Влияние аминалона и пикамилона на активацию инфламмасомы NLRP3 в панкреатоцитах при аллоксан-индуцированном сахарном диабете

Полный текст

Инфламмасома NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3), или криопирин, – цитоплазматический мультибелковый комплекс, который расщепляет и активирует про-каспазу-1, что приводит к секреции ключевых провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18 [1, 2]. Выдвинуто предположение, что активация NLRP3 является критическим триггером функционального нарушения и повреждения β-клеток поджелудочной железы (ПЖ) при сахарном диабете (СД) 2-го типа. Устойчивая гипергликемия индуцирует образование активных форм кислорода в островках поджелудочной железы, что приводит к увеличению синтеза тиоредоксин-взаимодействующего белка (TXNIP), который, в свою очередь, активирует инфламмасомы NLRP3. Кроме того, высокое содержание глюкозы в крови может привести к повышению экспрессии островкового амилоидного пептида (IAPP)/амилина в макрофагах, который является вторым стимулом активации воспаления NLRP3 посредством инициирования взаимодействия NLRP3 с апоптоз-ассоциированным белком, содержащим домен для рекрутирования каспазы (ASC) [3].

Во многих отечественных и зарубежных работах показано, что ГАМК подавляет иммунные и воспалительные реакции, ингибирует пролиферацию Т-клеток [4], ингибирует активацию транскрипционного фактора NF-κB, который отвечает за продукции провоспалительных цитокинов [5] и инфламмасомы NLRP3 [4, 6]. Однако влияние ГАМК на активность инфламмасомы при сахарном диабете не изучалось.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Сравнительное изучение влияние коммерческих ГАМК-ергических препаратов (аминалон и пикамилон) на раннюю модуляцию активности инфламассомы NLRP3 при экспериментальном аллоксан-индуцированном сахарном диабете у лабораторных крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Дизайн эксперимента. Исследование выполняли на 24 (4 группы по 6 животных в каждой) белых половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 250–300 г. Работа была одобрена локальным этическим комитетом ВолгГМУ, протокол № 2022/116 от 04.03.2022 г. При проведении эксперимента соблюдали международные рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Повреждение ПЖ у крыс моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана (Sigma) в дозе 130 мг/кг. Аллоксан (5,5-дигидроксил пиримидин-2,4,6-трион) является производным мочевины и аналогом глюкозы, который широко используется в качестве диабетогенного препарата в фармакологических исследованиях [7]. Были протестированы два препарата с ГАМК-ергическим действием: аминалон (гамма-аминомасляная кислота, «Органика») и пикамилон (никотиноил-гамма-аминомасляная кислота, «Фармстандарт-УфаВИТА»). Таблетки измельчали в дистиллированной воде и в виде взвеси перорально вводили животным в дозе 500 мг/кг (аминалон) и 250 мг/кг (пикамилон) на протяжении 5 суток до введения аллоксана и далее в течение 2 суток, после чего оценивали уровень гликемии после 4-часового голодания с использованием глюкометра Countur TS (Германия). Изучаемые препараты и дозы выбраны на основании данных литературы и по результатам собственных предварительных исследований. В качестве негативного контроля служили крысы, которым до (5 суток) и после (2 суток) введения аллоксана вводили физиологический раствор, а интактным контролем выступали крысы, которым проделывали все манипуляции с использованием изотонического раствора.

Иммуногистохимическое исследование. По окон- чании эксперимента (через 2 суток после введения аллоксана) крыс декапитировали под хлоралгидратным наркозом (800 мг/кг, в/бр.). Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования образцы тканей поджелудочной железы фиксировали в 10%-м нейтральном формалине. Затем образцы обезвоживали в батарее спиртов восходящей крепости, просветляли в хлороформе и заключали в парафиновую среду Histomix (Биовитрум, Россия). Парафиновые блоки резали на ротационном микротоме HM340E (MICROM, Германия), получали срезы толщиной 4 мкм и монтировали их на предметные стекла, обработанные поли-L-лизином (Menzel, Германия). При выполнении ИГХ исследования парафиновые срезы после депарафинизации и регидратации инкубировали 20 мин в 3%-й перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы. Постановку иммуногистохимических реакций проводили с помощью пероксидаза-полимерной системы визуализации N-Histofine MAX PRO (Nichirei, Япония) согласно инструкции производителя. Демаскировку антител осуществляли путем кипячения срезов при 100 ºС в 0,01 М цитратном буфере с рН = 6,0 в течение 20 мин. Срезы поджелудочной железы инкубировали с первичными антителами к NLRP3 (кроличьи, поликлональные, Abcam, Великобритания) при комнатной температуре в течение 1 ч. Пероксидазу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Морфометрия. Микропрепараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа AxioScope.A1 (ZEISS, Германия), оборудованного цифровой камерой AxioCam MRc5 A1 (ZEISS, Германия). Площадь, занимаемая иммунопозитивными экзокринными панкреатоцитами, оценивалась на 5 рандомизированных микрофотографиях образцов поджелудочной железы (ув. ×200) и рассчитывалась в % относительно общей оцениваемой площади среза с помощью программного обеспечения ZENpro 2012 (ZEISS, Германия).

Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали с использованием пакетов программ Statistica 7.0 (StatSoft, США). Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро – Уилка. В связи с наличием нормального распределения данных межгрупповые различия выявляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Апостериорные попарные сравнения выполняли с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок c поправкой Бонферрони (Bonferroni). Обобщенные данные представляли в виде среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (SD). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение экзокринной части ПЖ контрольных интактных животных с помощью ИГХ показало, что клетки, меченные антителами к NLRP3, составляли менее 5 % от их общего количества (табл. 1). В то же время в островках ПЖ положительная реакция на NLRP3 в виде нежной мелкодисперсной зернистости выявлялась в цитоплазме практически всех эндокринных клеток (рис. А).

В поджелудочной железе крыс из группы негативного контроля, которым до и после введения аллоксана вводили физиологический раствор, отмечали резкое увеличение площади панкреатоцитов (до 75 %), дающих положительную реакцию на инфламмасому NLRP3. При этом в части клеток, составляющих панкреатические ацинусы, иммунопозитивный материал выявлялся в виде крупных гранул, локализованных под мембранным пространством цитоплазмы. В единичных сохранившихся островках Лангерганса после аллоксан-индуцированного СД отмечали незначительное увеличение содержание NLRP3 по сравнению с контрольными животными (рис. Б).

 

Рис. Иммунолокализация NLRP3 в поджелудочной железе (Антитела к NLRP3. Пероксидазно-антипероксидазный-метод. Ядра окрашены гематоксилином Майера. Ув. ×400): А – интактной крысы; Б – опытной крысы с индуцированным СД; В – опытной крысы, получавшей аминалон до и после индуцированного СД; Г – опытной крысы, получавшей пикамилон до и после индуцированного СД

 

Профилактическое введение подопытным крысам аминалона в течение 5 суток до острого аллоксан-индуцированного СД с последующей пролонгацией еще 2 суток эффективно подавляло активность NLRP3, на что указывало значимое снижение общей площади иммунопозитивных панкреоцитов до 21 % по сравнению с показателем в группе животных, которым терапию не проводили (табл. 1, рис. В). В инсулоцитах сохранившихся островков экспрессия NLRP3, определяемая иммуногистохимическим методом, отсутствовала. Однако обращало на себя внимание присутствие в эндокринных островках клеток с положительной реакцией на NLRP3, фенотипические признаки которых соответствовали плазматическим клеткам (рис. В).

У животных, которым профилактически вводили пикамилон за 5 суток до введения панкреотоксина и в течение 2 суток после его инъекции, регистрировали значимое снижение активности NLRP3: площадь иммунопозитивных панкреатоцитов составляла не более 40 %. При этом большая часть NLRP3+ клеток имела очаговый характер пространственного распределения в экзокринной части ПЖ. В островках ПЖ иммунопозитивный материал обнаруживался не только в цитоплазме эндокриноцитов, но и в цитоплазме плазматических клеток (табл. 1, рис. Г).

Анализ гликемического статуса у экспериментальных крыс показал, что уровень глюкозы в группах животных, получавших аминалон и пикамилон, был незначительно ниже, чем в группе с аллоксан-индуцированным сахарном диабетом (табл. 2).

 

Таблица 1. Площадь NLRP3+ клеток в экзокринной части поджелудочной железы (М ± SD), %%

Группа животных
Контроль (n = 30)	СД + физраствор (n = 30)	СД + аминалон (n = 30)	СД + пикамилон (n = 30)
4,10 ± 0,79	75,19 ± 7,69*	21,30 ± 5,44*#	39,31 ± 5,24*#

 

Статистически значимые различия (p ≤ 0,05) по сравнению с *интактным контролем, #группой животных с аллоксан-индуцированным сахарным диабетом, получавших физиологический раствор.

Примечание: n – количество исследуемых полей зрения препаратов поджелудочной железы.

 

Таблица 2. Уровень глюкозы в крови подопытных животных (М ± SD), ммоль/л

Группа животных
Контроль (n = 6)	СД + физраствор (n = 6)	СД + аминалон (n = 6)	СД + пикамилон (n = 6)
4,4 ± 0,6	32,2 ± 1,9*	29,1 ± 3,4*	27,8 ± 4,5*

Статистически значимые различия (p ≤ 0,05) по сравнению с *интактным контролем.

 

Аллоксан как панкреотоксический фактор является клеточным стрессором, нарушающим гомеостаз, запускающим процессы гибели клеток. В эти патологические процессы вовлекаются инфламмасомы. Эти мультибелковые гетеромерные комплексы, вследствие активации каспазы 1, провоспалительных интерлейкинов в значительной степени влияют на развитие процессов, приводящих к апоптозу клеток [2].

Некоторые исследователи при изучении антидиабетического потенциала ГАМК отмечали дефицит аминокислоты в панкреатических островках на фоне уменьшения массы β-клеток [6], что обосновывает целесообразность применения производных ГАМК для профилактики гибели β-клеток вследствие подавления активности инфламассомы NLRP3 и продукции провоспалительных цитокинов. Наше исследование косвенным образом подтверждает эти данные, демонстрируя, с одной стороны, увеличение содержания иммунореактивного материала в экзокриноцитах ПЖ к антителам против NLRP3 при моделировании аллоксанового СД, а с другой – ингибирование воспалительной инфламассомы при применении ГАМК-ергических препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что препараты с ГАМК-ергическим действием – аминалон и пикамилон, при введении в течение 5 суток до инъекции аллоксана и в течение 2 суток после его введения значительно подавляли активацию инфламассомы NLRP3 в панкреатоцитах, тем самым способствуя сохранению функций поджелудочной железы.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 21-15-00192 от 19.04.2021 г.

Funding. The work was carried out with the financial support of the RGNF grant No. 21-15-00192 dated 04/19/2021.

Об авторах

Иван Николаевич Тюренков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: fibfuv@mail.ru

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии и фармации, Институт непрерывного медицинского и фармакологического образования

Россия, Волгоград

Юлия Ивановна Великородная

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Автор, ответственный за переписку.
Email: alta-u@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории токсикологии, Научный центр инновационных лекарственных средств, научный сотрудник лаборатории патоморфологии, Волгоградский медицинский научный центр; аспирант кафедры фармакологии и фармации, Институт непрерывного медицинского и фармакологического образования, Волгоградский государственный медицинский университет

Россия, Волгоград; Волгоград

Дмитрий Александрович Бакулин

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: mbfdoc@gmail.com

кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической фармакологии и интенсивной терапии, Волгоградский государственный медицинский университет; старший научный сотрудник лаборатории фармакологии сердечно-сосудистых средств, Научный центр инновационных лекарственных средств, Волгоградский государственный медицинский университет

Россия, Волгоград

Алексей Владимирович Смирнов

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: alexeysmirnov.volggmu@gmail.com

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии, Волгоградский государственный медицинский университет; заведующий лабораторией патоморфологии, Волгоградский медицинский научный центр

Россия, Волгоград; Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы