85	35,30 ± 1,07*
Послеимплантационная гибель, %	2,10 ± 1,07	0,90 ± 0,91	2,20 ± 1,48
Размеры, см	3,10 ± 0,02	3,20 ± 0,07	3,20 ± 0,05
Масса, г	2,10 ± 0,12	2,20 ± 0,06	2,30 ± 0,11

* p < 0,05 – результаты статистически значимы относительно контрольной группы

 

Оценивая процессы оссификации скелета у плодов в 1-й и 2-й опытных группах, обнаружили дозозависимую тенденцию увеличения числа оссифицированных точек в области грудины на 6,2 % (p > 0,05) и 12,5 % (p < 0,05) соответственно и пястны на 3,7 % (p > 0,05) и 11,1 % (p < 0,05) соответственно по отношению к 1-й контрольной группе. На послойных срезах у этих плодов в опытных группах не зарегистрировано дефектов развития и кровоизлияний во внутренние органы, что может свидетельствовать об отсутствии повреждающего влияния дипиарона на качество антенатального развития плодов.

Таким образом, из результатов, проведенных на первом этапе исследований, можно предположить, что дипиарон в дозах 0,5 мг/кг и 100 мг/кг при внутрижелудочном введении крысам самкам с 6-й по 16-й дни беременности не оказывает повреждающего влияния на качество пренатального развития плодов, не вызывает у них уродств и аномалий развития.

Учитывая то, что дипиарон, вводимый крысам самкам с 6-го по 16-й дни беременности в дозе 100 мг/кг не оказывает эмбрио- и фетотоксического действия, при этом несколько снижает плодовитость, но способствует повышению массы тела плодов и процессов оссификации скелета, сочли целесообразным на втором этапе исследований это соединение вводить крысам самкам с 6-го дня беременности и до родов в дозе 100 мг/кг.

При проведении второго этапа исследований установлено, что в период молочного вскармливания потомства прирост массы тела крыс самок 3-й опытной группы был практически сопоставим контрольным значениям. При этом различий по особенностям периода гнездования крыс самок перед родами и отношения их к появившемуся потомству не выявлялось. Случаев отказа от вскармливания крысой матерью новорожденных крысят не наблюдалось.

В физическом развитии потомств крыс 3-й опытной группы была отмечена достоверная тенденция большего прироста их массы тела относительно контроля на протяжении всего периода 2-месячных наблюдений (табл. 3).

 

Таблица 3

Масса тела крысят (крысам-матерям дипиарон вводили внутрижелудочно, с 6-го дня беременности по день родов) в постнатальный период развития, М ± m, г

Периоды измерений, дни	Контрольная группа 2 дистиллированная вода	Опытная группа 3 дипиарон, 100 мг/кг
Самцы
4	8,30 ± 0,18	8,50 ± 0,29
7	10,3 ± 0,2	11,70 ± 0,52*
14	15,10 ± 0,35	22,80 ± 0,42*
21	20,90 ± 0,59	31,50 ± 0,57*
30	30,30 ± 0,55	54,60 ± 0,58*
60	113,80 ± 0,76	152,50 ± 0,66*
Самки
4	8,40 ± 0,22	8,10 ± 0,27
7	10,40 ± 0,46	11,80 ± 0,30*
14	15,70 ± 0,65	22,90 ± 0,43*
21	21,00 ± 0,57	31,80 ± 0,51*
30	30,10 ± 0,85	53,10 ± 0,43*
60	115,60 ± 0,67	153,1 ± 0,6*

* р < 0,05 – результаты статистически значимы относительно контрольной группы.

 

Наряду с этим у крысят в опытной группе относительно контроля достоверно опережались сроки прорезывания резцов (1,5 дня, p < 0,05), открытия глаз (1,7 дня, p < 0,05), вагины у самок (7,2 дня, p < 0,05), а также сроки формирования зрачкового рефлекса (1,7 дня, p < 0,05), избегания обрыва, вызванного визуальным стимулом (1,7 дня, p < 0,05), рефлекса переворачивания на плоскости (0,3 дня, p < 0,05) и в свободном падении (0,7 дня, p < 0,05), избегание обрыва (0,1 дня, p < 0,05), мышечная сила (1,0 дня, p < 0,05), но запаздывали сроки опускания семенников у самцов (0,5 дня, p < 0,05) и рефлекса «отрицательный геотаксис» (0,5 дня, p < 0,05), тогда как по другим параметрам достоверных различий не обнаружено (табл. 4).

 

Таблица 4

Физическое развитие крысят (крысам матерям дипиарон вводили внутрижелудочно, с 6-го дня беременности по день родов) в постнатальный период, М ± m

Параметры, дни	Контрольная группа 2 дистиллированная вода	Опытная группа 3 дипиарон, 100 мг/кг
Отлипание ушной раковины	3,70 ± 0,12	3,60 ± 0,11
Появление волосяного покрова	4,70 ± 0,06	4,60 ± 0,09
Прорезывание резцов	8,50 ± 0,13	7,00 ± 0,09*
Открытие глаз	17,40 ± 0,16	15,70 ± 0,22*
Опускание семенников	26,10 ± 0,05	26,60 ± 0,23*
Открытие вагины	57,60 ± 0,86	50,40 ± 0,88*
Переворачивание на плоскости	4,70 ± 0,06	4,40 ± 0,10
Отрицательный геотаксис	6,40 ± 0,06	6,90 ± 0,19*
Избегание обрыва	8,60 ± 0,14	8,50 ± 0,23*
Зрачковый рефлекс	17,40 ± 0,16	15,70 ± 0,21
Избегание обрыва, вызванное визуальным стимулом	17,40 ± 0,16	15,70 ± 0,21
Мышечная сила	19,60 ± 0,14	18,60 ± 0,15
Переворачивание в свободном падении	20,10 ± 0,10	19,40 ± 0,13

* р < 0,05 – результаты статистически значимы относительно контрольной группы .

 

В поведенческой активности потомств опытной группы крысят на 20- и 45-дневного возраста (тест «открытое поле»), относительно контроля, установлено увеличение локомоторной (число горизонтальных передвижений, вертикальных стоек) и эмоциональной активностей (акты груминга и дефекаций), но снижение исследовательской активности (заглядывания в напольные отверстия). При изучении формирования памятного следа (тест «УРПИ») у крысят опытной и контрольной групп достоверных различий процессов обучаемости не обнаружено.

Таким образом, из полученных результатов исследований второго этапа можно предположить, что дипиарон при внутрижелудочном введении беременным крысам самкам в дозе 100 мг/кг с 6-го дня беременности и до родов не оказывает повреждающего действия на процессы постнатального развития крысят. При этом у потомств крысят указанное соединение способствует большему приросту массы тела, формированию сенсорно-двигательных рефлексов, активации двигательной и эмоциональной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дипиарон при внутрижелудочном введении беременным крысам в дозах 0,5 и 100 мг/кг в период органогенеза не влияет на их общее состояние и не оказывает эмбрио- и фетотоксического действия, регистрируемого в антенатальный период развития.

Дипиарон в дозах 0,5 и 100 мг/кг, вводимый крысам самкам в период органогенеза не повреждает процессы формирования закладки внутренних органов, не вызывает уродств и аномалий развития, способствует активизации массы тела плодов и процессов оссификации скелета.

У потомств крыс от самок, получавших дипиарон в дозе 100 мг/кг в период с 6-го дня и до родов, повышается прирост массы тела, ускоряются процессы физического развития и сенсорно-двигательных рефлексов, активизируется двигательное и эмоциональное поведение.

Об авторах

Любовь Ивановна Бугаева

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: li_bugaeva@mail.ru

доктор биологических наук, заместитель директора, заведующая лабораторией токсикологии, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград; Волгоград

Татьяна Дмитриевна Денисова

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Автор, ответственный за переписку.
Email: tanyaddenisova@mail.ru

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории токсикологии, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград; Волгоград

Иван Николаевич Тюренков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: fibfuv@mail.ru

член-корреспондент РАН, профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой фармакологии и фармации, Институт непрерывного медицинского и фармацевтического образования

Россия, Волгоград

Владимир Иванович Петров

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: brain@sprintnet.ru

академик РАН, заслуженный деятель науки РФ, заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, директор, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград

Наталья Сергеевна Мелихова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: bugnatasha7@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории токсикологии, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград

Список литературы