Аутофагия в нервной системе: общие принципы и специфические функции

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Термин аутофагия – от греческих слов “ауто-” (само-) и “фагос” (поглощающий) – был известен уже в 19 веке и его широко использовали для описания эффекта постепенного истощения органов и тканей животных при длительном голодании. Первое упоминание аутофагии встречается в научных трудах французского ученого M. Anselmier, который, предположительно, и ввел понятие аутофагии как механизма, посредством которого органы и ткани используют само вещество ткани для продления жизни организма [78]. Однако более современное понимание аутофагии было предложено в середине XX в. бельгийским ученым Christian de Duve, который впервые выявил и описал лизосомы и вслед за этим двухмембранные структуры, содержащие клеточные органеллы на разных этапах деградации, которые он назвал аутофагосомами [35]. Понимание механизма аутофагии менялось и усложнялось со временем. Вначале предполагали, что аутофагия в большей степени представляет собой неселективный механизм грубой деградации белков и клеточных органелл. Однако позже, после того, как в 1992 г. группой под руководством Yoshinori Ohsumi были открыты основные гены atg (autophagy-related genes), участвующие в процессе аутофагии, в ходе последующих многочисленных исследований стало понятно, что механизм аутофагии многоступенчатый, сложный в регуляции и высоко избирательный [62, 70, 104, 107, 152]. За исследования в области аутофагии Christian de Duve была присуждена Нобелевская премия в 1974 г. и Yoshinori Ohsumi – в 2016 г. [53].

Согласно современным представлениям, аутофагия представляет собой внутриклеточный катаболический процесс, который способствует систематической деградации и непрерывной рециркуляции клеточных компонентов через лизосомно-зависимый путь [69, 84, 104]. Вопрос, для чего эта деградация нужна клетке и что она обеспечивает, является ключевым в понимании роли аутофагии. Целью деградации является не просто элиминация материала, но производство за счет избирательной деградации мономеров, которые далее используются клеткой для синтеза новых соединений, обеспечивающих жизнедеятельность клетки и ее обновление, а также перестройку ее метаболизма при изменяющихся условиях среды, в процессах метаморфоза и дифференциации. Аутофагия служит динамической системой рециркуляции клеточных элементов, выполняющей в целом гомеостатическую и адаптивную функции. Эти функции исключительно важны для дифференцированных и постмитотических клеток, в том числе нейронам. Нарушения в механизмах аутофагии в нейронах приводят к неправильному формированию дендритного дерева, аксонов, изменению строения и состава шипиков, а также накоплению токсичных белковых конгломератов и поврежденных митохондрий, и их тесно связывают с прогрессированием ряда нейродегенеративных заболеваний [19, 52, 74, 84, 98]. Кроме того, все большее количество работ свидетельствуют о важной роли аутофагии в обеспечении синаптической пластичности [18, 90, 138]. Механизм аутофагии задействован в реакциях нейронов мозга на большое число воздействий, в том числе гипоксию, ишемию и голодание, и потому является важным объектом для исследований [26, 66, 98]. Целью настоящего обзора является обобщение основных свойств и принципов аутофагии и представление современных данных об их реализации в нервной системе.

АУТОФАГИЯ В ДЕГРАДАЦИОННОЙ СИСТЕМЕ КЛЕТКИ

Виды аутофагии

Клеточный гомеостаз зависит от равновесия между биосинтезом и катаболизмом макромолекул. В эукариотических клетках выделяют два основных процесса деградации белков: протеосомальная и лизосомальная [18, 30]. Протеосомальная система деградации в большей степени специфична для короткоживущих белков, в то время как многие мембранные белки, а также другие классы соединений и клеточные органеллы деградируют посредством лизосомальной системы [18]. Аутофагия является частью лизосомальной системы деградации и объединяет в себе функции изоляции и доставки внутриклеточного материала к лизосоме [102].

Функционально выделяют три основных типа аутофагии: шаперон-зависимая, микроаутофагия и макроаутофагия.

При шаперон-зависимой аутофагии таргетные белки доставляются к лизосоме белками-шаперонами (в частности Hsc70, Heat shock cognate 70), которые распознают на поверхности поврежденного белка специфическую последовательность KFERQ [11]. Данный мотив присутствует примерно у 30% всех белков клетки [39]. В нативном состоянии белка KFERQ-мотив может находиться внутри белковой глобулы. При диссоциации глобул или нарушении конформации белка, а также вследствие посттрансляционных модификаций белка данный мотив оказывается на поверхности и служит сигналом для распознавания шаперонами. Шапероны доставляют поврежденный белок к поверхности лизосомы, где специфические рецепторы-транспортеры (в частности LAMP2A, Lysosome-associated membrane protein type 2A), локализующиеся в мембране, переносят его внутрь органеллы [11, 33, 34].

При микроаутофагии происходит неспецифическое поглощение лизосомой небольших компонентов цитоплазмы за счет образования выпячиваний в самой мембране лизосомы.

При макроаутофагии происходит синтез отдельной двухмембранной структуры – фагосомы, внутрь которой изолируется поврежденный белок или целая клеточная органелла [128]. Аутофагосомы далее сливаются с лизосомами, образуя аутофаголизосому, внутри которой происходит деградация содержимого. Источником мембраны для аутофагосом служит прежде всего эндоплазматический ретикулум, а также комплекс Гольджи, митохондрии и плазматическая мембрана [125, 154, 157].

Регуляция и компоненты макроаутофагии

Процесс формирования аутофагосомы регулируется большим количеством белков и происходит под влиянием так называемых белков семейства Atg, которые впервые были описаны на дрожжах, но являются высоко консервативными у всех эукариот, включая млекопитающих [70, 107, 149, 155]. Белки этого семейства, образуя регуляторные и активационные комплексы, последовательно вовлекаются в формирование растущей аутофагосомы. Насчитывают шесть различных комплексов, формируемых при участии белков Atg, однако роль этих комплексов во многом не изучена [43, 103]. Инициация сборки аутофагосом начинается с дефосфорилирования киназы Ulk-1 (Unc-51-like autophagy activating kinase 1), в результате чего она активируется и формирует комплекс ULK-1 с белками Atg101, Atg13, FIP200 [43]. Комплекс ULK-1, в свою очередь, фосфорилирует белок Beclin1 [129]. Следующий комплекс, в который входят Beclin1, а также Atg14, VPS34/PI3KIII иVPS15/PIK3R4, является первичным звеном в начале сборки аутофагосомы [43, 65].

Фосфорилирование/дефосфорилирование Ulk-1 регулируется за счет комплекса mTORС1 (mammalian Target of rapamycin complex 1). mTORС1 фосфорилирует киназу Ulk-1, оказывая ингибиторное действие на нее и блокируя таким образом, начало сборки аутофагосом [65]. В свою очередь mTORС1, реагируя на уровень аминокислот в клетке [117], реципрокно регулирует уровень трансляции белков и уровень их деградации посредством аутофагии и потому является важнейшим регулятором метаболизма клеток в ответ на изменения окружающей среды [158]. Вместе с тем mTORС1 конвергирует на себе другие сигнальные пути в клетке, в том числе опосредованные нейротрофическими факторами [17, 158]. В частности, установлена возможность регуляции mTOR с помощью BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) [110, 115]. BDNF действует через семейство тирозин-киназных рецепторов TrkB (Tropomyosin-receptor-kinase B), которые активируют сигнальные пути, опосредованные MAPK, Akt/PI3K и PLC-g. В свою очередь, PI3K/Akt активирует mTOR и таким образом функционально связывает действие BDNF с аутфагией. Показано, что BDNF подавляет активность аутофагии за счет mTOR и генетическое ингибирование BDNF приводит к усилению аутофагии в мозге мышей [110].

Одним из важных и хорошо изученных белков семейства Atg является Atg8 или его гомолог у млекопитающих – LC3 (light chain protein). При формировании аутофагосомы к цитоплазматической форме белка LC3 (LC3-I) присоединяется молекула фосфотидилэтаноламина, в результате чего получается активная липидированная форма белка – LC3-II, которая может встраиваться в мембрану аутофагосомы. Большинство белков семейства Atg отсоединяются от сформированной аутофагосомы и возвращаются в цитоплазму. В отличие от них LC3-II остается связанным с мембраной аутофагосомы и потому является одним из наиболее часто используемых и известных маркеров макроаутофагии [101]. По паттерну окрашивания LC3 на гистологических препаратах можно судить о количестве аутофагосом, а по изменению соотношения LC3-I и LC3-II форм, выявляемых с помощью вестерн блоттинга, – об активности макроаутофагии. Известно, что LC3 является рецептором для распознавания и транслокации поврежденного белка внутрь аутофагосомы, а также он необходим для формирования и роста аутофагосомы [83]. В аутофагосому могут попадать как участки цитоплазмы с клеточными органеллами (неселективная аутофагия), так и клеточные органеллы, которые после повреждения приобретают специфический сигнал полиубиквитинирования на поверхности, который распознается белками-посредниками [32, 62]. Белки-посредники имеют два сайта связывания: один для сигнальной последовательности на поверхности поврежденного белка или органеллы, а другой – для рецептора на поверхности аутофагосомы (обычно это LC3-II) [62]. Таким образом они направляют поврежденную внутриклеточную структуру к аутофагосоме. Одним из наиболее хорошо изученных посредников является белок p62/SQSTM1 (sequestome 1), который имеет убиквитин-связывающий домен UBAN (ubiquitin binding in ABIN and NEMO) и LC3-связывающий домен LIR (LC3-interacting region). Белок p62 также часто используют для оценки процесса аутофагии.

В отличие от других механизмов внутриклеточной деградации, макроаутофагия представляет собой единственный известный внутриклеточный механизм, позволяющий приводить к деградации не только отдельные белки, но и крупные клеточные элементы. В частности, макроаутофагия была описана для белковых бляшек, митохондрий, пероксисом, эндоплазматического ретикулума, миелина [62].

Особенности аутофагии в нейронах

В покое, при отсутствии внешних воздействий, в клетках и тканях уровень активности аутофагии поддерживается на определенном постоянном базальном уровне и может значительно усиливаться при внешних воздействиях [100]. В нейронах в условиях покоя также постоянно образуются аутофагосомы, при этом они могут формироваться не только в соме нейрона, но и в дендритах и дистальных отделах аксона [21, 27, 81, 91–93, 147]. Биогенез и транспорт аутофагосом в дендритах и аксонах различается: в аксоне аутофагосомы формируются в пресинаптической области и далее ретроградно продвигаются к соме клетки, тогда как в дендритах аутофагосомы могут двигаться в обоих направлениях [81, 91, 92, 142, 147]. Эти различия подтверждаются наличием разной ориентации микротрубочек, располагающихся однополярно в аксонах и имеющих смешанную полярность в дендритах [68]. Считается, что ретроградный путь аксональной аутофагии обеспечивает прежде всего транспорт молекул из дистальных участков аксона в сому. В частности, недавно было показано, что путем аутофагии могут транспортироваться в сому активированные TrkB-рецепторы, и это во многом опосредует нейротрофическое действие BDNF [77]. Вместе с тем различия в биогенезе и направлениях движения аутофагосом между дендритами и аксонами могут свидетельствовать о некоторой специфике выполняемых этими отделами функций [93].

О ФУНКЦИЯХ АУТОФАГИИ

Гомеостатическая роль аутофагии, “контроль качества” и нейродегенеративные заболевания

Клеточный метаболизм состоит из постоянной рециркуляции и обновления клеточных элементов, что достигается за счет баланса между процессами синтеза новых элементов (анаболизма) и деградации ненужных или поврежденных элементов (катаболизма). Аутофагия является одной из основных деградационных систем клетки и во многом обеспечивает элиминацию поврежденных клеточных белков и органелл, что необходимо для поддержания нормального функционального состояния большинства постмитотических дифференцированных клеток, и выполняет гомеостатическую роль. Так, например, в большом количестве исследований показано, что блокирование или делеция ключевых генов аутофагии atg5 или atg7 в разных органах (печени, поджелудочной железе, почке, сердечной мышце, скелетной мускулатуре) приводит к схожим патологическим изменениям на молекулярном уровне, а именно к накоплению убиквитинированных р62-содержащих белковых образований и поврежденных органелл, прежде всего митохондрий и эндоцитоплазматического ретикулума [41, 54, 63, 73, 96, 106, 121]. На макроуровне наблюдается гипертрофия печени и сердца, с возрастом у животных развивается атрофия саркомеров и скелетной мускулатуры. При мозаичной делеции atg5 (делеция осуществляется только в некоторых популяциях клеток различных тканей) или с делецией atg7 в гепатоцитах увеличивается частота спонтанного образования опухоли в печени [60, 151]. В нервной системе при блокировании аутофагии наблюдаются схожие внутриклеточные нарушения. В частности, ингибирование генов atg5 или atg7 приводит к формированию белковых включений в пирамидных нейронах, клетках Пуркинье в коре мозжечка, в дофаминергических нейронах среднего мозга мышей [46, 52, 74], а блокирование atg7 во всем мозге приводит к накоплению альфа-синуклеина и LRRK2 в пресинаптической области [46]. У животных с дефектами аутофагии наблюдаются локомоторные неврологические нарушения [52, 74].

Нейроны являются высокодифференцированными клетками и остаются в постмитотическом состоянии на протяжении всей оставшейся жизни организма. Несмотря на то, что в головном мозге существуют зоны нейрогенеза, тем не менее, согласно текущим представлениям, полностью пул нейронов не обновляется в течение жизни организма. Большинство клеток организма, способных к делению, избавляются от накопленных токсинов во время клеточного деления. Поскольку нейроны лишены возможности избавиться от поврежденных клеточных элементов или токсинов путем деления, им необходимы дополнительные способы элиминации поврежденных белков и органелл [45, 144]. Кроме того, в силу особенностей строения, а именно наличия длинных отростков, нейронам необходимы дополнительные механизмы транспорта и циркуляции органелл внутри клетки [146]. Аутофагия во многом обеспечивает эти функции и потому считается исключительно важным механизмом для нормального функционирования нейронов. В моделях на животных показано, что нарушения аутофагии могут лежать в основе патогенеза многих форм нейродегенеративных заболеваний, включая рассеянный склероз, Болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона, поскольку вызывают схожие патологические изменения [19, 21, 30, 45, 71, 81, 84, 98, 144]. Действительно, при болезни Альцгеймера у человека post mortem выявлено накопление аутофагических вакуолей в нейронах, что свидетельствует о важной роли аутофагии в патогенезе заболевания или о возможной ее компенсаторной роли при прогрессировании заболевания [21, 111].

Патогенез нейродегенеративных заболеваний часто связан с токсическим эффектом белковых включений и поврежденных митохондрий, которые накапливаются в клетке в большом количестве. Агрегированные белки обычно устойчивы к расщеплению, они не могут подвергаться деградации в протеосоме и часто блокируют ее функцию [16, 29]. Поэтому возможность реализации деградации с помощью альтернативной системы, аутофагии, рассматривается многими авторами в качестве перспективного подхода для элиминации белковых бляшек и поврежденных органелл при нейродегенеративных заболеваниях [22, 29, 38]. Имеется достаточно много работ, свидетельствующих о положительном эффекте применения активаторов аутофагии в замедлении прогрессирования неврологических симптомов и в уменьшении числа белковых включений в моделях нейродегенеративных заболеваний на животных [44]. В частности, рапамицин (ингибитор mTOR) снижал количество полиглютаминовых последовательностей и гибель клеток в модели болезни Хантингтона in vitro и in vivo [124]. В моделях с дефектом белка Parkin и трансгенной оверэкспрессией тау-протеина на мышах применение трегалозы, mTOR-независимого активатора аутофагии, усиливало аутофагию, уменьшало аккумулирование тау-протеина и снижало гибель дофаминергических нейронов [126]. Рапамицин и трегалоза также уменьшали количество белковых бляшек и патологий в моделях рассеянного склероза и болезни Альцгеймера на животных [25, 111, 113]. Важную роль в данном процессе отводят также аутофагии поврежденных митохондрий – митофагии [82, 108, 164]. Вместе с тем прогрессирование нейродегенерации может быть связано со снижением уровня антиоксидантов и увеличением окислительного повреждения белков, ДНК и липидов [49, 82, 164]. Положительный эффект активации аутофагии при нейродегенеративных заболеваниях связывают также с некоторой степенью антиоксидантного эффекта [49, 126]. Показана важная роль аутофагии в поддержании нормальной функции митохондрий за счет регуляции количества промежуточных метаболитов цикла трикарбоновых кислот [51]. При ингибировании аутофагии в митохондриях нарушалось соотношение пирувата и ацетил-КоА с цитратом в пользу накопления пирувата [51]. Аутофагия также имеет большое значение в поддержании функций синапса за счет деградации поврежденных белков синаптических везикул, таких как синаптофизин [58]. Таким образом, механизм аутофагии обеспечивает элиминацию поврежденных макромолекул и органелл, токсичных белковых конгломератов, которые могут образовываться в небольшом количестве в ходе нормальной жизнедеятельности клетки и количество которых в разы увеличивается при некоторых патологиях. Поэтому эту функцию аутофагии часто называют “контролем качества”.

Адаптивная метаболическая и энергетическая роль аутофагии

Метаболическая роль аутофагии заключается в производстве прежде всего аминокислот, которые далее используются клеткой в качестве строительного материала для синтеза новых белков, обеспечивающих адаптацию метаболизма к условиям недостатка питательных веществ [112]. Основные принципы подобной перестройки и роли в ней аутофагии были впервые описаны в исследованиях на дрожжах. Было показано, что аутофагия способствует спорообразованию (споры – более энергетически экономная форма существования) у дрожжей при недостатке питательных веществ [155]. При блокировании гена atg5 дрожжи не могли образовывать споры и, соответственно, были менее жизнеспособными в новых условиях отсутствия питательных веществ [155]. При этом синтез отдельных типов белков не останавливался во время голодания или даже увеличивался. В частности, в клетках дрожжей дикого типа в условиях голодания происходил синтез лизосомальных ферментов, белков дыхательной цепи митохондрий, антиоксидантов, а также белков, участвующих в биосинтезе [112, 150]. Вместе с тем в клетках дрожжей с дефектом по atg7 в условиях голодания общий пул аминокислот значительно снижался по сравнению с клетками дикого типа, а уровень некоторых отдельных аминокислот был ниже критических значений [112]. Дрожжи, нокаутные по ключевым генам аутофагии, были не способны поддерживать необходимый уровень аминокислот и, соответственно, синтезировать вышеперечисленные белки в условиях голодания [112, 150]. В результате такие клетки утрачивали респираторную функцию и производили повышенное количество активных форм кислорода, что в итоге уменьшало содержание митохондриальной ДНК [150]. Suzuki с соавт. полагают, что это является основной причиной гибели клеток дрожжей с дефицитом аутофагии в условиях голодания. В другом исследовании показано, что аминокислоты могут быть конвертированы в промежуточные продукты цикла трикарбоновых кислот и таким образом способствовать выработке АТФ в условиях голодания [51]. Хотя подобные исследования выполнены на дрожжах и раковых клетках, тем не менее очевидно, что основной принцип действия аутофагии может быть универсальным и для других эукариотических клеток. Показано, что активация аутофагии происходит во многих тканях и органах, в том числе сердце, поджелудочной железе, почках, скелетных мышцах и печени, в ответ на голодание [100]. При этом каждой ткани и типу клеток присущи свои специфические функции, выполняемые аутофагией. Например, в клетках печени путем аутофагии могут подвергаться расщеплению жировые капли, что также может служить источником энергии и обеспечивать адаптивную реакцию организма в ответ на голодание [143].

Вопрос о том, вызывает ли голодание индукцию аутофагии в нейронах, является спорным. В одной из ранних работ Mizushima с соавт. показано in vivo, что активации аутофагии в мозге в ответ на голодание не происходит [100]. Согласно данной интерпретации, отсутствие индукции аутофагии в мозге может отражать защитные механизмы организма, направленные на поддержание постоянства энергоснабжения мозга питательными веществами за счет перераспределения их поступления из периферических органов и тканей, а также за счет наличия глиальных клеток как основных буферных зон, поддерживающих метаболизм нейронов, что позволяет скомпенсировать резкие перепады питательных веществ, возникающие при кратковременных эпизодах голодания. Однако следует отметить, что в данной работе авторы описывали аутофагию в мозге, не выделяя в нем отдельные структуры. Другие исследователи получили аналогичный результат на культуре нейронов гиппокампа [93]. Параллельно с этим имеется достаточно много работ, выполненных in vitro и in vivo, свидетельствующих о том, что аутофагия активируется в нейронах и разных структурах мозга при голодании [12, 21, 66, 163]. Более того, Nikoletopoulou с соавт. показали, что активность аутофагии в некоторых структурах мозга увеличивается, а в других – снижается, при голодании [110]. Таким образом, некоторая специфичность аутофагии присуща не только разным тканям и разным по происхождению типам клеток, но и нейронам разных структур или разным типам нейронов. Например, в одной из работ была установлена специфическая роль аутофагии в регуляции уровня агути-пептида [66]. Агути-пептид – нейропептид, который выделяется специфическими агути-ассоциированными нейронами гипоталамуса и участвует в регуляции поведенческих реакций, связанных с поиском пищи, а также началом или прекращением принятия пищи [132]. Kaushik с соавт. показали, что активация аутофагии, вызванная голоданием, приводила к мобилизации липидов в агути-ассоциированных нейронах гипоталамуса и выработке эндогенных свободных жирных кислот, которые, в свою очередь, регулируют уровни агути-пептида. Вместе с тем ингибирование аутофагии приводило к нарушению регуляции уровня агути-пептида в ответ на голодание, а также к устойчивому повышению уровня проопиомеланокортина в гипоталамусе и продукта его расщепления – α-меланоцитстимулирующего гормона, что способствовало формированию худого фенотипа [66]. Таким образом, авторы продемонстрировали, что активация аутофагии в гипоталамусе в ответ на голодание имеет большое значение в регуляции пищевого поведения в целом и оказывает долгосрочное воздействие на энергетический гомеостаз [66].

Несмотря на универсальность деградационного механизма, аутофагия, как следует из многих работ, имеет набор специфических функций в каждой ткани организма, а также в разных структурах и типах клеток в пределах одного органа – головного мозга. Поэтому более целесообразным представляется рассматривать функции этого процесса применительно к отдельным структурам мозга. Это позволит лучше понять специфику нейронов разных структур мозга, а также во многом объяснить их уникальные функции. В наших исследованиях было также показано, что аутофагия по-разному регулируется в нейронах гиппокампа и неокортекса в ответ на действие гипобарической гипоксии, что может во многом обуславливать специфику пирамидных нейронов и объяснять разную устойчивость этих структур мозга к тяжелому гипоксическому воздействию [28]. Несмотря на другую природу воздействия, гипоксия так же, как и голодание, на клеточном уровне приводит к энергетическому дефициту.

Аутофагия и синаптическая и нейрональная пластичность

Аутофагия – во многом избирательный процесс деградации, и, как было указано выше, имеет тканеспецифичность. То, какие именно белки или соединения подвергаются деградации, и составляет определенную специфичность функций аутофагии в разных клетках организма. Нейроны – высокоспециализированные клетки, основная особенность которых заключается в проведении нервных импульсов, их обработке, запоминании и хранении полученной информации. Последнее возможно за счет нейрональной пластичности, которая является следствием первичных изменений в синапсе. Регуляция синаптической пластичности является краеугольным камнем в раскрытии механизмов обучения и памяти. Связь между протеолизом, вызванным нейрональной активностью, и синаптической пластичностью и памятью была впервые описана в работах в модели на Aplysia [55]. Позже была также установлена роль эндосомально-лизосомальной системы деградации в реализации синаптической пластичности [42, 57], и еще позднее – вклад аутофагии в этот процесс [127, 135]. Таким образом, согласно современной концепции, аутофагия является важным функциональным звеном в обеспечении синаптической пластичности [18, 90, 136, 138].

Синаптическая пластичность может регулироваться преимущественно двумя основными способами: на пресинаптической мембране – за счет изменения выброса нейромедиаторов, и на постсинаптической мембране – за счет изменения количества и типа рецепторов к нейромедиатору. В нейронах аутофагосомы обнаруживаются, помимо сомы, в аксоне и дендритах [91–93], что, очевидно свидетельствует о том, что механизм аутофагии может участвовать в регуляции синаптической передачи как на пресинаптической, так и постсинаптической терминалях [87, 90].

В пресинаптичекой области аутофагия влияет на выброс нейромедиатора, структуру пресинапса и его функцию [56]. Было показано, что дофаминергические нейроны со специфическим нокаутом по atg7 выделяли большее количество дофамина при электрической стимуляции. При ультраструктурном исследовании было обнаружено, что аксоны таких нейронов увеличены в размерах, а также были отмечены изменения в количестве синаптических везикул [56]. В другом исследовании было установлено, что синаптическая активность индуцирует аутофагию в пресинаптических компартментах и активирует ретроградное перемещение аутофагосом по аксону, что также подтверждает роль аутофагии в регуляции синаптической передачи [156]. Soukup с соавт. установили, что высокочастотная стимуляция нервно-мышечного синапса дрозофилы индуцирует формирование аутофагосом внутри пресинаптической терминали и что аутофагия является критическим механизмом в регуляции выброса нейромедиатора за счет регуляции синаптических везикул [145]. Регуляция синаптических везикул также зависит от экзо-эндоцитоза Atg9-содержащих везикул внутри пресинапса [162]. Более подробное исследование, представляющее гипотетическую модель, описывающую, каким образом аутофагия может оказывать влияние на выброс медиатора, представлена в работе Kuijpers с соавт. [79]. Авторы показали, что нокаут по atg5 у мышей приводит к накоплению эндоплазматического ретикулума в аксоне и пресинаптической области и это сопровождается усилением нейротрансмиссии. Вместе с тем усиление возбуждающего сигнала является следствием увеличения выброса кальция из депо эндоплазматического ретикулума. Поскольку высвобожденный кальций непосредственно отвечает за слияние синаптических везикул с пресинаптической мембраной, то увеличение выброса кальция приводит к усилению объема выброса нейромедиатора. Авторы, таким образом, продемонстрировали, что аутофагия, за счет регуляции количества эндоплазматического ретикулума, оказывает влияние на выброс кальция и, следовательно, на силу синаптической передачи [79].

В постсинаптической области аутофагия может регулировать уровень синаптической передачи за счет избирательной деградации мембранных рецепторов. В частности, такой эффект был описан для АМПА (α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота) и ГАМК (гамма-аминомасляная кислота) рецепторов [127, 135]. Количество АМПА-рецепторов на постсинаптической мембране в большей степени определяет силу синаптической передачи: увеличение количества АМПА-рецепторов на постсинаптической мембране приводит к длительной потенциации, тогда как отщепление АМПА-рецепторов от мембраны приводит к длительной депрессии [57, 67, 140]. АМПА-рецепторы отщепляются от постсинаптической мембраны путем эндоцитоза и интернализируются в эндосомы, после чего они могут быть перенаправлены обратно к постсинаптической мембране либо транспортированы к лизосоме для последующей деградации [57, 67]. Это подтверждается рядом работ, в которых применение хлорохина, хлорида аммония и леупептина, которые считаются ингибиторами конечной лизосомальной фазы деградации, блокировало деградацию АМПА-рецепторов [42, 80]. Вместе с тем, Shehata с соавт. установили, что АМПА-рецепторы из эндосом доставляются в лизосомы посредством аутофагосом, а регуляция количества АМПА-рецепторов более сложная, чем предполагалось вначале [135]. Длительная низкочастотная стимуляция нейронов гиппокампа индуцировала аутофагию в дендритах постсинаптического нейрона [135]. Вместе с тем аутофагия опосредовала деградацию АМПА-рецепторов на постсинапсе и это обеспечивало эффект длительной депрессии [135]. Таким образом, в своем исследовании авторы Shehata с соавт. связали модулирующее действие аутофагии на количество АМПА-рецепторов на постсинаптической мембране, что в свою очередь определяет силу синаптического ответа [135]. Эти результаты были позднее подтверждены другой группой исследователей в моделях нокаутных животных по atg5 [64]. Схожий для АМПА-рецепторов эффект был также описан для ГАМК-рецепторов на нервно-мышечном препарате C. elegans: Rowland с соавт. показали, что при отсутствии ГАМК и ацетилхолина в синапсе на постсинаптической мембране происходит интернализация ГАМК-рецепторов в эндосомы и их трафик к аутофагосоме [127]. Кроме того, авторы сделали акцент на том, что аутофагия была избирательна в отношении ГАМК-рецепторов, но не ацетилхолиновых рецепторов.

Долговременные изменения синаптической пластичности лежат в основе нейрональной пластичности, которая зависит от структурных изменений синапсов, шипиков и дендритов. В ряде исследований, выполненных в разных моделях и структурах мозга, показано, что нарушения аутофагии приводят к постепенной дегенерации нервных волокон, проявляющейся изменением характера ветвления дендритов, формы аксонов, соотношения разных типов шипиков и размеров синапсов [46, 75, 110, 138, 147, 153, 159, 160]. Вместе с тем следует подчеркнуть, что важен определенный уровень активности аутофагии, поскольку как блокирование аутофагии, так и ее гиперактивация приводят к деструктивным процессам в нервных волокнах. В частности, ингибирование аутофагии (нокаутные исследования) приводит к уменьшению роста дендритов в длину и ветвления терминалей, а чрезмерная ее активация (оверэкспрессия генов аутофагии) – к резкому упрощению строения дендритного дерева в сенсорных нейронах in vivo [31]. Очевидно, механизм аутофагии необходим для обеспечения структурной реорганизации шипиков и отростков нейронов, что является физиологической основой нейрональной пластичности, лежащей в основе долговременной памяти. Действительно, показано, что содержание белков SHANK3, PSD-95 и PICK1, которые являются каркасными белками дендритных шипиков, существенно повышался в гиппокампе у нокаутных по atg5 мышей [110]. Кроме того, установлена важная взаимосвязь между нейротрофическим фактором BDNF, который, как известно, регулирует рост и формирование нервных волокон, и аутофагией. С одной стороны, было показано, что BDNF оказывает регулирующее влияние на активность аутофагии [110]. С другой стороны, аутофагия во многом опосредует нейротрофическое действие BDNF за счет транспорта активированных TrkB-рецепторов от дистальных концов аксона к соме нейрона [77]. BDNF оказывает нейротрофический эффект преимущественно за счет активации TrkB-рецепторов, что приводит к каскаду реакций, усиливающих экспрессию белков, участвующих в ремоделировании и росте отростков [115]. При этом активация TrkB-рецепторов приводит к продлению действия BDNF за счет активации экспрессии собственного гена bdnf, формируя обратную положительную связь [115]. Учитывая большую протяженность отростков нейронов, доставка активированных TrkB-рецепторов из дистальных отделов аксона к соме клетки считается важным механизмом для активации экспрессии BDNF-зависимых генов и реализации нейротрофического действия BDNF [166]. В связи с этим установленная Kononenko с соавт. роль аутофагии в транспорте TrkB-рецепторов имеет большое значение в опосредовании нейротрофического эффекта BDNF [77].

Роль аутофагии в синаптической пластичности во многом объясняет сущность и происхождение дегенеративных процессов, часто сопутствующих многим заболеваниям нервной системы, проявляющихся с возрастом. Патогенез многих нейродегенеративных заболеваний часто связывают с токсичным эффектом от накопления белковых конгломератов и поврежденных митохондрий в клетке. В связи с этим аутофагия рассматривается в качестве механизма элиминации поврежденных белков и с точки зрения функции “контроля качества”. Однако в одной из работ было показано, что даже если элиминировать белковые р62-содержащие бляшки (путем генетической абляции), то несмотря на то, что белковых включений становилось меньше, это не оказывало положительного эффекта на дегенеративные процессы в нейроне [76]. Таким образом, нарушения строения и роста нервных окончаний, а также сопутствующие неврологические симптомы, которые часто сопровождают нейродегенеративные заболевания, довольно сложно объяснить только токсическим эффектом от накопления поврежденных клеточных белков и органелл. Более вероятно, что наряду с этим, нарушается метаболизм белков, принимающих участие в обеспечении синаптической и нейрональной пластичности, что во многом может обуславливаться дефектами механизма аутофагии. В подтверждение этой точки зрения можно привести исследование, в котором авторы функционально связали нарушения процесса аутофагии в пресинапсе, опосредованные нарушением фосфорилирования белка эндофилина А, с развитием болезни Паркинсона [145]. Было показано, что фосфорилирование белка эндофилина А, который преимущественно известен своим участием в процессе эндоцитоза, индуцирует образование участков мембран, которые служат основой для присоединения факторов аутофагии, в том числе Atg3. Вместе с тем нарушение фосфорилирования эндофилина А ускоряет прогрессирование нейродегенерации. Поскольку эндофилин А имеет отношение к нескольким типам болезни Паркинсона, то, по мнению авторов, нарушения фосфорилирования эндофилина А и связанное с этим ингибирование аутофагии в пресинапсе могут быть одной из причин патогенеза болезни Паркинсона [145].

Участие аутофагии в обеспечении синаптической и нейрональной пластичности позволяет по-новому взглянуть на многие процессы, происходящие в нейроне, и вместе с тем открывает множество прикладных возможностей, в том числе в лечении и профилактике нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, поскольку изменения синаптической пластичности являются физиологической основой памяти, то возможно, что модуляторы аутофагии могут оказывать влияние на процессы обучения и память, что может иметь широкий спектр практического применения, в том числе при естественном старении, а также в ряде депрессивно-подобных состояний.

АУТОФАГИЯ И ПАМЯТЬ

Механизмы обучения и консолидации памяти неразрывно связаны со стойкими изменениями силы синаптической передачи и последующей структурной реорганизацией отростков и нервных окончаний, которая, прежде всего, подразумевает синтез новых белков, обеспечивающих эту реорганизацию [8, 10, 14, 97]. То, что процессы обучения, в том числе консолидация и реконсолидация, связаны с синтезом новых белков, давно установленный факт [8, 10, 14, 97]. Однако наряду с этим мало внимания уделялось другому механизму – механизму избирательной деградации белков, который, как показано в последние годы, играет не менее важную роль в данном процессе.

В ряде работ показано, что обучение животных в водном лабиринте Морриса и тесте обусловленной реакции страха приводит к усилению аутофагии (увеличению количества аутофагосом и активности аутофагии, усилению экспрессии генов atg и белковых продуктов) [50, 59, 114]. Все это свидетельствует о том, что активация аутофагии, наряду с механизмами синтеза белка, является необходимым процессом для консолидации памяти. В частности, в работе Hylin с соавт. было показано, что внутригиппокампальное введение ингибиторов аутофагии 3-метиладенина или спаутина-1 не оказывало влияния на обучение животных в тесте водного лабиринта Морриса, однако ухудшало долговременную память в этом тесте (через 24 ч) [59]. При этом следует отметить, что 3-метиладенин и спаутин-1 действуют более избирательно в отношении блокирования аутофагии, чем субстанции, действующие на mTOR. 3-метиладенин ингибирует активность PI3K-3, а спаутин-1 блокирует пептидазную активность USP10 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 10) и USP13 (Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 13), что приводит к убиквитинированию и деградации комплекса Beclin-1/PI3K-3 (см п. “виды аутофагии”) [88]. Комплекс Beclin-1/PI3K-3 находится под регуляцией mTOR и инициирует начало сборки аутофагосом. Таким образом, 3-метиладенин и спаутин-1 действуют “даунстрим” (downstream) от mTOR и более избирательно ингибируют именно сборку аутофагосом, не влияя при этом на регуляцию синтеза белка, как происходит в случае действия рапамицина на mTOR. Вместе с тем, внутригиппокампальное введение пептида ТАТ-Beclin-1, индуктора аутофагии, улучшало долговременную память в этом исследовании [59]. Авторы сделали вывод, что аутофагия не влияла на обучение (кратковременную память), но была необходима для формирования долговременной памяти [59]. В другом исследовании Glatingy с соавт. на мышах также было показано, что генетическое или фармакологическое ингибирование (спаутин-1, хлорохин) аутофагии ухудшало показатели молодых животных (3 месяца) в тестах распознавания нового объекта и обусловленной реакции страха (вызванной электростимуляцией) [50]. Применение инъекций пептида ТАТ-Beclin-1, напротив, улучшало показатели животных в этих тестах [50]. Вместе с тем ТАТ-Beclin-1 также усиливал аутофагию и улучшал показатели памяти в данных тестах у пожилых мышей (16 месяцев), у которых наблюдалось ухудшение памяти по сравнению с молодыми животными. Положительный эффект пептида ТАТ-Beclin-1, а также агониста аутофагии спермидина, на память животных показан в модели умеренного когнитивного расстройства на мышах [36]. В целом исследования свидетельствует о вовлечении аутофагии в механизмы долговременной памяти, а также о том, что усиление аутофагии в гиппокампе имеет положительный эффект в восстановлении памяти как при естественном старении, так и в моделях когнитивных расстройств [36, 50, 59, 94, 114].

В то же время есть данные о том, что активация аутофагии может опосредовать процесс стирания устойчивых воспоминаний в процессе реконсолидации памяти. Интересное исследование Shehata и соавт. показало, что индукция аутофагии усиливает дестабилизацию памяти и этот эффект опосредуется, во многом, деградацией АМПА-рецепторов на постсинаптической мембране [135, 137]. Эндоцитоз АМПА-рецепторов коррелирует с угасанием длительной потенциации и естественным активным забыванием устойчивых воспоминаний [40, 99]. Shehata с соавт. установили, что аутофагия способствует деградации АМПА-рецепторов на постсинаптической мембране, опосредуя, таким образом, механизмы длительной депрессии [135]. Далее, при реконсолидации в модели обусловленной реакции страха авторы показали, что индукция аутофагии в миндалевидном теле или в гиппокампе мышей усиливала дестабилизацию обусловленной памяти [137]. Практически возможность дестабилизировать устойчивые воспоминания имеет большое значение в лечении тревожных расстройств, таких как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) [118]. При реактивации (т.е. напоминании) ранее сформированных негативных воспоминаний их можно перевести в лабильное состояние, или дестабилизировать, после чего происходит либо перезаписывание и усиление этого же воспоминания, либо его замещение другим новым воспоминанием, или, иначе – реконсолидация. Процесс замещения старого воспоминания новым по сути является переобучением и связан с забыванием (угасанием) старого воспоминания и новым обучением, в процессе которого формируется новое воспоминание [120]. Процесс реконсолидации, так же как и консолидации, связан с синтезом белка de novo. Однако воспоминания, формируемые под влиянием высокого эмоционального фона, устойчивы к реконсолидации и их достаточно сложно дестабилизировать, что является существенной сложностью при лечении ПТСР [118]. В связи с этим для нарушения процесса реконсолидации памяти во многих исследованиях при моделировании ПТСР использовали рапамицин – ингибитор mTOR [15, 20, 47, 61, 85, 116, 148]. Однако в данных статьях авторы преимущественно делали акцент на том, что mTOR является “апстрим”-регулятором (upstream regulator) трансляции белка и при его блокировании нарушается синтез белков de novo, что в конечном счете и влияет на долговременную память. Но, как известно, mTOR является регулятором не только синтеза белка, но также и аутофагии, оказывая разнонаправленный эффект на эти два процесса [158]. Таким образом, эффект рапамицина в перечисленных исследованиях мог быть обусловлен также и возможным влиянием на механизм аутофагии. В этом плане Shehata с соавт. впервые применили новый интересный подход, позволяющий с помощью активации аутофагии вызвать дестабилизацию устойчивых к реконсолидации воспоминаний, что в целом может облегчить забывание или перезапись приобретенного устойчивого воспоминания в другом формате и делает механизм аутофагии потенциально возможной мишенью для клинических разработок в моделях лечения ПТСР [137].

АУТОФАГИЯ И ГИПОКСИЯ: АДАПТИВНАЯ ИЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

Говоря об аутофагии в нервной системе, помимо ее значимости в нейродегенеративных заболеваниях и процессах обучения и памяти, нельзя не затронуть направление исследований, связанных с ее вовлечением в патологический каскад реакций при ишемическом воздействии. Большое число работ установило роль аутофагии в гибели нейронов, индуцированной ишемией [9, 48, 72, 119, 123, 141]. При острой гипоксии может происходить гиперактивация аутофагии, которая ведет к чрезмерной вакуализации и неспецифической деградации клеточных элементов, вплоть до целой клетки [95]. Аутофагию рассматривают как один из типов клеточной гибели (каспаз-независимый), который, наряду с апоптозом и некрозом, индуцируется при ишемических воздействиях [86, 95, 122]. Между этими типами клеточной гибели существует тесная взаимосвязь [23, 95, 109]. Действительно, ингибирование аутофагии фармакологическим или генетическим путем приводило к снижению клеточной гибели в модели ишемии [48, 72, 119, 141]. При этом ингибитор аутофагии 3-метиладенин, применяемый в разные сроки после реперфузии (сразу в начале реперфузии, через 3 ч. и через 6 ч. после начала реперфузии) имел разную эффективность с точки зрения уменьшения очага поражения, что говорит о терапевтическом окне возможностей применения ингибиторов аутофагии в модели неонатальной ишемии [119]. Максимальная эффективность препарата достигалась при его введении через 3 ч. после начала реперфузии, когда наблюдалось уменьшение очага ишемического поражения на 46% [119]. С другой стороны, в аналогичной модели неонатальной ишемии другими авторами было показано, что рапамицин, активатор аутофагии, снижал некротическую гибель клеток и уменьшал повреждение головного мозга [24]. Авторы рассматривают усиление аутофагии рапамицином как потенциальный защитный механизм на ранней стадии повреждения головного мозга [24]. Кроме того, было показано, что оверэкспрессия транскрипционного фактора EB (transcription factor EB), который отвечает за регуляцию большого числа генов, вовлекаемых в процесс аутофагии и лизосомальной деградации, приводила к усилению активности аутофагии на поздних сроках после ишемического воздействия и уменьшению повреждения, вызванного ишемией, т.е. имела положительный эффект в нейропротекции при ишемии головного мозга [89]. Протективная роль аутофагии во время реперфузии может быть связана с элиминацией поврежденных митохондрий и ингибированием запуска цитохром С-индуцируемого апоптоза [165]. Каким образом регулируется аутофагия и в какой момент ее проадаптивная роль превращается в программу клеточной гибели для нейрона при ишемии, остается не до конца понятным. Возможно, что многое зависит от временного периода, в который реализуется эффект ингибирования, или активации аутофагии, поскольку ишемическое воздействие с последующей реперфузией имеет разные этапы развития патологии. Не исключено, что на начальных этапах ишемии аутофагия может стимулировать адаптивные функции клеток к условиям депривации кислорода и питательных веществ, тогда как при реперфузии оксидативный стресс и сильная воспалительная реакция запускают механизмы клеточной гибели в нейроне, опосредованные, в том числе, аутофагией. Помимо процесса аутофагии в самом нейроне, аутофагия в других клетках может также оказывать влияние на исход ишемического воздействия. Известно, что воспалительный процесс, наряду с клеточной гибелью, является одним из ведущих факторов в патологических последствиях ишемии мозга [133]. Вместе с тем аутофагия играет важную роль в воспалительных и иммунных реакциях [37] и может ограничивать воспалительную реакцию в модели ишемического инсульта за счет элиминации воспалительных вакуолей [105]. Кроме того, показано, что аутофагия поддерживает функциональную целостность гематоэнцефалического барьера в условиях гипоксии за счет регуляции белка клаудин-5 в эндотелиальных клетках [161]. Несмотря на то, что аутофагия может опосредовать гибель нейронов при ишемии, в исследованиях нет единого мнения о ее исключительно негативной роли при этом воздействии, и многие авторы упоминают об аутофагии как о “double-edged sword” (обоюдоострый меч) или “two sides of the same coin” (две стороны одной медали) [13, 26, 86, 122].

Одновременно с этим несомненной остается адаптивная функция аутофагии, направленная на поддержание внутриклеточного гомеостаза и обеспечение синаптической пластичности в нервной системе. В этом плане более интересным представляется исследование умеренных гипоксических воздействий на возможность мягкого модулирования клеточного метаболизма, в том числе за счет изменения активности аутофагии. Показано, что активация аутофагии во многом опосредует нейропротективное действие ишемического прекондиционирования в модели перманентной фокальной ишемии [139]. Известно, что умеренные гипоксические воздействия, используемые в качестве прекондиционирования, существенно повышают устойчивость как организма, так и ткани или клетки к действию последующего повреждающего стимула [3, 4, 5]. Эффект гипоксического кондиционирования связан с активацией эндогенных и неспецифических реакций организма и клеток к действию острого подпорогового стимула. Показано, что умеренные гипоксические воздействия повышают когнитивные способности, обладают анксиолитическим эффектом, повышают устойчивость нейронов к действию повреждающих стимулов [1, 2, 130]. На молекулярном уровне эффекты гипоксического прекондиционирования связаны с изменениями регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, повышением экспрессии нейротрофических и антиапоптотических факторов, антиоксидантов, снижением уровня свободных радикалов [6, 7, 130, 131, 134]. Вместе с тем аутофагия – механизм, обеспечивающий внутриклеточный гомеостаз, транспорт, синаптическую пластичность и имеющий достаточно широкий спектр функций во внутриклеточных процессах – может опосредовать адаптивные реакции нейронов при умеренных гипоксических воздействиях и служить связующим процессом во множественных положительных эффектах гипоксического кондиционирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в данном обзоре механизм аутофагии представлен с точки зрения гомеостатической и адаптивной функции. Аутофагия за счет деградации клеточных элементов (белков, липидов, углеводов, клеточных органелл) поставляет клетке строительные элементы в виде мономеров, необходимые для синтеза новых клеточных компонентов. Все это служит поддержанию клеточного метаболизма, что является гомеостатической функцией, а также необходимо для реорганизации клеточных функций при изменении окружающей среды, различного рода воздействиях и других процессах, таких как дифференциация, что обеспечивает адаптивную реакцию клетки и организма.

Несмотря на то, что аутофагия является универсальным системным механизмом, тем не менее в каждой ткани и типе клеток, помимо общих, достигаются определенные специфичные функции. Для нервной системы, как было описано в данном обзоре, – это прежде всего обеспечение синаптической и нейрональной пластичности. Участие аутофагии в механизмах синаптической пластичности открывает новые горизонты в исследованиях процессов памяти, а также перспективные подходы в возможностях модулирования памяти при различных патологических состояниях или естественном старении.

Аутофагия – сложно организованный механизм, в который вовлекается большое количество белков. Поэтому нарушения этого механизма в клетке имеют плейотропное действие и проявляются во множественных нарушениях клеточного метаболизма, которые могут быть как общими для большинства постмитотических клеток, так и специфичными для отдельных типов клеток. Так, например, при нейродегенеративных заболеваниях часто наблюдается накопление токсичных белковых конгломератов, поврежденных митохондрий и других клеточных органелл, а также нарушения структуры отростков, шипиков и синапсов нейронов, что, очевидно, свидетельствует о нарушениях синаптической пластичности и приводит к неврологическим дефицитам. Модуляторы аутофагии рассматриваются в качестве перспективной стратегии в коррекции патологических изменений и уже показали эффективность при некоторых формах дегенеративных заболеваний в моделях на животных. Одной из основных проблем является поиск более специфичных модуляторов аутофагии (ввиду многокомпонентности этого процесса), а также разработка универсальных маркеров активности аутофагии, которые позволили бы использовать их для оценки уровня аутофагии у человека при различных заболеваниях, поскольку модели на животных лишь отчасти могут воспроизвести нейродегенеративные патологии у человека. Вместе с тем, помимо фармакологических препаратов, существуют немедикаментозные методики, такие как умеренное гипоксическое воздействие, которые могут быть не менее эффективными в профилактике и лечении.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке Госпрограммы ГП-47 “Научно-технологическое развитие Российской Федерации” (2019–2030), тема 0134-2019-0002.

________________

Сокращения: ПТСР – посттравматическое стрессовое расстройство; АМПА – α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота; ГАМК - гамма-аминомасляная кислота.

Об авторах

А. В. Чурилова

Автор, ответственный за переписку.
Email: churilovaav@infran.ru
Россия, 199034, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы