Пренатальная гипоксия вызывает нарушение экспрессии генов chrna4 и chrna7 в мозге взрослых крыс, не влияя на метаболизм ацетилхолина во время эмбрионального развития

Полный текст

Принятые сокращения: АХЭ – ацетилхолинэстераза; ПГ – пренатальная гипоксия; ХАТ – холин-ацетилтрансфераза; AMG – амигдала; chrna4 – альфа-4-субъединица никотинового ацетилхолинового рецептора; chrna7 – альфа-7-субъединица никотинового ацетилхолинового рецептора; HPC – гиппокамп; HT – гипоталамус; NAcc – прилежащее ядро стриатума; PFC – медиальная префронтальная кора; PVN – паравентрикулярное ядро таламуса; VTA – вентральная тегментальная область.

ВВЕДЕНИЕ

Никотиновая зависимость представляет собой серьёзную общественную угрозу: ежегодно от неё умирает до 8 миллионов человек [1]. В современном понимании, наряду с генетической предрасположенностью к никотиновой зависимости [2, 3], большое значение имеют также эпигенетические изменения под влиянием факторов окружающей среды, особенно возникающих в период эмбрионального развития мозга [4, 5]. Таким образом, воздействие стрессоров окружающей среды во время пренатального периода, опосредованное эндокринной системой матери или изменением доступности кислорода у плода, увеличивает риск развития расстройств, связанных с употреблением психоактивных веществ [6, 7], особенно никотиновой зависимости, у потомков [8, 9].

Гипоксия плода, часто сопровождающаяся реакцией глюкокортикоидной системы матери на нарушение доставки кислорода, является одним из наиболее значимых факторов, предопределяющих нарушения развития мезолимбической системы головного мозга. Это состояние приводит к повышенному потреблению никотина у взрослого потомства [9]. В частности, наши предыдущие исследования на крысах показали, что повышенный риск никотиновой зависимости у взрослых может быть связан с эпизодами тяжёлой гипоксии на 14–16-й дни эмбриогенеза [10, 11], что соответствует 5–7-й неделям беременности у человека в плане формирования структур мозга [12]. В этот период дофаминергические нейроны вентральной тегментальной области (VTA) завершают аксональное наведение к прилежащему ядру стриатума (NAcc) [13], а гиппокамп (HPC) и другие корковые структуры, иннервирующие NAcc, только начинают формироваться [14]. В нашем предыдущем исследовании мы дополнительно сравнили эффекты внутриутробной ишемии плода и пренатальной гипобарической гипоксии, моделируемой в барокамере, в сочетании со стрессорной реакцией матери [11, 15]. Мы обнаружили, что ключевую роль в предрасположенности к никотиновой зависимости играет не только сама гипоксия, но и избыточное снабжение развивающегося мозга глюкокортикоидами [11]. Это приводило к аберрантному профилю экспрессии глюкокортикоидных рецепторов во внегипоталамических структурах головного мозга, вызывая нарушение циркадной динамики глюкокортикоидов, глюкокортикоид-зависимой экспрессии и, как следствие, нарушение глюкокортикоид-зависимых процессов на протяжении всей дальнейшей жизни [16–18]. Гипоксия и связанные со стрессом процессы могут влиять на созревание холинергической медиаторной системы мозга как через изменения экспрессии отдельных элементов [19], так и через недостаточность аэробного окислительного метаболизма для эффективного синтеза ацетилхолина [20–22].

Первичные механизмы, лежащие в основе влияния пренатальной гипоксии (ПГ) и материнских глюкокортикоидных стрессорных гормонов на развитие мозга плода, которое имеет решающее значение для формирования никотиновой зависимости, до сих пор остаются неясными. Поэтому в данной работе мы изучили динамику активности ключевых ферментов, участвующих в синтезе и деградации ацетилхолина, а именно холин-ацетилтрансферазы (ХАТ) и ацетилхолинэстеразы (АХЭ), а также колебания концентрации ацетилхолина на третьей неделе эмбрионального развития (е15, е16, е17, е20) и на 1-е сутки после рождения (р1) в мозге контрольных крыс и крыс, подвергшихся ПГ. Учитывая возможность нарушений экспрессии рецепторов ацетилхолина, мы также исследовали динамику транскрипции субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора альфа-4 (chrna4) и альфа-7 (chrna7) как в развивающемся, так и во взрослом мозге под влиянием ПГ. Хроническая никотиновая зависимость возникает из-за снижения транскрипции рецепторов ацетилхолина в результате потребления никотина. Ранее нами было показано, что взрослые ПГ крысы проявляют повышенную склонность к потреблению никотина в условиях свободного выбора [10], а хроническое потребление никотина через осмотические мини-насосы вызывает у этих крыс более выраженные поведенческие признаки никотиновой зависимости по сравнению с контрольными животными [10, 11]. В этом исследовании мы также использовали осмотические мини-насосы для обеспечения непрерывной подачи никотина в течение двух недель и сравнивали влияние никотина на транскрипцию chrna4 и chrna7 в структурах мозга взрослых крыс в контрольной группе и группе ПГ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Исследование проведено на животных из ЦКП «Биоколлекция лабораторных млекопитающих разной таксономической принадлежности» Института физиологии им. Павлова РАН. В работе были использованы взрослые беременные самки крыс линии Вистар в возрасте 12–13 недель и массой 220–250 г вместе с их эмбриональным (е15, е16, е17, е20) и новорожденным (р1) потомством без определения пола и взрослым потомством – самцами в возрасте 3 месяца и массой 320–350 г. Все экспериментальные процедуры выполнены в соответствии с «Методическими указаниями по проведению исследований на животных» [23] и одобрены этическим комитетом по использованию животных Института физиологии им. Павлова РАН (протокол № 08/02 от 02.08.2022).

Пренатальная гипоксия. Модель ПГ, описанная в наших предыдущих исследованиях, использовалась как модель гипоксии плода [10, 11, 16–18]. Для моделирования ПГ мы использовали барокамеру проточного типа с температурой от 20 °C до 25 °C, в которой атмосферное давление постепенно снижали до 180 мм.рт.ст., достигая 5%-ного содержания кислорода (что эквивалентно 11 000 м над уровнем моря) в течение 20 мин. Через 3 ч воздействия содержание кислорода нормализовалось в течение 20 мин. Беременных самок помещали в такие условия 3 дня подряд (14-й, 15-й и 16-й дни беременности) с интервалом между сеансами 24 ч. Летальность в барокамере составила около 15%. Интактных самок контрольной группы также помещали в барокамеру на 3 ч на 14-й, 15-й и 16-й дни беременности, не подвергая гипоксическому воздействию. Срок беременности составил 22–23 дня.

Колориметрические методы. Для колориметрического анализа головной мозг эмбрионов (е15, е16, е17, е20) и новорожденных (р1) контрольных и ПГ крыс извлекали и замораживали в жидком азоте. Каждая группа крыс состояла из случайно выбранных эмбрионов или детёнышей от разных самок, чтобы минимизировать систематическую ошибку в помёте.

Измерение активности холин-ацетилтрансферазы. Активность ХАТ анализировали с использованием набора для колориметрического анализа (E-BC-K125-M; «Elabscience», США). Для выделения цитозольных белков образцы мозга промывали и гомогенизировали в PBS (0,01 М, pH 7,4) при +4 °C и центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Процедуры анализа проводили в соответствии с протоколом производителя, а поглощение измеряли при длине волны 324 нм с использованием планшетного ридера (CLARIOstar PLUS, «BMG Labtech», Германия). Количество кофермента А, образовавшегося в ходе реакции, определяли с использованием стандартной кривой. Активность ХАТ рассчитывали в нмоль кофермента А, генерируемого в минуту в пересчёте на мг общего белка. Как здесь, так и в других биохимических тестах, приведённых ниже, концентрацию общего белка в образцах измеряли с использованием набора Pierce Rapid Gold BCA («Thermo Fisher Scientific», США) в соответствии с протоколом производителя.

Измерение активности ацетилхолинэстеразы. Активность АХЭ анализировали с использованием набора для колориметрического анализа (E-BC-K052-S; «Elabscience»). Образцы мозга промывали и гомогенизировали в 0,9%-ном растворе NaCl при +4 °С. Процедуры анализа проводили в соответствии с протоколом производителя, а поглощение измеряли при длине волны 520 нм с использованием планшетного ридера (CLARIOstar PLUS, «BMG Labtech»). Количество ацетилхолина, оставшегося после реакции, определяли с использованием стандартной кривой. Активность АХЭ рассчитывали в нмоль гидролизованного ацетилхолина в минуту в пересчёте на мг общего белка.

Измерение концентрации ацетилхолина. Концентрацию ацетилхолина анализировали с использованием колориметрического набора ELISA (E-EL-0081; «Elabscience»). Образцы мозга промывали и гомогенизировали в PBS (0,01 М, pH 7,4) при +4 °C и центрифугировали при 5 000 g в течение 10 мин для выделения супернатанта, содержащего ацетилхолин. Процедуры анализа проводили в соответствии с протоколом производителя, а поглощение измеряли при 450 нм с использованием планшетного ридера (CLARIOstar PLUS, «BMG Labtech»). Концентрацию ацетилхолина определяли с использованием стандартной кривой, рассчитывали и выражали в пг на мг общего белка.

Хроническое потребление никотина взрослыми крысами. Детёнышей крыс отсаживали от матерей в возрасте 30 дней, когда самки тратили на кормление не более 2 ч [24]. После отъёма крыс помещали в клетки размерами 60 × 30 × 20 см по 5–6 животных в каждой. Каждая группа состояла из случайно выбранных животных, рождённых от разных самок, чтобы минимизировать систематическую ошибку в помёте. Крысы находились в свободном доступе к воде и пище и содержались в режиме темноты и света 12 : 12 ч при комнатной температуре и постоянной влажности около 60%. Для проведения эксперимента использовали взрослых самцов с активным сперматогенезом из контрольной и ПГ групп в возрасте 3 месяца. В первый день крысам под изофлурановой анестезией подкожно имплантировали осмотические мини-насосы (2002W, «RWD Systems», Китай) со скоростью потока 0,5 мкл/ч, содержащие раствор тартрата никотина. Концентрацию никотина в насосах корректировали с учётом различий в массе тела крыс, что приводило к непрерывному подкожному вливанию тартрата никотина со скоростью 9 мг/кг в день. У контрольных и ПГ крыс, не принимавших никотин, мини-насосы заполняли физиологическим раствором. После двух недель потребления никотина или физиологического раствора крыс декапитировали гильотиной и собирали образцы структур головного мозга для ПЦР-анализа.

Количественная ПЦР РВ. Тотальную РНК из головного мозга эмбрионов (е15, е16, е17, е20) и новорожденных (р1) контрольных и ПГ крыс, а также из образцов гиппокампа (HPC), медиальной префронтальной коры (PFC), амигдалы (AMG), прилежащего ядра (NAcc), паравентрикулярного ядра таламуса (PVN), гипоталамуса (HT) и вентральной тегментальной области (VTA) взрослых крыс (через две недели после потребления никотина или физиологического раствора) выделяли с помощью набора ExtractRNA Kit (BC032, «Евроген», Россия) и очищали с помощью DNAseI (SB-G3342, «Servicebio», Китай), согласно инструкциям производителя. Качество и концентрацию тотальной РНК определяли путём измерения оптической плотности при 260 и 280 нм с использованием планшетного ридера (CLARIOstar PLUS, «BMG Labtech»). кДНК синтезировали из 2 мкг тотальной РНК с использованием набора для обратной транскрипции MMLV (SK021, «Евроген», Россия). Количественную ПЦР РВ проводили с использованием набора qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген») на термоциклере Gentier 96E («Tianlong», Китай). Уровни экспрессии генов альфа-4-субъединицы рецептора ацетилхолина (chrna4) и альфа-7-субъединицы рецептора ацетилхолина (chrna7) оценивали с использованием метода ΔΔCt с нормализацией по содержанию мРНК β-тубулина в качестве референсного гена. Использовали следующие последовательности праймеров:

• chrna4, прямая: GGTGAAGGAGGACTGGAA,

обратная: AAGGCAGACAATGATGAACA

(температура отжига +58 °С, продукт 78 п.н.);

• chrna7, прямая: CTCTTGGAATAACTGTCTT,

обратная: CGAAGTATTGTGCTATCA

(температура отжига +58 °C, продукт 105 п.н.);

• β-тубулин, прямая: TAGAGGAGATGCTACTTA,

обратная: AATGGTGATAATACTGTTAA

(температура отжига +58 °C, продукт 147 п.н.).

Вестерн-блоттинг. Для подтверждения влияния изменений экспрессии мРНК chrna7 на уровень белка CHRNA7 в структурах головного мозга взрослых контрольных и ПГ крыс мы использовали вестерн-блоттинг. Для получения суммарных белковых экстрактов для вестерн-блоттинга образцы HPC, PFC, AMG, NAcc, PVN, HT и VTA гомогенизировали в 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), содержащем 150 мМ NaCl, 1%-ный Triton X-100 и коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (SB-G2006, SB-G2007, «Servicebio»). Гомогенаты инкубировали на шейкере в течение 30 мин при +4 °С, центрифугировали 10 мин при 14 000 g и собирали супернатанты. Образцы, содержащие равные количества общего белка, кипятили в течение 10 мин при +70 °C с 3-кратным буфером Лэммли.

Белки разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и затем переносили на мембраны из ПВДФ («Thermo Fisher Scientific», США). После блокирования в течение 1 ч в PBS, содержащем 5% обезжиренного молока, мембраны инкубировали в PBS с кроличьими первичными антителами против CHRNA7 (1 : 2000, DF13247, «Affinity Biosciences», США) и β-тубулина (1 : 5000, ab179513, «Abcam», Великобритания) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем мембраны трижды промывали PBST (PBS с 0,1%-ным Tween-20) и инкубировали в PBS с HRP-конъюгированными антикроличьими вторичными антителами (1 : 5000, E-AB-1003, «Elabscience») в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембраны дважды промывали PBST. Визуализацию осуществляли с помощью набора Clarity ECL («Bio-Rad», США) и документирующей системы ChemiScope 6000 («Clinx Science Instruments», Китай). Содержание белка CHRNA7 определяли, нормируя данные на содержание β-тубулина, с использованием программного обеспечения ImageJ («NIH», США). Полные изображения результатов вестерн-блоттинга представлены на онлайн-ресурсе 1 (рис. П1 Приложения).

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием Prism 10 («GraphPad, Inc.»). Распределение данных оценивали на нормальность с использованием критерия Шапиро–Уилка (p > 0,05) и QQ-графика. В качестве параметрического теста использовали одно- или двусторонний дисперсионный анализ. Апостериорные сравнения проводились с использованием теста Тьюки. Статистическая значимость была установлена на уровне p < 0,05. Результаты выражали как среднее ± стандартная ошибка среднего. Для ПЦР РВ и вестерн-блоттинга среднее значение и стандартная ошибка среднего были пересчитаны как % от контроля соответствующего возраста, принятого за 100%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние пренатальной гипоксии на метаболизм ацетилхолина в мозге крыс во время пренатального и раннего постнатального развития. Чтобы изучить влияние ПГ на метаболизм ацетилхолина, мы измерили активность ХАТ, фермента, синтезирующего этот нейромедиатор, а также активность АХЭ, фермента, расщепляющего ацетилхолин, в развивающемся мозге эмбрионов на третьей неделе беременности (е15, е16, е17, е20) и у новорожденных крысят (р1) (рис. 1, а, б). Нами не было обнаружено никаких изменений активности этих ферментов в мозге ПГ крыс по сравнению с контролем. Аналогичным образом не наблюдалось существенных изменений концентрации ацетилхолина во все исследованные периоды (рис. 1, в).

 

Рис. 1. Влияние ПГ на активность ХАТ (а), АХЭ (б) и концентрацию ацетилхолина (в) в мозге крыс во время пренатального (эмбриональные дни е15, е16, е17, е20) и раннего постнатального (постнатальный день р1) развития, выявленные колориметрическими методами. n = 5

 

Влияние пренатальной гипоксии на экспрессию мРНК рецепторов ацетилхолина в мозге крыс во время пренатального и раннего постнатального развития. Чтобы оценить влияние ПГ на рецепторную часть нейромедиаторной системы ацетилхолина, мы измерили относительное содержание мРНК альфа-4- (chrna4) и альфа-7 (chrna7)-субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора в эмбриональном мозге в течение третьей недели беременности (е15, е16, е17, е20) и в мозге новорожденных крысят (р1) (рис. 2, а, б). Снижение относительного количества мРНК chrna4 было обнаружено в мозге крыс через сутки после первого сеанса ПГ (рис. 2, а, e15, ANOVA F (1, 9) = 10,2212, p = 0,0127; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0126685, тест Тьюки). В ходе дальнейшего пренатального развития и у новорожденных ПГ крыс не выявлено существенных изменений экспрессии chrna4 в головном мозге. Кроме того, мы обнаружили увеличение относительного количества мРНК chrna7 через 24 ч после первого сеанса ПГ (рис. 2, б, e15, ANOVA F (1, 9) = 7,2211, p = 0,0276; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0276166, тест Тьюки) и через день после второго сеанса ПГ (рис. 2, б, e16, ANOVA F (1, 9) = 6,6590, p = 0,0326; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0325905, тест Тьюки). На протяжении дальнейшего пренатального развития и у новорожденных ПГ крыс не выявлено существенных изменений экспрессии chrna7 в головном мозге. Таким образом, несмотря на отсутствие влияния на метаболизм ацетилхолина, ПГ вызывает изменения экспрессии рецепторов ацетилхолина в развивающемся мозге.

 

Рис. 2. Влияние ПГ на уровни экспрессии мРНК chrna4 (а) и chrna7 (б) в головном мозге крыс во время пренатального (эмбриональные дни e15, e16, e17, e20) и раннего постнатального (постнатальный день p1) развития, выявленное с помощью ПЦР РВ. * Различия по сравнению с контролем достоверны, p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, тест Тьюки). n = 5

 

Влияние пренатальной гипоксии на экспрессию мРНК ацетилхолиновых рецепторов в структурах головного мозга интактных взрослых крыс и у животных, подвергшихся воздействию никотина. Для изучения отдалённых последствий ПГ для экспрессии ацетилхолиновых рецепторов в головном мозге мы измерили относительное содержание мРНК chrna4 и chrna7 в структурах лимбической системы (HPC, PFC, AMG, NAcc, PVN, HT, VTA) взрослых (3-месячных) контрольных и ПГ крыс как без, так и после двух недель стабильного потребления никотина, обеспечиваемого с помощью осмотических мини-насосов.

При оценке относительного количества мРНК у ПГ крыс наблюдалось значительное снижение экспрессии гена chrna4 в PFC (рис. 3, б, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 9,872, p = 0,0063; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0399817, тест Тьюки), NAcc (рис. 3, г, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 5,644, p = 0,0304; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0190, тест Тьюки) и HT (рис. 3, е, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 9,673, p = 0,0067; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0061796, тест Тьюки), но без влияния на HPC (рис. 3, а), AMG (рис. 3, в), PVN (рис. 3, д) и VTA (рис. 3, ж). Более того, через две недели потребления никотина количество мРНК chrna4 в мозге контрольных крыс значительно снизилось до значений, сопоставимых с таковыми у ПГ крыс в HPC (рис. 3, а, ANOVA Никотин F (1, 17) = 9,989, p = 0,0057; контроль по сравнению с «контроль + никотин», p = 0,0057263, тест Тьюки), PFC (рис. 3, б, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 9,872, p = 0,0234; контроль по сравнению с «контроль + никотин», p = 0,0022758, тест Тьюки), NAcc (рис. 3, г, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 5,644, p = 0,0304; контроль по сравнению с «контроль + никотин», p = 0,0421275, тест Тьюки) и HT (рис. 3, е, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 9,673, p = 0,0067; контроль по сравнению с «контроль + никотин», p = 0,0157127, тест Тьюки). Напротив, потребление никотина крысами ПГ не вызывало изменений в содержании мРНК chrna4 во всех структурах мозга по сравнению с интактными ПГ крысами (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние ПГ и потребления никотина на уровни экспрессии мРНК chrna4 (а–ж) и chrna7 (з–о) в HPC (а, з), PFC (б, и), AMG (в, к), NAcc (г, л), PVN (д, м), HT (е, н), VTA (ж, о) взрослых крыс, выявленные методом ПЦР РВ. * Различия по сравнению с контролем достоверны, p < 0,05 (двухфакторный дисперсионный анализ, тест Тьюки). n = 5

 

При оценке относительного количества мРНК chrna7 в мозге взрослых крыс было обнаружено, что ПГ вызывает значительное снижение экспрессии гена в HPC (рис. 3, з, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 7,945, p = 0,0124; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,038, тест Тьюки) и PFC (рис. 3, и, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 9,55, p = 0,00702; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0157, тест Тьюки), не влияя на AMG (рис. 3, к), NAcc (рис. 3, л), PVN (рис. 3, м), HT (рис. 3, н) и VTA (рис. 3, о).

Влияние изменений уровней мРНК chrna7 на экспрессию белка CHRNA7 в структурах мозга взрослых контрольных и ПГ крыс было проверено методом вестерн-блоттинга (рис. 4). Было обнаружено, что ПГ вызывает снижение уровня белка CHRNA7 в HPC (рис. 4, а, ANOVA F (1, 9) = = 5,6864, p = 0,0442; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0442243, тест Тьюки) и PFC (рис. 4, б, ANOVA F (1, 9) = 11,9926, p = 0,0085; контроль по сравнению с ПГ, p = 0,0085305, тест Тьюки), но не в AMG (рис. 4, в), NAcc (рис. 4, г), PVN (рис. 4, д), HT (рис. 4, е) и VTA (рис. 4, ж).

 

Рис. 4. Влияние ПГ на экспрессию белка CHRNA7 в HPC (а), PFC (б), AMG (в), NAcc (г), PVN (д), HT (е), VTA (ж) взрослых крыс, выявленную методом вестерн-блоттинга. * Различия по сравнению с контролем достоверны, p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ, тест Тьюки). n = 5

 

Кроме того, после двух недель потребления никотина количество мРНК chrna7 в мозге контрольных крыс значительно снизилось до уровней, наблюдаемых в HPC ПГ крыс (рис. 3, з, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 7,945, p = 0,0124; контроль по сравнению с «контроль + никотин», p = = 0,0103, тест Тьюки) и PFC (рис. 3, и, ANOVA Группа × Никотин F (1, 16) = 9,55, p = 0,00702; контроль по сравнению с «контроль + никотин», p = 0,0156, тест Тьюки). В то же время в мозге ПГ крыс потребление никотина не вызывало изменений в уровнях мРНК chrna7 по сравнению с интактными ПГ крысами (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Факторы внешней среды оказывают существенное влияние на развивающийся организм. Условия формирования отдельных органов и тканей плода передают информацию об условиях дальнейшей жизнедеятельности [25–27]. Нормальное протекание беременности подразумевает высокую эффективность поступления энергетических субстратов, необходимых для интенсивных процессов пролиферации, миграции и образования связей между клетками мозга [28], а также ограничение поступления стероидных гормонов до поздних сроков беременности, когда глюкокортикоиды вовлекаются в такие процессы, как терминальная дифференцировка нейрональных клеток и созревание лёгких [29–32]. Ограничение кислородного снабжения эмбриона вызывает существенное нарушение метаболизма, ведя к замедлению развития [25–27, 33, 34], в то время как избыточное поступление глюкокортикоидов способно нарушать формирование адекватного профиля тканеспецифической экспрессии, сохраняющейся на всю жизнь на эпигенетическом уровне [16, 17, 35, 36].

Гипоксия неизбежно сопровождается снижением аэробного энергетического метаболизма и приводит к снижению продукции ATP, необходимого в том числе для синтеза ацетилхолина на фоне перехода клеток на анаэробный метаболизм, что регулируется гипоксия-индуцируемым фактором-1 (HIF1) [37–40]. Однако степени выраженности последствий гипоксии и стресса матери могут существенно отличаться в зависимости от времени воздействия на развивающийся мозг [12]. Так, при предъявлении ПГ на 14–16 сутки эмбрионального развития мы не обнаружили существенных изменений в активности как ХАТ, так и АХЭ, что, как следствие, не привело и к изменениям концентрации ацетилхолина в развивающемся эмбриональном и раннем постнатальном мозге крыс, несмотря на то что ранее нами и другими исследователями был подтверждён факт интенсификации гипоксия-зависимого сигналинга как во время эмбриогенеза, так и в постнатальном периоде [26, 41–45]. При этом на ранних этапах предъявления гипоксических эпизодов мы показали снижение транскрипции chrna4 (e15) и, вероятно, глюкокортикоид-зависимое увеличение транскрипции chrna7 (e15, e16) [11, 19]. В этот период развития мозга уже сформированы его структуры, обеспечивающие выброс ацетилхолина [12, 46], что может способствовать повышению устойчивости ацетилхолин-производящих нейронов к внешним стрессорам, однако ещё только начинается формирование рецептирующих ацетилхолин ГАМК-ергических нейронов стриатума, а также нейронов HPC, префронтальной коры и AMG – корковых структур, регулирующих активность стриатума по отношении к выбросу дофамина VTA [12, 14, 47]. Как следствие, именно в этих структурах мозга наблюдаются наиболее яркие нарушения экспрессии ацетилхолиновых рецепторов, сохраняющиеся во взрослом мозге. Эти нарушения можно рассматривать либо как причину, либо как компенсаторную реакцию на повышенную возбудимость клеток головного мозга, о которой сообщают другие авторы [48].

Ранее нами было показано, что ПГ вызывает пожизненные изменения экспрессии глюкокортикоидных рецепторов в HPC и префронтальной коре, что сопровождается снижением глюкокортикоид-зависимой транскрипции и нарушением глюкокортикоидной отрицательной обратной связи [11, 16, 17]. Более того, альфа-7-субъединица ацетилхолинового рецептора была идентифицирована как мишень транскрипционной активности глюкокортикоидных рецепторов [19, 49], а снижение экспрессии мРНК и белка CHRNA7 в результате ПГ выявлено нами именно в гиппокампе и префронтальной коре. Эти глутаматергические структуры мозга активируют ГАМК-ергические нейроны стриатума, что сопровождается усилением выброса дофамина нейронами VTA и вызывает эффект, известный как внутреннее подкрепление [50–52]. Снижение эффективности выброса глутамата из-за снижения экспрессии chrna4 и chrna7 в префронтальной коре и chrna7 в HPC, так же как и снижение экспрессии chrna4 в стриатуме взрослых крыс в результате ПГ, может объяснять описанную нами ранее склонность этих животных к потреблению никотина и выраженный синдром отмены [10, 11]. Более того, для нейронов AMG показано опосредованное ингибирование потенциалов действия в клетках вентрального стриатума [53, 54]. При этом в AMG нами не было показано изменений экспрессии chrna4 и chrna7, что также может вносить вклад в несбалансированную активность лимбической системы в результате ПГ. И наконец, гипоталамические нейроны способны к усилению стимуляции дофаминовых нейронов VTA [55], однако в них также снижена относительная экспрессия chrna4.

В клинической практике хорошо известен процесс выработки резистентности к никотину, определяющей развитие зависимости от дальнейшего потребления. Известно, что одним из механизмов такой резистентности является снижение экспрессии ацетилхолиновых рецепторов, в том числе альфа-4- и альфа-7-субъединиц [56–61]. Интересно, что через неделю вынужденного потребления никотина снижение экспрессии chrna4 (HPC, PFC, NAcc, HT) и chrna7 (HPC, PFC) было выявлено только у контрольных животных, в то время как изначально низкая экспрессия этих генов в мозге ПГ крыс оставалась на неизменно низком уровне.

Таким образом, ПГ не оказывает влияния на активность синтеза и деградации ацетилхолина в развивающемся мозге, но вызывает существенные нарушения экспрессии альфа-4- и альфа-7-субъединиц ацетилхолиновых рецепторов в структурах лимбической системы крыс, что может лежать в основе ранее показанной склонности к потреблению никотина и выраженного абстинентного синдрома при отмене.

Вклад авторов. О.В. Ветровой – концепция и руководство работой; О.В. Ветровой, С.С. Потапова, В.А. Стратилов, Е.И. Тюлькова – проведение экспериментов; О.В. Ветровой, С.С. Потапова, В.А. Стратилов, Е.И. Тюлькова – обсуждение результатов исследования; О.В. Ветровой и В.А. Стратилов – написание текста; Е.И. Тюлькова – редактирование текста статьи.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-75-00003).

Благодарности. Авторы глубоко признательны Елене Аксеновой за прекрасную техническую помощь в экспериментах на животных.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Методическими указаниями по проведению исследований на животных». Протокол исследования рассмотрен и одобрен локальным этическим комитетом Института физиологии им. И.П. Павлова (протокол № 08/02 от 02.08.2022).

Об авторах

О. В. Ветровой

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vov210292@yandex.ru
Россия, 199034, Санкт-Петербург

С. С. Потапова

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Email: vov210292@yandex.ru
Россия, 199034, Санкт-Петербург

В. А. Стратилов

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Email: vov210292@yandex.ru
Россия, 199034, Санкт-Петербург

Е. И. Тюлькова

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Email: vov210292@yandex.ru
Россия, 199034, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы