Генетическая модификация и маркировка клеточных линий


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Резюме. Несмотря на большие достижения в изучении биологии стволовых клеток, темных пятен по-прежнему остается немало. Решить данную проблему помогают методы генетической модификации, которые могут быть использованы для отслеживания линий различных клеток, в первую очередь стволовых. Рассмотрены различные методы биотехнологических исследований, позволяющие оценить варианты внедрения новых генов в клетки и даже целые организмы, а также методы контроля их экспрессии во времени и пространстве, их активацию, дифференцировку и снижение функциональной активности, экспрессию нескольких целевых генов. Описаны варианты с мультицистронными векторами, кодирующими несколько белков. Охарактеризованы варианты внедрения генов с использованием плазмид, электропорации, их недостатки и преимущества. Перспективным и наиболее безопасным является ретровирусный вектор с использованием лентивирусных переносчиков, способных генерировать дополнительные копии самого себя, что является очень важным в сфере безопасности биотехнологии. Для получения вирусного вектора используется линия упаковочных клеток, обычно 293T-клетки. Охарактеризованы перспективы использования аденовирусного и аденоассоциированного векторов. Достижением современных биотехнологических методов является система коротких палиндромных повторов, расположенных группами, являющаяся уникальным инструментом редактирования генома. В основе этой системы лежит процесс вырезания последовательностей дезоксирибонуклеиновой кислоты, являющихся постоянными и поддерживающихся клетками независимо от последующих делений или изменения состояния. Система позволяет генетикам и медицинским исследователям редактировать части генома путем удаления, добавления или изменения последовательных участков дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Важной проблемой биотехнологических методов являются способы контроля экспрессии трансгенов. Сегодня достаточно эффективным является управление экспрессией с помощью фактора, присутствующего в самом векторе доставки гена и активного только в определенном типе клеток. Для регулирования экспрессии трансгена используется эндонуклеаза бактериофага P1, которая разрезает дезоксирибонуклеиновую кислоту только на конкретных участках. Данная система внедрена как в эукариотических, так и в прокариотических системах.

Об авторах

А. В. Москалев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург

Б. Ю. Гумилевский

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург

А. В. Апчел

Северо-Западный медицинский учебный центр последипломного образования

Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург

В. Н. Цыган

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Владимирская, Е.Б. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками / Е.Б. Владимирская, О.А. Майорова, С.А. Румянцев. – М.: Медицина и здоровье, 2007. – 392 с.
  2. Москалев, А.В. Общая иммунология с основами клинической иммунологии / А.В. Москалев, В.Б. Сбойчаков, А.С. Рудой. – М.: Гэотар-Медиа, 2015. – 351 с.
  3. Москалев, А.В. Аутоиммунные заболевания. Диагностика и лечение / А.В. Москалев [и др.]. – М.: Гэотар-Медиа, 2017. – 218 с.
  4. Ярилин, А. А. Иммунология / А.А. Ярилин. – М.: Гэотар-Медиа, 2010. – 957 с.
  5. Abbas, A.K. Cellular and Molecular Immunology. – 9-th edition / A.K. Abbas, A.H. Lichtman, S. Pillai. – Philadelphia, Pennsylvania: W. B. Saunders Company, 2018. – 565 p.
  6. Вhaya, D. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: Versatile small RNAs for adaptive defense and regulation / D. Bbhay [et al.] // Annu. Rev. Genet. – 2011. – Vol. 45. – P. 273–297.
  7. Cai, L. Suppression of hepatocyte growth factor production impairs the ability of adipose-derived stem cells to promote ischemic tissue revascularization / L. Cai [et al.] // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25. – P. 3234–3243.
  8. Dominici, M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement / M. Dominici [et al.] // Cytotherapy. – 2006. – Vol. 8. – P. 315–317.
  9. Hilton, I.B. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9 – based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers / I.B. Hilton [et al.] // Nat. Biotechnol. – 2015. – Vol. 33. – P. 510–517.
  10. Jeon, E.S. Sphingosylphosphorylcholine induces proliferation of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells via activation of JNK / E.S. Jeon [et al.] // J. Lipid Res. – 2006. – Vol. 47. – P. 653–664.
  11. Gilbert, L.A. CRISPR–mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes / L.A. Gilbert [et al.] // Cell, – 2013. – Vol. 154. – P. 442–451.
  12. Kern, S.E. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue / S.E. Kern [et al.] // Stem Cells. – 2006. – Vol. 24. – P. 1294–1301.
  13. Lee, J. Human adipose-derived stem cells display myogenic potential and perturbed function in hypoxic conditions / J. Lee [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2006. – Vol. 341. – P. 882–888.
  14. Li, B. Adipose tissue stromal cells transplantation in rats of acute myocardial infarction / B. Li [et al.] // Coron Artery Dis. – 2007. – Vol. 18. – P. 221–227.
  15. Lipinski, M.J. Impact o f intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials / M.J. Lipinski [et al.] // J. Am. Coli. Cardiol. – 2007. – Vol. 50. – P. 1761–1767.
  16. McDonald, J.I. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation / J.I. McDonald [et al.] // Biol. Open. – 2016. – Vol. 5. – P. 866–874.
  17. Miyahara, Y. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction / Y. Miyahara [et al.] // Nat Med. – 2006. – Vol. 12, № 4. – P. 459–465.
  18. Olson, K. Contemporary clinical immunology and serology / K. Olson, E. De Nardin. – New Jersey: Upper Saddle River, 2013. – 439 p.
  19. Rose, N.R. The autoimmune diseases. – fith edition / N.R. Rose, I.R. Mackay. – Philadelphia, 2018. – 1265 p.
  20. Schaffler, A. Concise review: Adipose Tissue derived stromal cells – basic and clinical implications for novel cell-based therapies / A. Schaffler, C. Buchler // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25. – P. 818–827.
  21. Sternberg, S.H. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9 / S.H. Sterberg // Nature. – 2014. – Vol. 507. – P. 62–67.
  22. Thakore, P.I. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements / P.I. Thakore [et al.] // Nat. Methods. – 2015. – Vol. 12. – P. 1143–1149.
  23. Wu, Y. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis / Y. Wu [et al.] // Stem Cells. – 2007. – Vol. 25. – P. 2648–2659.
  24. Zabriskie, J.B. Essential clinical immunology / J.B. Zabriskie – N. Y., 2009. – 362 p.
  25. Zetsche, B. Cpf1 is a single RNA – guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system / B. Zetsche [et al.] // Cell. – 2016. – Vol. 163. – P. 759–771.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема строения бицистронных векторов на ВСПР и 2А- последовательностей: а – экспрессия плазмид млекопитающих; б – внутренний участок посадки рибосом и 2А-последовательности; в – геном ретровируса. LTR – long terminal repeat (длинные концевые повторы). В векторе гены gag (капсидный белок), pol (обратная транскриптаза) и env оболочечный белок) заменяются интересующим геном; г – вектор лентивирусов. RRE – Rep response element (элемент ответа), cPPT – polypurine region (область полипурина), CMV – promoter for gene of interest (промотер гена «интереса»), WPRE – enhancer sequence (усиливающие последовательности); д – ITR – inverted terminal repeat (инвертированные терминальные повторы), E1–4 are early expressed genes (ранняя экспрессия генов, L1–5 are late genes (поздняя экспрессия генов). В векторе первого поколения ген E1, необходимый для репликации, заменяется вставкой; е – геном AAV. Повтор ITR. Два гена вектора заменяются геном «интереса»

Скачать (160KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Варианты транскрипции: а – P – промоутер; TA – тетрациклиновый активатор; DOX – доксициклин; ТRЕ – элемент реакции Тет; GOI – ген «интереса»; б – TSP – тканевый промоутер; UP – убиквитарный промоутер; в – ТАМ – тамоксифен; г – RISC РНК индуцированный подавляющий комплекс; AGO2 – Argonaute 2 (эндонуклеаза, белковый комплекс); д – CRISPR-Cas9. PAM – смежный мотив протосканера, sgRNA – одноцепочечная РНК, DSB – двухцепочечный разрыв; Non-homologous end joining (NHEJ) – негомологичный конец присоединения; homologous recombination (HR) – гомологичная рекомбинация

Скачать (177KB)
Метаданные

© Москалев А.В., Гумилевский Б.Ю., Апчел А.В., Цыган В.Н., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах