Дексаметазон снижает уровни мРНК цитокинов и активность микроглии в стволе мозга новорожденных крыс

Полный текст

Введение

При развитии воспаления введение синтетического глюкокортикоида – дексаметазона подавляет экспрессию провоспалительных и стимулирует экспрессию антивоспалительных цитокинов, что оказывает иммунносупрессивный эффект [1–3]. Способность гормона снижать воспаление успешно используется в клинике. Вместе с тем, действие дексаметазона на экспрессию про- и антивоспалительных цитокинов в условиях нормального развития, а не стимулированного воспаления, остается открытым. Применение глюкокортикоидов в перинатальной медицине для купирования респираторного дистресс-синдрома новорожденных при угрозе преждевременных родов [4–6] делает вопрос о влиянии гормона на экспрессию цитокинов развивающегося мозга актуальным. Благодаря своей липофильной природе и незрелости гематоэнцефалического барьера, дексаметазон легко проникает в мозг, где основным “иммунным органом” является микроглия. Основные функции микроглии перинатального мозга включают в себя не только очищение клеток от продуктов физиологического апоптоза и борьбу с патогенами, но и, что более важно, участие в образовании корректных и функциональных синаптических контактов формирующихся нейронных сетей [7–9]. Следовательно, повышение уровня гормона в критический период развития мозга может изменить активность микроглии и тем самым повлиять на формирование связей между нейронами и организацию нейросетей, меняя функционирование мозга в дальнейшем. Известно, что стимуляция активности микроглии в раннем онтогенезе меняет у взрослых животных стресс-реактивность, иммунный ответ, увеличивает склонность к психопатологиям [10–13]. С целью выяснения влияния дексаметазона на уровни мРНК цитокинов в работе определяли динамику быстрых изменений уровней мРНК генов провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1 бета (Il1b), фактора некроза опухоли-альфа (Tnfa) и анти-воспалительных: интерлейкина 10 (Il10) и трансформирующего ростового фактора бета (Tgfb1), а также уровень экспрессии маркерного белка микроглии IBA1 в стволе мозга неонатальных крысят.

Методы исследования

Животные, введение препаратов, забор материала. В работе использовали неонатальных крысят Вистар обоего пола, содержавшихся по-пометно вместе с матерями в ЦКП Вивария конвенциональных животных ИЦиГ СО РАН. Животных содержали в соответствии с Директивой Европейского Парламента и Совета ЕС 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г., а также приказом 199н “Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики” Министерства Здравоохранения РФ, условия содержания были одобрены биоэтической комиссией ИЦиГ СО РАН – Протокол № 19 от 26 ноября 2013 года при свободном доступе к воде и корму, контролируемом световом режиме 14/10. Беременные самки были рассажены в индивидуальные клетки не позднее 18 дня беременности. День родов считали первым днем жизни. На второй день все пометы были выравнены до 8–10 крысят. Для нивелировки материнских эффектов в каждом помете находились животные контрольных и подопытных групп. Число животных было минимизировано до получения статистически достоверных результатов, каждая группа состояла из 10–12 животных, при этом в каждой экспериментальной группе были представлены крысята из не менее чем 3–4 разных пометов.

На 3-й день жизни крысятам вводили подкожно 0.2 мг/кг/20 мкл дексаметазона (KRKA, Словения), физиологический раствор (20 мкл), либо оставляли интактными. После инъекций крысят возвращали к матерям. Животных выводили из эксперимента быстрой декапитацией через 30, 60, 120, 240 и 360 минут после введений препаратов. Все манипуляции проводили в интервале с 09:00 до 15:00. Для определения уровней мРНК (n = 7–8) на холоду выделяли ствол мозга, включающий весь блок ткани позади четверохолмия – ростральную часть продолговатого мозга и область моста. Для иммуногистохимического анализа после холодового наркоза проводили транскардиальную перфузию крысят (n = 4) 0.02М фосфатно-солевым буфером (PBS) и 4% раствором параформальдегида в 0.02 М PBS, извлекали мозг и помещали в такой же фиксатор на 4 часа, а затем в 30% сахарозу в 0.02 М PBS для криопротекции.

Определение уровней мРНК. Суммарную РНК из образцов ствола мозга выделяли одностадийным гуанидин-изотиоцианатным методом, как описано нами ранее [14-16]. Синтез кДНК проводили из 3 мкг суммарной РНК c применением Oligo(dT) и ревертазы M-MuLV (“СибЭнзим”, Россия) в течение 90 мин при 42°С. Количественный анализ уровней мРНК цитокинов относительно мРНК гена домашнего хозяйства бета-актина проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием наборов TaqMan® Gene Expression Assays (Il1b: Rn00580432_m1; Tnfa: Rn00562055_m1; Il10: Rn99999012_m1; Tgfb1: Rn00572010_m1; Actb: Rn00667869_m1; Thermo Fisher Scientific, USA) на амплификаторе VIIA™7 (Thermo Fisher Scientific, USA) в соответствии с протоколом производителя и рассчитывали по методу ∆∆Сt.

Иммуногистохимия. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на сагиттальных срезах толщиной 20 мкм, собранных на адгезивных стеклах Superfrost plus (Термо, США). Неспецифическое связывание блокировали в 1.5% BSA в PBST (0.02М PBS с 0.2% Triton X-100). Использовали специфичные первичные антитела в разведении 1:250 для маркера микроглии IBA1 (ab178847, Abcam, США, rabbit) и тирозингидроксилазы (TН) (ab1542, Merck Millipore, sheep). Далее срезы инкубировали со вторичными антителами осла против IgG кролика с флуоресцентной меткой (Alexa-568, Biotium) и осла против IgG овцы с флуоресцентной меткой (Alexa-488, Jackson ImmunoResearch), каждое вторичное антитело брали в разведении 1:300.

Микрофотосъемки в области синего пятна ствола мозга (Locus coeruleus, LC) проводили на конфокальном микроскопе LSM 780 (“Carl Zeiss”, Германия). Общий уровень флуоресцентного свечения (для тирозингидроксилазы (ТН)), а также средний диаметр по 10 клеткам и количество клеток на 1 мм² среза мозга, экспрессирующих IBA1, подсчитывали с помощью программного обеспечения ZEN.

Статистический анализ. После проверки выборок на нормальность распределения по критерию Колмогорова, обработку данных проводили с использованием дисперсионного анализа ANOVA: двухфакторного для уровней мРНК (независимые факторы: введение гормона и время) или однофакторного для результатов иммуногистохимии (фактор: введение гормона). Апостериорное сравнение групп анализировали по Фишеру, с применением, в случае необходимости, поправки на множественное сравнение (для уровней мРНК генов) или без таковой (для иммуногистохимии) в пакете программ Statistica 10 (StatSoft, США). Результаты представлены как среднее ± ошибка средней. Различия считали достоверными при р < 0.05.

Результаты исследования

Введение дексаметазона привело к быстрому снижению уровней мРНК генов провоспалительных цитокинов (рис. 1). Уже через 1 час после гормонального воздействия уровень мРНК интерлейкина 1В (Il1b) в стволе мозга 3-суточных крысят достоверно снизился (рис. 1а) по сравнению с уровнем контрольных животных (влияние гормона: F(1,87)=59.75, p<0.001; влияние времени F(5,87)=6.99, p<0.001; взаимодействие факторов F(5,87)=6.74, p<0.001). Аналогичное снижение экспрессии гена обнаружено и для другого провоспалительного цитокина – фактора некроза опухоли-альфа (Tnfa) (рис. 1б), уровень мРНК которого также был значимо ниже уровня контрольных животных, начиная с первого часа после введения гормона (влияние гормона F(1,79)=36.37, p<0.001; влияние времени F(5,79)=4.47, p<0.001; взаимодействие факторов F(5,79)=4.43, p<0.001). Снижение экспрессии генов обоих провоспалительных цитокинов оставалось на низком, относительно контрольных животных, уровне на протяжении всех 6 часов наблюдений.

 

Рис. 1. Уровни мРНК интерлейкина 1В (Il1b) (а) и фактора некроза опухоли-альфа (Tnfa) (б) в стволе мозга 3-суточных крысят через 30, 60, 120, 240 и 360 минут после введения 0.2 мг/кг дексаметазона (кривая № 2) в процентах от введения физиологического раствора (кривая № 1).

“0” по оси абсцисс – интактные одновозрастные крысята, *p < 0.05 по сравнению с контрольными животными аналогичного временного интервала.

 

Уровни мРНК антивоспалительных цитокинов, интерлейкина 10 (Il10) и трансформирующего фактора роста бета (Tgfb) также снижались под действием гормона, но это действие гормона выявлялось только к 4 и 6 часу после введения дексаметазона (рис. 2): для Il10 влияние гормона F(1,66)=10.04, p<0.002 (рис. 2а), для Tgfb1 F(1,88)=5.01, p<0.03 (рис. 2б), соответственно. Достоверного влияния времени и взаимодействия факторов на уровни мРНК исследуемых антивоспалительных цитокинов не выявлено.

 

Рис. 2. Уровни мРНК интерлейкина 10 (Il10) (а) и трансформирующего фактора роста бета (Tgfb) (б) в стволе мозга 3-суточных крысят через 30, 60, 120, 240 и 360 минут после введения 0.2 мг/кг дексаметазона (кривая № 2) в процентах от введения физиологического раствора (кривая № 1).

“0” по оси абсцисс – интактные одновозрастные крысята, *p < 0.05 по сравнению с контрольными животными аналогичного временного интервала.

 

Снижение экспрессии генов про- и антивоспалительных цитокинов сопровождалось уменьшением числа микроглиальных клеток и их диаметра в стволе мозга новорожденных крысят (рис. 3). Через 6 часов после введения дексаметазона число клеток, экспрессирующих маркерный белок активированной микроглии IBA1, уровень которого оценивали иммуногистохимически, был достоверно меньше, чем у животных контрольной группы, получавших инъекцию физиологического раствора F(1,18)=8.39, p<0.01. Средний диаметр клеток микроглии после введения гормона также достоверно снижался F(1,18)=5.37; p<0.03. При этом уровень флуоресцентного сигнала для белка ключевого фермента синтеза катехоламинов – тирозингидроксилазы (ТН) в области синего пятна ствола мозга через 6 часов после введения гормона был повышен F(1,18)=5.22; p<0.03.

 

Рис. 3. (а) Репрезентативные микрофотографии окраски IBA1 в стволе мозга 3-суточных крысят контрольной группы (1) и через 6 часов после введения дексаметазона (2). Клетки микроглии отмечены стрелками, LC(TH) – область синего пятна ствола мозга (Locus Coeruleus) с окраской на тирозингидроксилазу (ТН).

(б) Число клеток, экспрессирующих IBA1, и их диаметр в стволе мозга контрольных (1) и получивших 0.2 мг/кг дексаметазона (2) 3-суточных крысят через 6 часов после воздействия.

*p < 0.05 по сравнению с контрольной группой.

 

Таким образом, введение дексаметазона вызывает быстрое градиентное угнетение экспрессии как про-, так и, в дальнейшем, антивоспалительных цитокинов в стволе мозга неонатальных крысят, снижая к 6 часу после введения число и активность микроглиальных клеток.

Обсуждение результатов

Клетки микроглии в неонатальном мозге выполняют критически важные функции. В условиях нормального развития, без воспаления, именно микроглия участвует в процессах ангиогенеза, удалении избыточного числа нейронов и в синаптогенезе – образовании корректных синаптических контактов, поддерживая формирование функциональных нейронных сетей и удаляя нефункциональные связи между нейронами, тем самым микроглия участвует в формировании нейропластичности ЦНС [7–9]. Поэтому отклонение активности микроглии как в сторону ее увеличения при индукции воспаления, так и угнетения, установленного в нашей работе при введении глюкокортикоидного гормона, способно оказать долговременное влияние на функционирование мозга и регулируемые им функции.

Повышение уровня глюкокортикоидов в результате стресса или гормональной терапии в чувствительный период раннего онтогенеза, как известно, приводит к перманентным долговременным изменениям – у взрослых животных меняется реакция на стресс, нарушаются нейромедиаторные системы мозга и, соответственно, регуляция многих функций [17–21]. Многочисленные эпидемиологические исследования применения глюкокортикоидов при угрозе преждевременных родов свидетельствуют о неблагоприятных отдаленных последствиях антенатального введения гормонов и у человека [4–6], что вызывает целый ряд метаболических отклонений – от нарушения толерантности к глюкозе и развития гипертонии до выраженных патологий умственного и психоэмоционального развития, нарушению памяти, способности к обучению, вплоть до появления тяжелых тревожно-депрессивных состояний [21–23].

Введение дексаметазона неонатальным крысятам в нашем исследовании вызвало однонаправленное действие на уровни мРНК как про-, так и антивоспалительных цитокинов – снижение экспрессии их генов, различное по времени своего проявления. Это угнетение экспрессии по всей видимости не является следствием катаболического действия глюкокортикоидов, тормозящего, как известно, синтез белка [1, 24], поскольку изменения экспрессии гена домашнего хозяйства в исследуемом временном диапазоне выявлено не было. Молекулярной основой эффектов дексаметазона могут являться как классический вариант его действия через глюкокортикоид-отвечающие элементы промоторов цитокинов, так и неканонический механизм действия гормонов – через АР-1 элементы, имеющиеся в промоторных областях всех исследуемых генов [1, 2].

Если снижение экспрессии генов провоспалительных цитокинов, в нашей работе это интерлейкин-1бета (Il1b) и фактор некроза опухоли-альфа (Tnfa), введением глюкокортикоидных гормонов хорошо известно и успешно используется в клинике [1–3], то обнаруженное в работе уменьшение уровней мРНК антивоспалительных цитокинов было неожиданным, и этот факт нуждается в дальнейшем исследовании. Продуцентом антивоспалительных белков – цитокина интелейкина-10 и трансформирующего ростового фактора-бета1, особенно в период перинатального онтогенеза, является преимущественно микроглия [25–27]. Усиление экспрессии интерлейкина 10 на уровне гена и белка активно противодействует развитию нейродегенерации при индукции воспаления [25], а TGFb1 критически важен для созревания и гомеостаза микроглии [27, 28]. Обнаруженное нами снижение уровней мРНК Il10 и Tgfb1 к 4 часу после введения дексаметазона в стволе неонатального мозга согласуется с недавно выявленным снижением секреции белковых продуктов этих генов в культуре микроглиальных клеток при действии гормона [29].

Выявленное в работе уменьшение уровней мРНК цитокинов сопровождается снижением активности микроглии, что подтверждается обнаруженным нами уменьшением числа клеток, экспрессирующих маркерный белок IBA1, а также уменьшением среднего диаметра микроглиоцитов. Такое снижение базальной активности микроглии способно ослабить выполнение ею своих функций в неонатальном мозге и явиться причиной нарушения формирования нейронных сетей и функционирования мозга в дальнейшем.

Исследуемый в нашей работе возраст – первые дни постнатального развития ‒ является критически важным периодом онтогенеза. Как было впервые установлено работами нашей лаборатории даже кратковременное снижение экспрессии одного единственного гена – альфа2А-адренорецептора – в этот период развития применением РНК-интерференции или антисенс-нокдауна приводит к значительным изменениям поведения и нейрохимии – значительно снижается уровень тревожности взрослых животных и повышается плотность альфа2-адренорецепторов в отделах мозга взрослых животных [14, 30, 31]. Кроме того, введение дексаметазона крысятам на 3 день постнатального развития вызывает значимое увеличение экспрессии гена и белка ключевого фермента синтеза катехоламинов – тирозингидроксилазы (ТН) [15, 32], сохраняющееся, как минимум, сутки и меняющее активность ТН у взрослых животных в стволе мозга – области локализации перикарионов норадренергических нейронов [32, 33]. В нашей работе мы вновь зафиксировали рост экспрессии белка ТН в области синего пятна ствола мозга через 6 часов после введения гормона. Недавно выявлена отрицательная взаимосвязь между активностью норадренергической системы мозга и микроглией: установлено, что выделение норадреналина нейронами ствола мозга препятствует росту отростков и подвижности микроглиальных клеток, ослабляя нейроиммунные связи [34–37]. Исходя из этого можно полагать, что выявленное в работе снижение экспрессии цитокинов и экспрессии IBA1 может быть связано и с наблюдаемым нами ростом активности норадренергической системы мозга под действием дексаметазона.

В целом, снижение экспрессии исследуемых генов цитокинов и активности микроглии свидетельствует о возможном ослаблении трофической поддержки как незрелых, так и сформированных нейронов, снижению элиминации апоптотических клеток и некорректных синаптических контактов в критический период развития мозга [7, 38, 39], что в совокупности с обнаруженным нами ранее усилением апоптоза нейронов неонатального мозга под действием дексаметазона [16] способно привести к нарушению морфофункциональной структуры формирующегося мозга и явиться причиной долговременного изменения его функционирования.

Заключение

Однократное введение глюкокортикоидного гормона – дексаметазона ‒ вызывает быстрое снижение экспрессии генов как про-, так и антивоспалительных цитокинов в стволе мозга новорожденных крысят. Установленное подавление уровней мРНК цитокинов сопровождается угнетением активности микроглиоцитов. Выявленные особенности действия дексаметазона способны ослабить участие микроглии в процессах нейропластичности развивающегося мозга и явиться одной из причин долговременного изменения его функционирования.

Благодарности

Авторы выражают благодарность ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ФИЦ ИЦиГ СО РАН.

Источник финансирования

Работа поддержана средствами федерального бюджета в рамках государственного задания ФГБУН ФИЦ ИЦиГ СО РАН (№ FWNR-2022-0023).

Соблюдение этических норм

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое одобрение. Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с международными правилами обращения с животными и одобрены биоэтической комиссией Института.

Информированное согласие. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований.

Об авторах

Т. С. Калинина

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Новосибирский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: kalin@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск; Новосибирск

В. В. Булыгина

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН

Email: kalin@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Д. А. Ланшаков

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: kalin@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск; Новосибирск

Е. В. Сухарева

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН

Email: kalin@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск

Н. Н. Дыгало

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН; Новосибирский государственный университет

Email: kalin@bionet.nsc.ru
Россия, Новосибирск; Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы