Индуцируемый цельноклеточный биосенсор для детекции ионов формиата

Полный текст

Муравьиная кислота (формиат-ион, HCOO^–) является простейшим карбоксильным соединением, метаболитом растений, насекомых и микроорганизмов. Она используется в качестве консерванта в кормах и пищевых продуктах, подкислителя в текстильной и кожевенной промышленности, реагента в химических производствах и в современных топливных элементах (https://www.acs.org/molecule-of-the-week/archive.html?archive=All) [1, 2]. Формиат образуется как побочный продукт в ряде технологических процессов; например, при ферментативной обработке лигноцеллюлозного сырья он ингибирует последующий гидролиз или процесс ферментации [3, 4]. Формиат натрия добавляют в антигололедные реагенты для снижения их коррозионной активности, что может привести к накоплению химических реагентов в глубинных слоях почвы придорожной полосы [5]. Также муравьиная кислота может служить индикатором интоксикации организма формальдегидом, метанолом или ацетоном [6]. Все это подчеркивает необходимость определения формиат-иона в различных средах и субстанциях.

Для детекции формиат-иона используют высокоэффективную жидкостную и газовую хроматографии. Однако данные методы обладают невысокой селективностью, их применение иногда затруднено сложной пробоподготовкой, потребностью в маломобильном дорогостоящем оборудовании и высококвалифицированном персонале [7‒10]. Одна из альтернатив хроматографическим методам детекции – применение биосенсоров. Цельноклеточные индуцируемые биосенсоры – это клетки микроорганизмов с встроенными в геном двумя основными элементами: регуляторной системой (промоторно-операторная область) и транскрипционно-слитыми с ней генами-репортерами. В качестве генов-репортеров чаще всего используют lacZ (кодирует b-галактозидазу), gfp (кодирует зеленый флуоресцентный белок) и luxCDABE (кодируют люциферазу и редуктазу) [11, 12]. В норме (при отсутствии в среде индуктора) промотор перед генами-репортерами закрыт, и клетки биосенсора не отличаются от контрольного штамма. При появлении в среде индуктора происходит активация промотора с последующим синтезом белка-репортера. В этом случае клетки биосенсора начинают флуоресцировать, люминесцировать и т.д.

Гены формиатдегидрогеназ (КФ:1.2.2.1, 1.17.1.9, 1.17.1.10, 1.17.2.3, 1.17.5.3, 1.17.98.3, 1.17.98.4) обнаружены во многих метилотрофных и неметилотрофных микроорганизмах: Methylorubrum extorquens [13], Pseudomonas aeruginosa [14], Escherichia coli [15], Candida boidinii [16], Hansenula polymorpha [17], Saccharomyces cerevisiae [18] и др. [19]. В неметилотрофных дрожжах Yarrowia lipolytica идентифицировано 10 генов формиатдегидрогеназ и соответствующих им 10 промоторных последовательностей [20]. На основе их регуляторных областей возможно конструирование специфичных биосенсоров разной степени чувствительности.

Цель настоящей работы – создание индуцируемых, специфических биосенсоров (с геном-репортером hrGFP) для детекции ионов формиата.

МЕТОДИКА

Штаммы микроорганизмов и плазмиды. Для наработки плазмидной ДНК использовали штамм Escherichia coli TOP10 F^‒ mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ^‒ [21].

В работе использовали штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica Y-3178 W29 MatA (дикий тип) и Y-4973 W29 ∆ku70 ∆URA3 – оба получены из БРЦ ВКПМ.

Плазмидный вектор pProUA-mScarlet содержит ген устойчивости к ампициллину (Ap^r), ген зеленого флуоресцентного белка (hrGFP), который оптимизирован по кодонам для экспрессии в Y. lipolytica, а также селективный маркер для дрожжей URA3 (ген синтеза урацила). Хелперная плазмида pCasNA-IntC2 содержит ген белка Cas9, последовательность ДНК-мишени (sgRNA), гены устойчивости к ноурсетрицину (Nat^r) и ампициллину (Ap^r) [22].

Конструирование биосенсорных штаммов Y. lipolytica. Гены формиатдегидрогеназ в геноме Y. lipolytica были идентифицированы по гомологии аминокислотных последовательностей с формиатдегидрогеназой FDH1 S. cerevisiae (КФ:1.17.1.9) с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, NCBI, США). Согласно базе данных GenBank (NCBI, США) гены формиатдегидрогеназ в геноме Y. lipolytica расположены в следующих локусах: YALI1_A12502g, YALI1_B26033g, YALI1_B29419g, YALI1_C10762g, YALI1_C20054g, YALI1_F18740g, YALI1_F21426g, YALI1_F36552g, YALI1_E17326g, YALI1_E19014g.

Штаммы Y. lipolytica для тестирования промоторов были сконструированы согласно мануалу YaliCraft c использованием Pro Module [22]. Для этого нуклеотидные последовательности длиной 800 п.н., расположенные перед генами формиатдегидрогеназ (FDH) дрожжей Y. lipolytica, были химически синтезированы компанией “Twist Bioscience” (США) и встроены в предоставленный компании вектор pProUA-mScarlet непосредственно перед геном-репортером hrGFP. Полученные от “Twist Bioscience” плазмиды pProUA-pFDH_A1, pProUA-pFDH_B26, pProUA-pFDH_B29, pProUA-pFDH_C1, pProUA-pFDH_C2, pProUA-pFDH_F1, pProUA-pFDH_F2, pProUA-pFDH_F3, pProUA-pFDH_E17, pProUA-pFDH_E19 трансформировали в клетки E. coli TОР10 для наработки плазмидной ДНК. Трансформацию клеток и выделение плазмидной ДНК проводили согласно [21].

Наработанные плазмиды линеаризовали по сайтам рестрикции NotI и встраивали в хромосому С штамма Y-4973 Y. lipolytica. Трансформацию дрожжей проводили совместно с хелперной плазмидой pCasNA-IntC2 по ранее описанному протоколу [22]. Верификацию трансформантов проводили методом ПЦР. Сконструированные штаммы биосенсоров приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Описание генотипов сконструированных штаммов биосенсоров

Промотор (локус гена FDH)	Плазмида для интеграции	Штамм Y. lipolytica	Обозначение штамма
YALI1_A12502g	pProUA-pFDH_A1	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_A1-hrGFP-TLIP2	A1
YALI1_B26033g	pProUA-pFDH_B26	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_B26-hrGFP-TLIP2	B26
YALI1_B29419g	pProUA-pFDH_B29	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_B29-hrGFP-TLIP2	B29
YALI1_C10762g	pProUA-pFDH_C1	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_C1-hrGFP-TLIP2	C1
YALI1_C20054g	pProUA-pFDH_C2	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_C2-hrGFP-TLIP2	C2
YALI1_F18740g	pProUA-pFDH_F1	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_F1-hrGFP-TLIP2	F1
YALI1_F21426g	pProUA-pFDH_F2	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_F2-hrGFP-TLIP2	F2
YALI1_F36552g	pProUA-pFDH_F3	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_F3-hrGFP-TLIP2	F3
YALI1_E17326g	pProUA-pFDH_E17	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_E17-hrGFP-TLIP2	E17
YALI1_E19014g	pProUA-pFDH_E19	W29 ∆ku70 IntC2::PFDH_E19-hrGFP-TLIP2	E19

 

Питательные среды и условия роста. Клетки E. coli TOP10 выращивали в бульоне Луриа‒Бертани (LB) при 37°С в течение 2 ч до середины экспоненциальной фазы роста. Селекцию трансформированных штаммов TOP10 проводили на L-агаре с добавлением ампициллина (100 мкг/мл).

Для трансформации клетки Y. lipolytica Y-4973 выращивали при 30°С в течение 16‒20 ч до экспоненциальной фазы роста на агаризованной среде YP (пептон ‒ 10 г/л, дрожжевой экстракт ‒ 5 г/л) c добавлением глюкозы (1 об. %) в качестве источника углерода. Отбор трансформированных штаммов дрожжей проводили на агаризованной среде YNB (Yeast Nitrogen Base; M139, “HIMEDIA”, Индия, 6.75 г/л) c глюкозой (1 об. %) и ноурсетрицином (50 мкг/мл). Для дальнейших экспериментов штаммы Y. lipolytica выращивали на агаризованной или в жидкой среде YNB с добавлением источника углерода до требуемой концентрации.

Ферменты и химические вещества. Все химические препараты были аналитической чистоты. Ферменты для работы с ДНК получены от “Fermentas” (Литва). В качестве индукторов использовали формиат натрия, формальдегид и метанол фирмы “Sigma-Aldrich” (США). Все тест-растворы готовили непосредственно перед их использованием.

Измерение и визуальная оценка флуоресценции биосенсоров. Для визуальной оценки флуоресценции сконструированных биосенсоров ночную культуру дрожжевых штаммов разводили в стерильном физиологическом растворе до оптической плотности 0.8, после чего высевали по 5 мкл клеточных суспензий на чашки Петри с агаризованной YNB, содержащей 1% глюкозы и различные концентрации формиата натрия. Чашки инкубировали при 30°С в течение 24 ч. Активность биосенсоров оценивали по интенсивности зеленой флуоресценции выросшей биомассы, просматривая чашки в синем светодиодном трансиллюминаторе DR46B “Clare Chemical Research” (США) с оранжевым фильтром.

Для измерения временной зависимости интенсивности флуоресценции биосенсоров от различных концентраций индуктора дрожжевые штаммы рассевали на агаризованной YNB с 1 об./об. % глюкозы и выращивали при 30°С в течение 20 ч. Выросшую биомассу клеток разводили в жидкой YNB, содержащей необходимые концентрации источника углерода и индуктора, до оптической плотности 0.3. Контрольные пробы готовили аналогично, но без добавления индуктора. По 100 мкл приготовленных проб переносили в лунки планшета 655096 “Greiner Bio-One” (Германия), который затем помещали в мультимодальный ридер CLARIOstar Plus (“BMG Labtech”, Германия) и инкубировали при 30°С и 500 об./мин в течение 6 ч с измерением оптической плотности и флуоресценции каждые 15 мин согласно [22]. Относительную флуоресценцию для каждой лунки рассчитывали путем деления измеренных значений флуоресценции на значения оптической плотности (FLU/OD₆₀₀). Количество повторов составляло 5 лунок для каждой концентрации формиата натрия. Обработку данных проводили с использованием программного обеспечения MARS (“BMG Labtech”, Германия) и Excel (“Microsoft”, США).

На основании полученных данных были определены три основных параметра, характеризующих качество биосенсора: амплитуда ответа (АО), минимальное время ответа (t_m) и пороговая чувствительность. АО определяется по формуле: AO = I_t-I_o/I_k-I_o, где I_o – относительная флуоресценция препарата в момент добавления индуктора (t = 0); I_k – относительная флуоресценция контрольного препарата в момент t; I_t – относительная флуоресценция опытного препарата в момент t. Минимальное время ответа t_m определяется интервалом времени между моментом добавления индуктора и моментом фиксации люминометром достоверного усиления сигнала по сравнению с (I_k–I_o). Пороговая чувствительность определяется минимальной концентрацией индуктора, при которой АО равна примерно 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Качественная оценка флуоресценции сконструированных штаммов. На первом этапе активность сконструированных биосенсоров (табл. 1) оценивали качественно: по интенсивности зеленой флуоресценции биомассы штаммов, выращенных на агаризованной среде, содержащей 0 (контроль) и 10 мМ формиата натрия (рис. 1). Видно, что большая часть тестируемых штаммов не флуоресцирует, как и дикий штамм Y-3178 (wt), даже в присутствии формиата (рис. 1 б). Выраженное зеленое свечение демонстрируют 3 варианта штамма – А1, В26 и В29.

 

Рис. 1. Флуоресценция (hrGFP) биомассы штаммов дрожжей после выращивания в течение 20 ч на агаризованной среде YNB с 1% глюкозы без формиата (а) и с добавлением 10 мМ формиата натрия (б). Контрольный штамм Y-3178 W29 MatA (дикий тип) обозначен как wt.

 

На основании качественной оценки штаммы А1, В26 и В29 были отобраны в качестве возможных биосенсоров для количественного измерения флуоресценции и сравнения их характеристик.

Количественная оценка флуоресценции штаммов А1, В26 и В29. На рис. 2 приведены кривые зависимости нормализованной по оптической плотности (OD) флуоресценции штаммов А1, В26 и В29 от времени инкубации в среде, содержащей различные концентрации формиата натрия. Дрожжевые штаммы рассевали на агаризованной YNB с 1% глюкозы и выращивали при 30°С в течение 20 ч. Выросшую биомассу клеток разводили в жидкой YNB с 1% глюкозы до оптической плотности 0.3. Далее по 100 мкл клеточной суспензии переносили в лунки планшета 655096 “Greiner Bio-One” (Германия) и добавляли формиат натрия в заданных концентрациях в качестве индуктора. Затем планшет помещали в мультимодальный ридер CLARIOstar Plus (“BMG Labtech”, Германия) и инкубировали при 30°С и 500 об./мин в течение 6 ч с измерением оптической плотности и флуоресценции каждые 15 мин согласно [22].

 

Рис. 2. Зависимость нормализованной по оптической плотности (OD) флуоресценции штаммов А1 (а), В26 (б) и В29 (в) от времени инкубации в среде с формиатом натрия: 1 ‒ без формиата натрия, 2 ‒ 10 мкМ, 3 ‒ 100 мкМ, 4 ‒ 1 мМ, 5 ‒ 10 мМ, 6 ‒ 90 мМ, 7 ‒ 440 мМ.

 

Как видим, все три штамма (А1, В26 и В29) отвечали усилением флуоресценции при добавлении формиата натрия. Время ответа совпадало для всех трех штаммов и составляло 60‒70 мин. Однако среди тестируемых штаммов наиболее низкую пороговую концентрацию в 10 мкМ показывал В26 (рис. 2б), в то время как пороговая концентрация для А1 составляла 100 мкМ (рис. 2а), а для В29 ‒ 1 мМ (рис. 2в). Необходимо отметить более высокий фон флуоресценции у штамма В29 по сравнению с А1 и В26, что приводило к снижению амплитуды ответа. Таким образом, оптимальным штаммом для определения содержания в среде формиат-ионов являлся В26.

На рис. 3 приведены зависимости максимального ответа (АО) штаммов А1, В26 и В29 от различных концентраций формиата натрия. Согласно приведенному графику штамм В26 показывал наибольшую АО по всем проверенным концентрациям формиата натрия, поэтому штамм В26 был выбран в качестве цельноклеточного биосенсора для детекции ионов формиата.

 

Рис. 3. Зависимость максимального ответа (АО) штаммов А1, В26 и В29 от различных концентраций формиата натрия. 1 ‒ А1, 2 ‒ В26, 3 ‒ В29.

 

Подбор оптимального источника углерода. В предыдущих работах показано, что добавление глюкозы в качестве источника углерода может снижать индукцию промоторов генов формиатдегидрогеназ [23, 24]. В питательную среду в качестве источников углерода добавляли глюкозу (1%), сорбит (1.5%), маннит (1%) или цитрат (1%) и сравнивали уровень открытия промотора в штамме В26 при добавлении 10 мМ формиата. Результат эксперимента приведен на рис. 4.

 

Рис. 4. Влияние источников углерода в питательной среде на активацию биосенсора В26 при добавлении 10 мМ формиата: 1 ‒ глюкоза (1%), 2 ‒ глюкоза и формиат, 3 ‒ сорбит (1.5%), 4 ‒ сорбит и формиат, 5 ‒ маннит (1%), 6 ‒ маннит и формиат, 7 ‒ цитрат (1%), 8 ‒ цитрат и формиат.

 

Хуже всего на активацию биосенсора повлияло добавление в питательную среду цитрата. Добавление сорбита или маннита показало одинаковый уровень открытия промотора, при этом АО биосенсора в среде с маннитом или сорбитом действительно оказалась выше, чем в среде с глюкозой. В результате, в качестве источника углерода для питательной среды был выбран маннит, поскольку Y. lipolytica утилизировала его лучше сорбита.

Измерение основных характеристик и проверка специфичности биосенсора В26. Известно, что формиатдегидрогеназы дрожжей (как метилотрофных, так и неметилотрофных) участвуют в процессе окислении формальдегида до углекислого газа [18]. Формальдегид, который образуется при окислении метанола или в других клеточных процессах, цитотоксичен, поэтому все организмы имеют пути детоксикации формальдегида [25]. Несмотря на то, что Y. lipolytica не относится метилотрофным дрожжам, была проведена проверка возможной активации биосенсора В26 не только формальдегидом, но и метанолом.

На рис. 5 приведены кривые зависимости нормализованной по оптической плотности (OD) флуоресценции биосенсора В26 от времени инкубации в среде YNB c 1% маннита и различными концентрациями формиата натрия, формальдегида или метанола. Диапазон нормализованной флуоресценции клеток биосенсора при добавлении формиата натрия колебался от 10000 до 200000 в зависимости от концентрации индуктора в среде (рис. 5а). Пороговая концентрация составляла 10 мкМ, минимальное время ответа ‒ 70 мин и зависило от концентрации индуктора. Следует отметить, что клетки биосенсора хорошо переносили добавление высоких концентраций формиата натрия (до 6%).

 

Рис. 5. Зависимость нормализованной по оптической плотности (OD) флуоресценции биосенсора В26 от времени инкубации в питательной среде, содержащей маннит (1%) и формиат натрия (а), формальдегид (б) или метанол (в) в концентрациях: 1 ‒ без добавления, 2 ‒ 10 мкМ, 3 ‒ 100 мкМ, 4 ‒ 1 мМ, 5 ‒ 10 мМ, 6 ‒ 100 мМ.

 

Если в качестве индуктора использовался формальдегид (рис. 5б), то диапазон рабочих концентраций биосенсора резко сужался из-за высокой цитотоксичности индуктора. При этом, чувствительность биосенсора к формальдегиду была достаточно низкой, пороговая концентрация составляла 400 мкМ. Минимальное время ответа пролонгировано относительно времени ответа биосенсора на ионы формиата и составляло 1.5 ч.

При добавлении метанола активация биосенсора практически отсутствовала. Наблюдалось незначительное увеличение флуоресценции при концентрации метанола в среде 100 мМ (рис. 5в). Таким образом, применение такого биосенсора для детекции метанола не рекомендуется.

Рассчитанные значения основных параметров биосенсора В26 представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Основные характеристики биосенсора В26

Индуктор	[C]*, М	АОmax	tm, мин	Пороговая чувствительность
Формиат натрия	10–4	6 ± 1.8	70	10–5 М
	10–3	18 ± 4.0
	10–2	30 ± 6.0
	0.1	43 ± 9.8
Формальдегид	10–3	6 ± 1.3	90	0.4·10–3 М
Метанол	0.1	2.3 ± 0.9	120	0.1 М

*[C] – концентрация индуктора, при которой АО максимальна.

 

***

В данной работе для определения формиат-иона (HCOO^–) в различных средах сконструирован цельноклеточный биосенсор на основе дрожжей Y. lipolytica с пороговой чувствительностью 10 мкМ, что сопоставимо с хроматографическими методами анализа [26]. Предложенный в работе цельноклеточный биосенсор уступал по чувствительности другому типу биосенсоров, основанных на ферментативной активности формиатдегидрогеназ, функционирующих в свободном виде [6, 27, 28] или локализованных на поверхности микробных клеток [26]. Пороговая концентрация таких wбиосенсоров составляет 2‒5 мкМ. Однако трудоемкость выделения чистого фермента, проверка его локализации, стабильности и активности, а также сложность детекции продуктов ферментативной реакции могут препятствовать широкому применению подобных систем. Разработанный биосенсор лишен этих недостатков и может применяться в любой лаборатории, оснащенной флуориметром. При концентрации ионов формиата выше 5 мМ возможна визуальная оценка активации биосенсора при его посеве на агаризованною питательную среду.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Работа выполнена в рамках Государственного задания НИЦ “Курчатовский институт”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ. Настоящая работа выполнена без привлечения людей или животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

А. А. Черенкова

“Курчатовский институт”; Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева

Email: oligamelkina@gmail.com

Курчатовский комплекс НБИКС-природоподобных технологий

Россия, Москва, 123098; Москва, 125480

Т. В. Юзбашев

Rothamsted Research

Email: oligamelkina@gmail.com

Plant Sciences and the Bioeconomy

Великобритания, West Common, Harpenden, AL5 2JQ, Hertfordshire

О. Е. Мелькина

“Курчатовский институт”

Автор, ответственный за переписку.
Email: oligamelkina@gmail.com

Курчатовский комплекс НБИКС-природоподобных технологий

Россия, Москва, 123098

Список литературы

Дополнительные файлы