Перспективность акустических сенсорных систем для иммунодетекции вирусов (Обзор)

Полный текст

Последние несколько десятилетий вирусы представляют реальную угрозу безопасности человечества, поскольку вызывают серьезные инфекционные заболевания не только человека, но и животных и растений [1]. С начала 21 века наблюдаются вспышки смертельных вирусных заболеваний, таких как тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) в 2003 г., H1N1 (вирус свиного гриппа А) в 2009 г., Ближневосточный респираторный синдром (MERS) в 2012 году, Зика в 2016 г. В 1981 г. впервые сообщалось о вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ), эпидемия которого продолжается по настоящее время [2]. Важно, что все вирусы быстро эволюционируют, чему способствуют многократно усилившиеся в последние годы миграционные процессы в мире. В этих условиях человечество всё чаще встречается с появлением новых вирусов или с проявлением новых заболеваний из-за изменчивости хорошо известных вирусов. Так, например, различные виды коронавирусов широко распространены в природе и вызывают различные инфекционные заболевания, как у человека, так и у животных. В конце 2019 г. описан SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2), способный вызывать вирусную пневмонию у людей [3]. На рис. 1 представлено животное происхождение коронавирусов человека [4]. Заражение MERS-CoV, SARS Coronavirus-2 или SARS-CoV вызывает тяжелые и часто летальные последствия, основные различия между которыми заключаются, главным образом, в скорости передачи, инкубационном периоде заболеваемости на уровне смертности [4]. Глобальный кризис, связанный с SARS-CoV, привел к потерям как в области здравоохранения, так и глобальной экономики, более чем 90 трлн $ [5], чего не происходило почти столетие.

 

Рис. 1. Происхождение коронавирусов человека (коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), коронавирус человека (HCoV), коронавирус синдрома острой диареи свиней (SADS-CoV) [4].

 

Одной из причин масштабных вирусных пандемий является отсутствие эффективных методов детекции вирионов и быстрой диагностики вирусной инфекции [6]. Раннее выявление вируса необходимо не только для подбора и проведения специфической терапии, но и для своевременного блокирования передачи вирусных частиц с целью профилактики распространения инфекции. Именно поэтому развитие быстрых методов идентификации вирусов является одним из лучших способов предотвращения вспышек вирусных заболеваний.

Традиционные методы обнаружения вирусов, основанные на выделении и культивировании, проведении электронно-микроскопических исследований, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) трудоемки, продолжительны по времени анализа и требуют квалифицированного персонала для грамотной интерпретации результатов [7–9]. Лабораторная диагностика вирусных инфекций также включает технологию ДНК-микрочипов (DNA microarray) [10–12], преимуществом которых является высокая специфичность, чувствительность, но невозможность проведения анализа при высокой рабочей нагрузке, например, во время пандемий.

Для преодоления ограничений, связанных с традиционными методами определения вирусов, необходимо разрабатывать альтернативные высокочувствительные и специфичные диагностические тест-системы. Реализация новых методов позволит ускорить идентификацию вирусных частиц и инициировать необходимые меры сдерживания вирусной инфекции. Среди различных методов обнаружения вирусов наиболее перспективными являются сенсорные системы, в том числе созданные с использованием нанотехнологий [13–18]. Недавняя вспышка коронавирусной инфекции (COVID-19) показала всему миру недостатки применяемых в настоящее время систем определения вирусов, а также необходимость развития новых направлений сенсорных методов анализа для получения результата на месте. Среди сенсорных систем определения вирусных частиц существуют электрохимические биосенсоры [19–22], биосенсоры на основе молекулярно-импринтированных полимеров (MIP) [23], оптические сенсоры [24–27], биосенсоры, действие которых основано на спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР) [28] и гигантском комбинационном рассеянии света [29]. Несмотря на то, что опубликованы обзоры, посвященные сенсорным технологиям для определения вирусов [16–18, 30–33], применение акустических сенсорных систем для индикации вирусов не нашло достаточно полного освещения в литературе. Поэтому, цель настоящей работы заключается в описании перспективности акустических сенсорных систем для определения вирусов.

Основные принципы действия биосенсоров. Для определения вирусных частиц применяются биосенсоры, обладающие различной конструкцией и механизмом действия. Биосенсоры – био-химико-физические системы, состоящие из двух компонентов: чувствительного биологического элемента (биорецептора) и системы детекции (физический преобразователь), которые позволяют регистрировать концентрацию или активность различных аналитов, присутствующих в образце [16]. Биосенсоры классифицируются в зависимости от вида биорецептора (ферменты, микроорганизмы, бактериофаги, ДНК, антитела, ткани, органеллы и хеморецепторы и др.) и типа датчика (оптические, амперометрические, потенциометрические, полупроводниковые, термометрические, фотометрические и пьезоэлектрические) [34, 35]. Биосенсоры позволяют значительно уменьшить время проведения анализа, благодаря относительной простоте проведения процедур, и, как показывают литературные данные, являются довольно чувствительными и требуют минимальной предварительной обработки исследуемого материала. Общая схема биосенсора представлена на рис. 2 [15].

 

Рис. 2. Общая схема биосенсора [15].

 

На первом этапе действия биосенсора происходит “узнавание” биорецептором специфичного для него вещества из многокомпонентной смеси. На второй стадии происходит преобразование информации о протекании биохимической реакции в форму электрохимического или иного (например, оптического, акустического и др.) сигнала. Эта стадия, которую можно назвать стадией сопряжения биохимической и электродной реакций является ключевой для осуществления работы биосенсора. На последней стадии электрический сигнал преобразовывается в соответствующую для обработки форму.

Акустические сенсоры для определения вирусов. Разновидностью сенсорных систем являются акустические пьезоэлектрические биосенсоры, которые проявляют чувствительность к изменению массы на поверхности физического носителя (гравиметрические биосенсоры), или к изменению плотности, вязкости, проводимости контактирующей со звукопроводом среды.

Акустические сенсорные системы позволяют проводить анализ биологических объектов не только с помощью иммобилизации активных реагентов на поверхности биодатчика, но и непосредственно в жидкой фазе. В этом случае анализ проводится в течение короткого промежутка времени. Именно это преимущество позволяет использовать метод электроакустического анализа для быстрого определения вирусов при их взаимодействии с селективным агентом (антителами, микробными клетками).

Принцип действия электроакустических методов анализа вирусов основан на регистрации протекания биоспецифической реакции в анализируемой суспензии или на поверхности слоя, содержащего иммобилизованный специфичный агент, контактирующий с поверхностью пьезоэлектрического звукопровода, по которому распространяется пьезоактивная акустическая волна. Изменения параметров анализируемого биологического объекта на поверхности акустического звукопровода приводит к изменению скорости акустической волны, что, в свою очередь, приводит к изменению измеряемых характеристик акустического датчика (электрический импеданс, частота, вносимые потери, фаза выходного сигнала) [16].

Для создания акустических сенсоров широко используются пьезоэлектрические резонаторы или линии задержки с распространяющейся поверхностной или пластинчатой акустической волной. Такие сенсоры чувствительны к изменению механических или электрических свойств биологического объекта, контактирующего с поверхностью звукопровода. Акустические биосенсоры чаще всего выполняются на основе таких пьезоэлектрических материалов, как кварц, ниобат лития, или танталат лития, поскольку они характеризуются высокой химической устойчивостью. Акустические волны, возбуждаемые в пьезоэлектрике, позволяют создать целое семейство датчиков, характеризующихся высокой чувствительностью, быстротой проведения анализа, дешевизной, и небольшими размерами [36]. Современные акустические датчики могут использовать все типы волн, а именно объемные акустические волны (ОАВ), поверхностные акустические волны (ПАВ) и акустические пластинчатые моды (АПМ) [37], как показано на рис. 3 [38].

 

Рис. 3. Классификация акустических датчиков: ОАВ – объемные акустические волны, ПАВ – поверхностные акустические волны; и АПМ – акустические пластинчатые моды [38].

 

Датчики на основе объемных акустических волн представляют собой резонаторы, в которых акустическая волна распространяется между двумя сторонами пьезоэлектрической пластины. Эти резонаторы можно разделить на две группы: резонаторы с продольным электрическим полем (электроды нанесены на противоположные стороны пьзоэлектрика) и резонаторы с поперечным электрическим полем (электроды нанесены на одну сторону пьезоэлектрика, другая сторона остается свободной).

В ПАВ датчиках поверхностная акустическая волна возбуждается с помощью излучающего встречно-штыревого преобразователя (ВШП), распространяется вдоль поверхности пьезоэлектрической пластины и преобразуется в электрический сигнал с помощью приемного ВШП. Такой датчик может работать на частотах в диапазоне от нескольких МГц до нескольких ГГц. К поверхностным волнам относятся волны Рэлея, волны с поперечно – горизонтальной поляризацией (SH) и волны Лява.

Перспективность акустических сенсоров для определения вирусов на основе волны Лява с поперечной горизонтальной поляризацией на примере бактериофага М13 была продемонстрирована в работе [39] в режиме реального времени. Предварительно антитела, специфичные к бактериофагу М13, необратимо иммобилизуются на подложке из оксида кремния, и после иммунореакции между бактериофагом М13 и специфичными антителами на подложке образуется многослойная поверхность, которая анализируется при помощи волн Лява.

Разработан иммуносенсор для селективного определения вирусов герпеса в крови человека на основе пьезоэлектрического резонатора с иммобилизованными на его поверхности соответствующими антивирусными антителами [40]. Подобный биосенсор на основе пьезоэлектрического резонатора успешно применен для детекции вирусов в природных и искусственных водоемах (реки, канализация и сточные воды) без предварительной обработки анализируемого субстрата [41].

Ряд исследований продемонстрировали, что акустические датчики на основе горизонтально-поперечных поверхностных волн являются более перспективными для измерения в жидкостях, чем датчики, использующие волны с нормальной к поверхности звукопровода компонентой механического смещения [42]. Иммуносенсор на волнах Лява (Love Wave) был успешно использован для обнаружения вирусов [37]. Конструкция на поверхностных акустических волнах имеет такие неотъемлемые преимущества, как высокая чувствительность и портативность, массовая производительность и широкий частотный диапазон (от 10 МГц до 1 ГГц) за счет изменения геометрии встречно-штыревых преобразователей (IDT) [43, 44].

Основные преимущества и недостатки указанных датчиков для анализа биологических исследований представлены в работах [16, 38, 45, 46].

Акустические сенсоры для иммунодиагностики вирусов. Среди ускоренных методов определения вирусов лидирующее положение занимают сенсорные системы с применением антител (иммунологические методы). Серологическая диагностика позволяет идентифицировать вирус даже в том случае, когда выделение вирусных частиц из образца не дает никаких результатов. В основу иммунологического метода положено явление взаимодействия антиген-антитело, а для визуализации взаимодействия используют фермент в качестве метки, который анализируют физико-химическими методами.

На основе акустических биосенсоров разработаны иммуносенсоры для обнаружения вирусов. Биосенсоры на объемных акустических волнах способны обнаруживать биохимические образования при определении вирусов [30, 47, 48]. Резонансная частота пьезоэлектрического резонатора, контактирующего с изучаемым аналитом, изменяется в результате его взаимодействия со специфичным агентом.

Пьезоэлектрические биосенсоры на основе кристалла кварца привлекли внимание для биологических применений, особенно для обнаружения вирусов гриппа из-за их простоты, прямого определения и возможности анализа в реальном времени [49–51]. В работе [49] была изготовлена оригинальная структура нанолунок для создания аптамера на поверхности кварцевого резонатора для быстрого, чувствительного и безметочного обнаружения вируса птичьего гриппа H5N1 (AIV). Нанопористую пленку золота толщиной 120 нм с размером пор ~20 нм иммобилизовали на поверхности золотого электрода с использованием самоорганизующегося монослоя для формирования электрода на основе наноямок. Специфический аптамер оцДНК H5N1 AIV с конъюгированным с NH2 5'-концом использован при изготовлении аптасенсора посредством ковалентной связи. Поэтапную сборку аптасенсора характеризовали путем измерения частоты резонатора. Результат показал, что связывание целевого H5N1 AIV с иммобилизованными аптамерами снижало резонансную частоту сенсора, а изменение частоты коррелировало с титром вируса. Разработанный аптасенсор с использованием нанолунок может значительно сократить время обнаружения до 10 мин с использованием анализа без меток. Связывание целевого вируса H5N1 с поверхностью электрода на основе нанолунок дополнительно подтверждено с помощью сканирующей электронной микроскопии. Никакого вмешательства со стороны нецелевых подтипов AIV H1N1, H2N2, H7N2 и H5N3 не наблюдалось. Аптасенсор, использующий аптамер H5N1, проверен на обнаружение AIV H5N1 в образцах мазков из трахеи кур. Разработанный аптасенсор может быть использован для обнаружения и других вирусов.

Помимо кварца в качестве материала резонатора используют титанат бария, сегнетову соль, турмалин и др. Поверхность кристалла покрывают специфичными антителами. При адсорбции веществ на поверхности кристалла меняется его резонансная частота, используемая в качестве аналитического сигнала [52, 53].

Акустический датчик с использованием поверхностной акустической волной и специфичных моноклональных антител применялся для определения вирусов Эбола, HIV-1 and HIV-2 с возможностью многократного использования при времени анализа 5–10 мин [54, 55].

На основе резонаторов с поперечным электрическим полем существует два типа акустических биодатчиков для детекции вирусов. Датчики первого типа используют пленки-биорецепторы, которые закрепляются на поверхности пьезоэлектрического материала [56]. Биологический материал, например, суспензия, содержащая измеряемый объект, контактирует с биодатчиком через указанную пленку. Биологическое взаимодействие между измеряемым объектом и биорецептором приводит к соответствующему изменению электрического импеданса датчика. Однако датчики, которые используют активные покрытия, имеют ряд существенных недостатков. К ним относятся длительное время детекции в течение нескольких часов и невозможность многократного использования активного слоя. Сразу же после первого эксперимента отработавшую активную пленку необходимо удалять и наносить новую. Это существенно ограничивает возможности использования датчиков первого типа.

Датчики второго типа свободны от вышеперечисленных недостатков. В этих датчиках исследуемая суспензия вирусов контактирует непосредственно с пьезоэлектриком без использования активной пленки с иммобилизованными антителами. Датчик фиксирует изменение физических свойств суспензии в результате специфического взаимодействия вирусов с добавляемыми антителами. Эти изменения соответственно приводят к изменению характерного аналитического сигнала. Такой подход для индикации вирусов принципиально отличается от известных способов определения вирусов при помощи акустических резонаторов с использованием иммобилизованных антител [40, 41, 56, 57] отсутствием необходимости иммобилизации антител, простотой выполнения процедуры анализа и быстротой получения результата. Разработан биосенсор на основе пьезоэлектрического резонатора для обнаружения SARS-ассоциированного коронавируса (SARS-CoV) [58].

В работе [59] разработана сенсорная система на основе пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем для детекции вирусов с помощью специфичных антител. В качестве объекта исследования использовали вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Установлено, что добавление специфичных антител к вирусной суспензии приводило к значительному изменению реальной и мнимой частей электрического импеданса резонатора (рис. 4).

 

Рис. 4. Схема сенсорной системы на основе пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем для детекции вирусов с помощью специфичных антител.

 

Для определения вирусов наиболее предпочтительными являются датчики, которые позволяют проводить многократные измерения и легко очищаются от используемого образца после измерений без потери чувствительности датчика к анализируемой реакции. Примером может служить акустический датчик на основе щелевой моды в акустической линии задержки с поперечно-горизонтальной волной нулевого порядка. Основным преимуществом данного датчика является возможность бесконтактного анализа, в котором контейнер с исследуемой суспензией изолирован от поверхности линии задержки. Такая конструкция позволяет проводить многократные измерения и очистку жидкостного контейнера без повреждения линии задержки [60].

В работе [61] показана перспективность акустического датчика на основе щелевой моды в акустической линии задержки. Добавление антител, специфичных к вирусу ТГС, приводило к изменению глубины и частоты резонансных пиков на частотной зависимости полных потерь датчика (рис. 5). По разнице выходных параметров датчика до и после биологического взаимодействия вируса ТГС в растворах со специфичными антителами можно сделать заключение о наличии/отсутствии исследуемых вирусов в анализируемом растворе. Продемонстрирована возможность диагностики вируса в водных растворах с проводимостью от 1.9 до 900 мкСм/см, а также в присутствии посторонних вирусных частиц. Время анализа не превышало 10 мин.

 

Рис. 5. Анализ вируса ТГС акустическим датчиком на основе щелевой моды в акустической линии задержки.

 

Основные преимущества акустических иммуносенсоров для определения вирусов непосредственно в жидкой фазе [59–61] заключаются в следующем:

• нет необходимости иммобилизации компонентов анализа (антител);
• возможность проведения анализа непосредственно в жидкой фазе, а также в присутствии посторонних мешающих факторов (микробные клетки, посторонние вирусные частицы);
• предел детекции составляет 10⁴ вирусных частиц/мл, но есть возможности увеличения чувствительности метода;
• время анализа в среднем 10 мин;
• объем анализируемого образца не более 5 мл;
• возможность многократного использования датчика без повреждения датчика и искажения аналитического сигнала.

В другой работе [54] представлен датчик на основе линии задержки с ПАВ без специальных меток для быстрого обнаружение антигенов Эболы, без необходимости добавления реагентов, обработки проб и подготовки специализированного персонала. Линия задержки представляла собой пластину из танталата лития (LiTaO₃) с двумя встречно-штыревыми преобразователями (IDT). Входной преобразователь возбуждал в пластине поверхностную акустическую волну с поперечно-горизонтальной поляризацией с частотой 80–400 МГц. Фаза выходного электрического сигнала с выходного преобразователя использовалась в качестве аналитического сигнала. Молекулярные взаимодействия между вирусом и антителом в пространстве между преобразователями приводили к изменению фазы выходного сигнала. Наблюдался логарифмически линейный отклик сенсора на частицы вируса Эбола с пределом обнаружения 1.9 × 10⁴ БОЕ/мл.

С помощью сенсора на основе кварцевого резонатора показана возможность обнаружения в мазках из ротовой полости нескольких респираторных вирусов, таких как грипп: SARS-CoV и 2019-nCoV [58, 62–64]. Такой подход можно использовать для проведения тестирования без меток в режиме реального времени с высокой чувствительностью. Кроме того, с помощью подобного биосенсора можно определять шиповый белок SARS-CoV-2 [64] с использованием взаимодействия между спайковым гликопротеином и поверхностью сенсора. Показана возможность обнаружения адсорбированных спайковых белков с чувствительностью на уровне нг.

Установлено, что для обнаружения SARS-CoV использование пьезоэлектрического иммуносенсора на основе пьезоэлектрического резонатора является целесообразным, поскольку это дает быстрый, стабильный и адекватный результат [58], а использование парамагнитных наночастиц [63] позволяет повысить чувствительность обнаружения белковых биомаркеров в течение одной минуты вплоть до 3.5 нг/мл.

***

Анализируя развитие пьезоэлектрических биосенсоров, используемых для определения вирусных частиц, можно отметить, что развитие технологий обнаружения вирусов сосредоточено на улучшении чувствительности, экономической эффективности и возможности многократного использования датчика. Чтобы вызвать наиболее эффективный ответ на воздействие вируса, необходима сеть биосенсоров “скоростного типа”, чтобы служить в качестве первоначального предупреждения о наличии, распространении и вирусности инфекционного агента. Для достижения этой цели желательно использовать портативный биосенсор с высокой чувствительностью и точностью, который может обнаруживать вирусы в режиме реального времени. Продолжение исследований для улучшения зондов и платформ должно привести к созданию эффективных биосенсоров, которые могут быть использованы в реальных образцах. В данном контексте методы электроакустического анализа на основе пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем и щелевой моды показали перспективность применения для решения вопросов детекции вирусов. Дальнейшая стандартизация и автоматизация метода электроакустического анализа позволит расширить круг его применения и использования в микробиологии, биотехнологии, ветеринарии, медицине, в том числе в области фаговой терапии.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания Саратовского научного центра РАН и Института радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН.

Об авторах

О. И. Гулий

Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук”

Автор, ответственный за переписку.
Email: guliy_olga@mail.ru

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов

Россия, Саратов, 410049

Б. Д. Зайцев

Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН

Email: guliy_olga@mail.ru

Саратовский филиал

Россия, Саратов, 410019

О. А. Караваева

Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук”

Email: guliy_olga@mail.ru

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов

Россия, Саратов, 410049

И. А. Бородина

Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН

Email: guliy_olga@mail.ru

Саратовский филиал

Россия, Саратов, 410019

Список литературы

Дополнительные файлы