Разработка методики анализа длин рестрикционных фрагментов для оценки мефлохин-резистентности plasmodium falciparum на основе идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (A958146T, A961013G, G961625T) гена PFMDR1

Представлена методика идентификации единичных нуклеотидных полиморфизмов гена PfMDR1 (A958146T, A961013G, G961625T) на основе анализа длин рестрикционных фрагментов с использованием технологии полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами. Для идентификации полиморфизма A958146T (аминокислотная замена N86Y) предложено амплифицировать фрагмент паразитарной дезоксирибонуклеиновой кислоты длиной 417 bp, включающий 86-й кодон гена PfMDR1, с последующей обработкой ампликона эндонуклеазой ApoI, сайт рестрикции которой включает последовательность анализируемой мутации. При неизмененном генотипе Plasmodium falciparum выделенный участок дезоксирибонуклеиновой кислоты разделяется на 2 фрагмента размером 239 и 179 bp. В случае измененного генотипа, содержащего однонуклеотидную миссенс-мутацию A > T, сохранится исходный фрагмент 417 bp. При конструировании системы для выявления аминокислотной замены N1042D, обусловленной мутацией A961013G, была подобрана пара специфических праймеров, ограничивающих участок паразитарной дезоксирибонуклеиновой кислоты длиной 404 bp. Для проведения рестрикционного анализа наиболее оптимальным оказалось применение эндонуклеазы AseI, которая в случае неизмененного генотипа Plasmodium falciparum делит исходный ампликон на 4 фрагмента (132, 116, 99 и 25 bp), а при на наличии мутации A > G — на 3 (248, 99, 25 bp). Установлено, что фрагмент гена PfMDR1, включающий мутацию G961625T, приводящую к аминокислотной замене D1246Y, содержит 1 участок, соответствующий сайту рестрикции эндонуклеазы BglII. Поэтому в случае дикого генотипа Plasmodium falciparum исходный фрагмент дезоксирибонуклеиновой кислоты разрезается на 2 коротких участка (300 и 269 bp). При мутации D1246 замена нуклеотида G > T приводит к исчезновению сайта рестрикции, поэтому на электрофореграмме будет регистрироваться только 1 исходный фрагмент (509 bp). На основе анализа полученных данных разработаны критерии оценки лекарственной устойчивости Plasmodium falciparum. О снижении чувствительности к мефлохину и его производным возбудителей тропической малярии могут свидетельствовать положительные результаты, полученные при использовании разработанных методик выявления гаплотипов A > T (N86Y (бэнд 417 bp)), A > G (N1042D (бэнды 248, 99 и 25 bp)), G > T (D1246Y (509 bp)). Разработанные методики могут использоваться для анализа распространения лекарственно устойчивой тропической малярии.