Том 99, № 4 (2022)

Введение. В связи с появлением новых эпидемиологически значимых вариантов SARS-CoV-2 актуальной является разработка живой вакцины, способной обеспечить защиту против широкого спектра антигенных вариантов вируса.

Целью исследования являлись получение и биологическая характеристика аттенуированных путём холодовой адаптации вариантов SARS-CoV-2.

Материалы и методы. Лабораторный штамм SARS-CoV-2 Dubrovka и его варианты культивировали в клетках Vero и Calu-3. Количественное определение вируса проводили путём титрования в клетках Vero и методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Вирионы SARS-CoV-2 характеризовали методом трансмиссионной электронной микроскопии. Геномные последовательности вируса определяли методом нанопорового секвенирования. Аттенуационный (att) фенотип вариантов SARS-CoV-2 определяли на животной модели COVID-19 на сирийских хомяках.

Результаты. В результате длительного пассирования штамма Dubrovka в культуре клеток Vero при постепенно понижаемой до 23ºС температуре и последующего клонирования получены холодоадаптированные (ca, cold-adapted) варианты SARS-CoV-2 Dubrovka-са-B4 и Dubrovka-са-D2. В геномах ca-вариантов обнаружено до 20 нуклеотидных и 18 аминокислотных замен. Са-варианты, в отличие от родоначального штамма Dubrovka, эффективно размножались при 23ºС, а вариант Dubrovka-са-D2 имел температурочувствительный (ts) фенотип (не размножался при температуре 39ºС). Са-варианты вируса плохо размножались при температуре 37ºС в культуре клеток лёгких человека Calu-3, что, наряду с ts-фенотипом, может быть маркером аттенуации вируса по отношению к человеку. При интраназальном заражении сирийских хомяков ca-варианты вируса проявили аттенуационный фенотип — не приводили к снижению аппетита, вялости, сонливости, не замедляли прироста массы тела, значительно медленнее размножались в лёгких и мозге по сравнению с вирулентным штаммом Dubrovka.

 Заключение. Полученные в настоящей работе аттенуированные са-варианты SARS-CoV-2 Dubrovkaса-B4 и Dubrovka-са-D2 представляют интерес для дальнейшего исследования в качестве кандидатных вакцинных штаммов для создания живой аттенуированной вакцины против COVID-19.

Цель: определение in vitro мишеней для факторов антагонизма клебсиелл и энтерококков у грибов Candida albicans, выделенных из кишечного микробиома ВИЧ-инфицированных пациентов.

Материалы и методы. В экспериментах использованы 38 штаммов грибов Candida albicans, 28 штаммов Klebsiella pneumoniae и 30 штаммов Enterococcus faecalis, изолированных из кишечного микробиома 89 ВИЧ-инфицированных детей. Средний возраст пациентов составил 24 ± 2 мес, мальчиков было 49 (55%), девочек — 40 (45%). Микроорганизмы выделяли из кишечного биотопа с использованием селективных питательных сред HiChrome Candida Agar, HiChrome Klebsiella Selective Agar Base, Энтерококкагар; проводили видовую идентификацию. В модельных экспериментах изучена антикаталазная активность экзометаболитов E. faecalis и влияние K. pneumoniae на морфологическую трансформацию грибов C. albicans.

Результаты. Клебсиеллы на 58,7% снижают интенсивность образования ростовых трубок у C. albicans (p < 0,01). При совместном культивировании 12,3% дрожжевых клеток дают ростовые трубки, тогда как в монокультуре грибов обнаружили 29,8% трансформированных клеток. Установлено, что экзометаболиты 65,7% штаммов E. faecalis снижают продукцию каталазы у C. albicans. Исходный уровень каталазы у интактных культур C. albicans в среднем составляет 1,02 мкмоль/мин оптической плотности, после обработки экзометаболитами E. faecalis снижается до 0,55 мкмоль/мин, т.е. на 46,1% (p < 0,05).

Выводы. K. pneumoniae и E. faecalis проявляют антагонизм к C. albicans c разной степенью выраженности. Мишенями для факторов антагонизма факультативной микробиоты у C. albicans являются морфологическая трансформация и продукция каталазы.

Введение. Klebsiella pneumoniae в микробиоте человека может быть представлена как комменсальными, так и высокопатогенными штаммами, например, с гипермукоидным фенотипом. Данный фенотип характеризуется определёнными генетическими детерминантами, позволяющими выявить патогенный потенциал изолятов молекулярно-генетическим методом ПЦР.

Цели и задачи: сравнить патогенный потенциал изолятов K. pneumoniae, полученных от «практически» здоровых лиц, пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), и штаммов, выделенных из биологического материала с внекишечными инфекциями (ВКИ), посредством детекции генов, связанных с вирулентностью.

Материалы и методы. Исследование проводили с применением набора олигонуклеотидов для мультиплексного анализа — 8 генов, предположительно ассоциированных с вирулентностью, с функцией захвата железа (ybtS, kfu, iutA), адгезии и инвазии (mrkD), гипермукоидного фенотипа и вирулентных штаммов (mrkD, magA, rmpA, k2) и метаболизма аллантоина — продукта расщепления пуринов и мочевой кислоты (allS). Анализу подвергли 69 изолятов, выделенных из микробиоты кишечника пациентов с ВЗК, 68 изолятов из кишечной микробиоты «практически» здоровых людей и 25 мультирезистентных изолятов, выделенных из крови, мочи, операционных ран, бронхоальвеолярного лаважа пациентов с ВКИ.

Результаты. Установлено, что 4 из 8 исследованных генов были ассоциированы с различными болезненными состояниями, диагностируемыми у пациентов. Ген сидерофора ybtS достоверно чаще встречался у изолятов, выделенных как у больных с ВЗК (р = 0,024), так и с мультирезистентными ВКИ (p < 0,001). У изолятов ВЗК также достоверно чаще представлен ген гипермукоидного фенотипа rmpA (р = 0,038). У мультирезистентных внекишечных изолятов наиболее достоверно представлены адгезин mrkD (р ≤ 0,001) и allS (р = 0,032).

Заключение. Изоляты K. pneumoniae от пациентов с ВКИ имели наибольший патогенный потенциал, а изоляты из кала «практически» здоровых лиц — наименьший. Наиболее часто встречающиеся гены вирулентности связаны с адгезией и гипермукоидным фенотипом.

Введение. Listeria monocytogenes относится к числу значимых патогенов человека, вызывает различные формы листериоза, в том числе пищевые инфекции, менингиты, неонатальный сепсис, аборты. Листерии распространены во всех регионах мира.

Целью исследования явилось проведение микробиологического мониторинга Listeria monocytogenes в водных объектах вблизи животноводческих предприятий Вологодского района Вологодской области.

Материалы и методы. Выделение культур бактерий осуществляли титрационным и фильтрационным методами, идентифицировали с применением бактериологического, серологического методов, автоматизированных приборных методов, полногеномного секвенирования и биоинформационного анализа.

Результаты. Из 12 проанализированных образцов водных источников (6 образцов — сточные воды, 4 — речная вода, 2 — ливневые воды) выделены 3 штамма L. monocytogenes и один штамм L. innocua. Полногеномное секвенирование 3 штаммов L. monocytogenes установило их принадлежность к эволюционной линии II, к 3 сиквенс-типам и 2 серогруппам: ST425(1/2a-3a), ST20(1/2a-3a) и ST7(4a-4c). Показана принадлежность штаммов к категории множественно лекарственно-устойчивых, резистентных к 3 функциональным группам антимикробных препаратов (тетрациклинам, макролидам, сульфаниламидам). В геномах штаммов идентифицированы гены антибиотикорезистентности (fosX, pbp-like, lin, norB, sul), острова патогенности LIPI-1,LIPI-2, гены вирулентности inlABCJ, oatA, ami, gtcA, vip, lisK. У 1 штамма выявлен остров стрессоустойчивости SSI-1.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о контаминации водных источников вблизи животноводческих предприятий штаммами L. monocytogenes, обладающими высоким потенциалом патогенности, который может привести к вспышкам листериоза у людей, что указывает на необходимость тщательного мониторинга водных источников на наличие возбудителя листериоза и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Введение. В 2017–2020 гг. в России впервые за много лет от больных отитами были выделены штаммы Vibrio cholerae nonO1/nonO139 (НАГ-вибрионов).

Цель работы — биоинформационный анализ полных геномов (WGSs) и отдельных генов штаммов НАГ-вибрионов — возбудителей отитов, выделенных в России.

Материалы и методы. Анализ WGSs 8 клинических изолятов НАГ-вибрионов, полученных на платформе «MiSeq Illumina», проводили с использованием программ «BioEdit», «BLASTN», «BLASTP», «Vector NTI»; антибиотикоустойчивость определяли согласно МУК 4.2.2495-09.

Результаты. Штаммы различались по содержанию SNP, наборам детерминант факторов патогенности/ персистенции и их аллелям. Все были лишены профагов CTX, preCTX, RS1, острова патогенности VPI, гена термостабильного токсина, мобильных элементов, связанных с антибиотикорезистентностью, острова пандемичности VSP-I; 2 штамма содержали остров VSP-II. В разных сочетаниях выявлены гены ряда протеаз, cholix-токсина, кластер системы секреции 3-го типа (T3SS), дополнительные кластеры T6SS. Продукты изменённых генов сохраняли либо утрачивали характерные активные домены. В цитотоксине MARTX 6 штаммов отсутствовал ключевой домен ACD, у 4 выявлен новый домен rtxA-like. Кластеры генов биоплёнкообразования варьировали по стуктуре. Присутствие генов антибиотикорезистентности не всегда коррелировало с антибиотикограммами. Все штаммы были чувствительны к большинству антибиотиков, но некоторые проявляли резистентность к 1–4 препаратам.

Выводы. Все изученные штаммы — возбудители отитов, несмотря на выявленные различия, обладают достаточными наборами детерминант, ответственных за реализацию патогенетического и персистентного потенциала. В связи с несовпадением генотипических и фенотипических показателей антибиотикорезистентности при выборе препаратов для этиотропной терапии НАГ-инфекций следует полагаться в основном на фенотип. Выявление на территории России больных отитами, вызванными НАГ-вибрионами, указывает на целесообразность включения тестов на их присутствие в схему бактериологического анализа при внекишечных инфекциях и в случаях их выделения — оперативного определения чувствительности к антибиотикам.