ОДНОВРЕМЕННЫЙ МОНИТОРИНГ ЦИТОЗОЛЬНОГО И РЕТИКУЛЯРНОГО Са2+ УКАЗЫВАЕТ НА НЕОДНОРОДНОСТЬ Са2+-ДЕПО

Трансдукция многих агонистов включает мобилизацию внутриклеточного Са²⁺. Динамика и форма внутриклеточных Са²⁺-сигналов детерминируются Са²⁺-потоками через плазмалемму и мембраны внутриклеточных органелл, прежде всего, эндоплазматического ретикулума (ЭР). Хотя традиционно механизмы внутриклеточной Са²⁺-сигнализации исследовались с использованием химических флуоресцентных Са²⁺-зондов, появление генетически кодируемых Са²⁺-сенсоров с различной внутриклеточной локализацией существенно расширило инструментальные возможности. В настоящей работе в клетках НЕК-293 проводился синхронный мониторинг цитозольного Са²⁺ с использованием Fluo-8 и ретикулярного Са²⁺ с помощью генетически кодируемого Са²⁺-сенсора R-CEPIA1er с локализацией в ЭР. При импульсной стимуляции клеток ацетилхолином (ACh) наблюдались скоординированные рост цитозольного Са²⁺ и падение Са²⁺ в ЭР на передней фазе Са²⁺-ответа, релаксация которых часто сопровождалась наложенными колебаниями. Большую детализацию скоррелированного поведения концентрации цитозольного Са²⁺ (С) и ретикулярного Ca²⁺ (C_s) могло дать представление клеточных ответов на фазовой плоскости (C_s, C). Поскольку C_s и C не измеряются непосредственно, а измеряются Ca²⁺-зависимые интенсивности флуоресценции Са²⁺-зондов, экспериментальные данные представлялись в плоскости (F_s, F_c), где F_s и F_с равны ΔF/F₀ для R-CEPIA1er и Fluo-8 соответственно, что эквивалентно представлению в плоскости (C_s, C). Фазовые траектории свидетельствовали о том, что Са²⁺-ответы на ACh не могли быть сгенерированы исключительно за счет обмена Са²⁺ между гомогенным Cа²⁺-депо и цитозолем, поскольку в ~30% случаев фазовая траектория содержала петлю с участком одновременного роста C_s и C. Петля наблюдалась и при подавлении входа Са²⁺, что указывало на участие внутриклеточного источника Са²⁺, недоступного для мониторинга с помощью R-CEPIA1er или не вносящего существенного вклада в его флуоресценцию. Ингибиторный анализ показал, что этим источником не являются кислые эндосомы и лизосомы, содержащие двупоровые каналы, аппарат Гольджи и везикулы, куда Са²⁺ загружается ATP-азой SPCA-типа, органеллы, высвобождающие Са²⁺ через рианодиновые рецепторы, и митохондрии, из матрикса которых Са²⁺ выбрасывается в цитозоль Na⁺/Ca²⁺-обменником. Полученные результаты в целом указывают на более сложную систему генерации агонист-индуцированных Са²⁺-сигналов, чем в парадигме с одним гомогенным пулом запасенного Са²⁺.

внутриклеточная Са²⁺-сигнализация, Fluo-8, генетически кодируемый Cа²⁺-сенсор R-CEPIA1er, фазовая плоскость