Opsins and their testing in heterological expression systems

Capa

Citar

Texto integral

Resumo

The study of photosensitive proteins as optogenetic tools for the therapeutic restoration of visual functions in heterologous expression systems is a necessary step prior to their optogenetic prosthetization in the retina. The review considers the features of opsins and factors affecting their activity in model cell systems. Particular attention is paid to G-protein-coupled opsins as promising tools for recreating the signaling cascade mechanisms of in retinal ON-bipolar cells. Based on the analysis of light-controlled responses of natural and chemical light-sensitive proteins in tests, the selection of the best, promising in gene therapy is made.

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Электромагнитное излучение в диапазоне от 380 до 780 нм является важнейшим физическим стимулом, воздействующим на физиологические и биохимические процессы во всех живых системах. Светочувствительные белки способны поглощать кванты света, вызывая в клетке фотобиологические ответы. Обнаружено, что в результате экспрессии генов светочувствительных белков в неспециализированных к восприятию света клетках при световой стимуляции возникают ионные токи.

Одна из первых гетерологических систем создана на основе экспрессии гена бактериородопсина в ооцитах лягушки Xenopus laevis, где в ответ на свет наблюдали токи через светоуправляемую протонную помпу (Nagel et al., 1995). Позднее из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii были выделены светочувствительные белки, названные канальными родопсинами или каналородопсинами: каналородопсин 1 (ChR1) и каналородопсин 2 (ChR2). ChR1 представляет собой избирательно проницаемый для протонов светоуправляемый ионный канал (Nagel et al., 2002, 2003), ChR2 — катион-проводящий канал. Гены каналородопсинов успешно экспрессированы в ооцитах Xenopus laevis и в клетках млекопитающих, при стимуляции клеток синим светом в них наблюдали фототоки (Nagel et al., 2002, 2003). Вызываемые световой стимуляцией токи отличались быстрой кинетикой активации и временным разрешением в несколько миллисекунд (Boyden et al., 2005; Deisseroth et al., 2006).

Возможность с помощью света управлять проводимостью ионных каналов, регулировать физиологическую активность нервных клеток и целых нейрональных ансамблей и даже контролировать поведение животных открыла новое оптогенетическое направление (Boyden et al., 2005; Covington et al., 2010; Deisseroth, 2011, 2015; Tye, Deisseroth, 2012; Levitz et al., 2013; Kim et al., 2017; Rost et al., 2017). Одна из важнейших задач оптогенетики — исследование светочувствительных белков как инструментов для восстановления зрительных функций при тяжелых формах наследственных дегенеративных заболеваний, в частности при пигментном ретините, вызывающем дистрофию сетчатки. Пигментный ретинит — это прогрессирующее наследственное заболевание, обусловленное мутациями, возникающими более чем в семидесяти различных генах (Bird, 1988; Wert et al., 2014; Sahel et al., 2021; Wu et al., 2023). При развитии заболевания на фоне продолжающейся гибели фоторецепторных клеток, биполярные, ганглиозные и амакриновые клетки продолжают нормально функционировать, придание этим клеткам восприимчивости к свету (светочувствительности) за счет внедрения генов светочувствительных белков (оптопротезирования) дает надежду на восстановление зрительных функций благодаря активации новых путей передачи информации в сетчатке (Кирпичников, Островский, 2019; Baker, Flanery, 2018; Berry et al., 2019; Firsov, 2019). В экспериментах на модельных животных (мыши линии rd1) с наследственной дегенерацией сетчатки продемонстрировано, что экспрессия экзогенных светочувствительных белков способствовала частичному восстановлению зрения у слепых мышей (Berry et al., 2019; Ganjawala et al., 2019; Kralik et al., 2022). В настоящее время в некоторых странах разрешены и клинические испытания с использованием оптогенетических методик. Однако пока известен один успешный пример генной терапии у человека с пигментным ретинитом (Sahel et al., 2021). В данной работе для оптогенетического протезирования ганглиозных клеток сетчатки использовали каналородопсин Chrimson R. У пациента наблюдали улучшение зрения только при совместном использовании генной терапии и специальных светостимулирующих очков, появилась способность распознавать и считать видимые предметы (Sahel et al., 2021).

В результате накопленных экспериментальных данных по оптогенетическому протезированию слепой сетчатки светочувствительными белками для восстановления утраченных зрительных функций возникли задачи, связанные с изменением свойств белков и их химерных конструкций. Это повышение светочувствительности и расширение спектров поглощения белков; снижение фототоксичности, возникающей при увеличении интенсивности светового потока; воссоздание системы сигнальных путей, приближенной к здоровой клетке; повышение экспрессии генов экзогенных белков в клетке. Для этого исследуют функциональные особенности тестируемых белков, их чувствительность, проводимость, время активации/инактивации ионного канала. В случае активации внутриклеточных сигнальных путей, опосредованных G-белками, изучают специфичность взаимодействия внутриклеточного домена светочувствительного белка с определенным G-белком.

Для исследования этих вопросов и отбора подходящих кандидатов из числа натуральных и химерных светочувствительных белков применяют тестирование в гетерологических экспрессионных системах (Карпушев, Чилигина, 2023; Ballister et al., 2018; Kralik et al., 2022; Leemann, Kleinlogel, 2023).

Цель настоящего обзора — показать особенности опсинов, их сигнальных путей и светоуправляемых сигнальных ответов в гетерологических экспрессионных системах.

СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ БЕЛКИ

В ходе эволюции во всех царствах живых организмов появлялись светочувствительные молекулы, отличающиеся по строению, функциям, биохимическим свойствам: опсины, фитохромы, бактериофитохромы, криптохромы, ксантопсины, ультрафиолетовые фоторецепторы UVR8 растений (Колесов и др., 2021; Riggsbee, Deiters, 2010; Rost et al., 2017). Особый интерес для оптогенетического протезирования представляют опсины — фоточувствительные белки, содержащие хромофорную группу или ретиналь, который ковалентно связан с остатком лизина через протонированное Шиффово основание. При поглощении кванта света происходит изомеризация хромофора и переход в высокоэнергетическое состояние, при этом белок меняет свою конформацию и активируется. Опсины принято делить на опсины 1-го и 2-го типа.

ОПСИНЫ 1-ГО ТИПА

Опсины 1-го типа характерны для архей, прокариот, водорослей, грибов и представляют собой катионные помпы, транспортеры. К ним относятся канальные родопсины 1 и 2 (проводящие ионы Na+, H+, K+ и Ca2+ через мембрану), бактериородопсины (протонная помпа) и галородопсины (хлорная помпа). Их отличительная черта — быстрая активация/инактивация. При поглощении света транс-ретиналь переходит в 13-цис-ретиналь, в результате меняется транспорт ионов через мембрану (Rost et al., 2017), так регулируются фототаксис или бактериальный фотосинтез. После изомеризации у опсинов 1-го типа хромофор остается связанным с белком. Обратная изомеризация происходит самопроизвольно под действием тепловых колебаний молекулы. Свойства опсинов 1-го типа под действием света деполяризовать или гиперполяризовать плазматическую мембрану используют для регулирования физиологической активности клетки. При фотоактивации галородопсинов зеленым, а бактериородопсинов желтым светом возникает гиперполяризация мембраны клетки, при поглощении каналородопсинами синего света — деполяризация. Каналородопин 2 стал одним из первых деполяризующих оптогенетических инструментов, на основе которого создан ряд модифицированных белков (Lin et al., 2011). Выделены и другие каналородопсины, например Chronos из Stigeoclonium helveticum, управляемый синим и зеленым светом, с улучшенной кинетикой и с высокой светочувствительностью и Chrimson (из Chlamydomonas noctigama) со спектром поглощения, смещенным в красную сторону (600 нм). Попытки изменить некоторые характеристики белков привели к созданию химерных конструкций. Например, C1V1 создан на основе ChR1 и VChR1 (опсин из Volvox carteri), обладает максимумом поглощения на 570 нм и более высоким током через канал (Lin et al., 2009); химеры ChEF и ChIEF (ChR1/ChR2) также демонстрируют больший канальный ток и лучше экспрессируются в клетках млекопитающих (Lin et al., 2011); модифицированный каналородопсин ex3mV1Co характеризуется бо́льшими токами и максимумом поглощения 505 нм (Watanabe et al., 2021); химеры ChR1/VChR1 отличаются хорошей экспрессией в плазматической мембране и повышенным фототоком в клетках HEK (Yizhar et al., 2011).

Эктопическая экспрессия генов микробных канальных родопсинов (ChR2) и их химерных конструкций (CoChR-L112C и CoChR-H94E/L112C/K264T0) в выживших нейронах сетчатки (биполярные и ганглиозные клетки-мишени) слепых животных вызвала частичное восстановление зрения (Bi et al., 2006; Lagali et al., 2008; Doroudchi et al., 2011; Ganjawala et al., 2019). Химерный белок mVChR1, созданный на основе каналородопсина1 Volvox (VChR1) и Chlamydomonas, при эктопической экспрессии в гетерологических системах показал в ответ на фотостимуляцию (450 нм) бо`льшие канальные токи (626.3 ± 89.0 pA), по сравнению с VChR1 (18.4 ± 2.3 pA). При селективной экспрессии данного белка в ганглиозных клетках сетчатки крыс с пигментной дистрофией наблюдали улучшение зрения, животные реагировали на синие, зеленые, желтые и красные световые полосы, проецируемые на экран (Tomita et al., 2014). В качестве гиперполяризующих оптогенетических инструментов генной терапии можно назвать анионный канал с улучшенной световой чувствительностью и кинетикой (Долгих и др., 2015) или анион-переносящий канальный родопсин из криптофитовой одноклеточной водоросли Guillardia theta, последний характеризуется большим фототоком и большой гиперполяризацией клетки (Govorunova et al., 2015). Гиперполяризующие анионные и протонные помпы имеют особое значение для создания OFF-путей и регулирования рецептивных полей ганглиозных клеток в дегенеративной сетчатке.

В здоровой сетчатке человека существует три типа ганглиозных клеток (ON-типа, OFF-типа и ON-OFF-типа). Ганглиозная клетка ON-типа получает информацию от центральных фоторецепторов и биполярных клеток, при освещении центра рецептивного поля происходит ее деполяризация, а при действии светового раздражителя на периферии — гиперполяризация. Ганглиозные клетки OFF-типа возбуждаются при освещении периферии рецептивного поля и тормозятся при раздражении центра рецептивного поля, информация к ним приходит от фоторецепторов, расположенных на периферии. Рецептивные поля ганглиозных клеток этих двух типов слабо отвечают на равномерное освещение, но обеспечивают передачу информации о контрастных по свету стимулах, что обеспечивает восприятие границы объекта. Кроме того, у млекопитающих есть ганглиозные клетки ON-OFF-типа, они дают короткий ON-ответ на стационарный световой стимул и кратковременную OFF-реакцию на ослабление света. Одновременное применение катион- и анион-переносящих каналородопсинов дает перспективу создания ON-OFF- и OFF-ON-рецептивных полей ганглиозных клеток, что крайне важно для восстановления качественного зрительного восприятия. Недавно создан такой бицистронный продукт на основе катионного и анионного каналородопсинов (Петровская и др., 2019).

В целом опсины 1-го типа как оптогенетические инструменты характеризуются высокой эффективностью экспрессии в клетках млекопитающих, быстрой активацией/инактивацией, достаточным временным и пространственным разрешением, но использование каналородопсинов связано с применением высокоинтенсивного коротковолнового света, а это создает риск фототоксичности. Кроме того, микробные опсины обладают низкой чувствительностью — один квант света открывает только один канал. В этой связи представляют интерес опсины 2-го типа, которые являются G-белок-связывающими рецепторами, обеспечивающими фоторецепцию и регуляцию циркадных ритмов, и характеризуются сигнальными каскадными механизмами, позволяющими усиливать исходный световой сигнал.

ОПСИНЫ 2-ГО ТИПА И ИХ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ

Опсины 2-го типа относятся к семейству рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCRs) класса А (родопсиноподобные рецепторы). Обладая консервативной структурой, семью трансмембранными альфа-спиральными сегментами с чередующимися вне- и внутриклеточными петлями, внутриклеточным С-концом, они отличаются в основном внеклеточным N-концевым доменом (Stenkamp et al., 2002; Rosenbaum et al., 2009; Mathes, 2016). В результате фотоактивации опсинов в клетке запускаются сигнальные пути, опосредованные различными семействами гетеротримерных G-белков. Избирательное связывание GPCRs с α-субъединицей G-белка (Gα) имеет решающее значение для точной передачи сигнала (Flock et al., 2017). На основании структурного сходства субъединицы Gα делят на 4 семейства: Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13, каждое из которых реализует специфический сигнальный путь в клетке (Neves et al., 2002; Milligan, Kostenis, 2006; Kleinlogel, 2016). Существует специфичность взаимодействия опсина с определенным G-белком. Для зрительных опсинов позвоночных (родопсин и колбочковые опсины) это трансдуцин Gt, который относится к Gi-семейству. Активированный трансдуцин стимулирует фосфодиэстеразы, гидролизующие молекулы цГМФ. Все незрительные опсины, к ним относится меланопсин, имеют сродство к Gq (активирует фосфолипазу C) (Kleinlogel, 2016). Энцефалопсины, опсины костных тканей (TMT-опсины) и опсины моллюсков взаимодействуют с Go, а нейропсины человека и пер-опсин активируют Gi, эти белки ингибируют аденилатциклазу (Kato et al., 2016; Nagata et al., 2018). Нейропсины книдарий связываются с Gs, что приводит к активации аденилатциклазы (Terakita, 2005; Guido et al., 2022). Опсинам 2-го типа свойственна каскадная сигнализация, опосредованная G-белками с участием циклических нуклеотидов. Функционально можно выделить два пути сигнальной трансдукции: с участием циклических нуклеотидов и фосфоинозитольный путь. Первый характерен для рецепторов цилиарного типа, например каскад фототрансдукции в фоторецепторе (через Gt) с участием фосфодиэстеразы и цГМФ — для энцефалопсина и TMT-опсина (через Gi, Go), а также передача через Go — в клетках морского гребешка или через Gs — у книдарий. Для незрительных опсинов позвоночных (меланопсин) и зрительных опсинов моллюсков и артропод характерен фосфоинозитольный путь, опосредованный Gq (Terakita, 2005; Koyanagi, Terakita, 2014). Все опсины ковалентно связаны с хромофором: зрительные, незрительные, а также Gq- и Go-опсины — с 11-цис-ретиналем (альдегид витамина А), а перопсин и ретинальные фотоизомеразные опсины — с транс-ретиналем. Наиболее хорошо изучен сигнальный каскад фототрансдукции в палочках, обеспечивающих сумеречное зрение, и колбочках, ответственных за фотопическое зрение у позвоночных.

Фототрансдукция в палочке позвоночных

При поглощении фотона хромофор родопсина изомеризуется из 11-цис- в транс-форму, что индуцирует перевод пигмента в физиологически активное состояние — в форму метародопсина II (рис. 1а).

 

Рис. 1. Схема каскада фототрансдукции в палочке.

(а) активация рецептора на свету. В результате поглощения фотона возникает активация рецептора и передача сигнала от активированного рецептора (родопсина) к трансдуцину, в результате каскада реакций происходит закрытие неселективных катионных цГМФ-зависимых каналов. (б) деактивация рецептора. Возвращение родопсина в темновое состояние в результате последовательных взаимодействий: рековерин–родопсинкиназа, родопсинкиназа–активированный рецептор, аррестин–фосфорилированный метародопсин, блокирование рецептора. (в) выключение фосфодиэстеразы. Белок RGS9-1 связывается с комплексом Gt*—ФДЭ-6, в результате происходит диссоциация комплекса. R — родопсин, R* — активированный родопсин, Gt — трансдуцин, Gt* — активированный трансдуцин, ГДФ — гуанозиндифосфат, ГТФ — гуанозинтрифосфат, ФДЭ-6 — фосфодиэстераза-6, цГМФ — циклический гуанозинмонофосфат, ГМФ — гуанозинмонофосфат, ГЦ — гуанилатциклаза, рек — рековерин, РК — родопсинкиназа, Ар — аррестин, R*-Ф — фосфорилированный метародопсин.

 

После изомеризации хромофор отделяется от белковой части. Конформационные перестройки необходимы для передачи сигнала от родопсина к трансдуцину. Транс-ретиналь опсина инициирует смещение внутримембранных альфа-спиральных сегментов и разрушение цитоплазматического ионного замка Шиффова основания, что приводит к образованию щели, в которую входит С-конец α-субъединицы трансдуцина, таким образом активируя G-белок (Островский, 2020; Hofmann, Lamb, 2022). В результате такого взаимодействия происходит высвобождение связанного ГДФ в обмен на ГТФ, и α-субъединица трансдуцина диссоциирует от комплекса β-γ-субъединиц. Комплекс α-субъединицы трансдуцина (Gtα) и ГТФ активирует фосфодиэстеразу (ФДЭ) и стимулирует ее активность. ФДЭ гидролизует цГМФ, образуя ГМФ. Внутриклеточная концентрация цГМФ снижается, что в конечном итоге приводит к закрытию неселективных катионных цГМФ-зависимых каналов в наружном сегменте фоторецепторов, возникает гиперполяризация клеточной мембраны палочки, что и является началом фотоответа (Pugh, Lamb, 2000; Terakita, 2005; Arshavsky, Burns, 2014) (рис. 1а). Одна фотоактивная молекула пигмента активирует несколько G-белков, это и представляет собой первую стадию амплификации (усиление сигнала) в каскаде фототрансдукции, что приводит к открытию нескольких тысяч каналов. После генерации ответа фоторецептор возвращается в исходное темновое состояние, в котором цГМФ-зависимые каналы открыты. Регуляция происходит по принципу обратной связи. Закрытие цГМФ-зависимых каналов прекращает вход ионов натрия и кальция в клетку, при этом ток кальция из цитоплазмы продолжается, что приводит к снижению концентрации кальция в цитоплазме, в ответ активируются кальцийзависимые гуанилатциклазы, увеличивается концентрация цГМФ, каналы открываются. Снижение внутриклеточного кальция влияет и на другие кальций-связывающие белки-посредники (рековерин, GCAP, кальмодулин). В частности, рековерин меняет чувствительность родопсинкиназы к кальцию, происходит активное фосфорилирование метародопсина II, это подготавливает активированный рецептор (R*) к связыванию с аррестином, последний блокирует каталитические центры рецептора (Arshavsky, Burns, 2014; Lamb, 2022) (рис. 1б). Безусловно, снижение уровня кальция играет значительную роль в возвращении фоторецептора в темновое состояние, но существуют и другие механизмы регуляции. Например, выключение активных форм фосфодиэстераз путем ускорения ГТФ-азной активности. Ключевым фактором будет белок RGS9-1, который связывается с активированным комплексом (Gt*—ФДЭ-6), в результате происходит диссоциация Gtα—ГДФ и ФДЭ-6 (рис. 1в). Высокая чувствительность к свету делает родопсин хорошим кандидатом для оптопротезирования, тем не менее, для повторной активации родопсину необходима регенерация и наличие специализированных для фоторецепторных клеток ферментных систем и транспортеров, что нужно учитывать в искусственных гетерологических системах.

Вторым нейроном, получающим сигнал от фоторецепторов, является биполярная клетка, поэтому при гибели фоторецепторов слой биполярных клеток может быть использован для экспрессии генов светочувствительных белков, таким образом превращая их в псевдорецепторы. В первом синапсе зрительной системы от фоторецептора к биполярной клетке происходит разделение на ON- и OFF-пути, которые кодируют увеличение и уменьшение интенсивности света соответственно. Такое разделение поддерживается и в высших зрительных центрах. Наиболее изучен сигнальный каскад в ON-биполярных клетках. Это сложный механизм, опосредованный G-белком, позволяющий регулировать чувствительность в темноте и в то же время передавать сигналы при ярком освещении с высоким временным разрешением. В темноте фоторецепторами в синаптическую щель непрерывно высвобождается глутамат, на свету выход глутамата значительно снижается. Глутамат связывается с метаботропным рецептором (mGluR6) ON-биполярных клеток, что приводит к активации сигнального пути через Go. Активация α-субъединицы G-белка происходит путем связывания с ГТФ, комплекс Gαo—ГТФ взаимодействует с C-концом TRPM1, а комплекс субъединиц GβGγ с N-концом TRPM1, что приводит к конформационным изменениям, в результате которых канал TRPM1 закрывается. При воздействии света возникает гиперполяризация фоторецептора, количество глутамата в синаптической щели уменьшается, происходит деактивация mGluR6, большая часть белка Go находится в неактивной форме, где Gαo —ГДФ связан с GβGγ и канал TRPM1 открывается (рис. 2) (Xu еt al., 2016).

 

Рис. 2. Схема активации TRPM1-канала в ON-биполярных клетках.

Обозначения: Glu — глутамат, mGluR6 — метаботропный рецептор mGluR6 ON-биполярных клеток, TRPM1 – канал переходного рецепторного потенциала подсемейства M, ГДФ — гуанозиндифосфат, ГТФ — гуанозинтрифосфат, NT — N-конец, CT — С-конец.

 

Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) широко распространены в сетчатке и играют значительную роль в передаче сигнала от фоторецепторов. Различные типы mGluRs (от mGluR1 до mGluR8) обнаружены не только в биполярных клетках, но и горизонтальных, амакриновых, ганглиозных и даже фоторецепторных клетках различных представителей царства животных (Dhingra, Vardi, 2012). Все mGluRs модулируют ионные токи опосредованно через G-белки, в большинстве через Gq. Таким образом, внутриклеточный домен метаботропного глутаматного рецептора способен селективно связываться с G-белками, активируя каскадный механизм передачи сигнала, что используют при создании химерных конструкций.

Еще один кандидат для оптопротезирования — незрительный пигмент меланопсин позвоночных, который синтезируется в субпопуляции внутренних ганглиозных клеток сетчатки. Филогенетически меланопсин близок к рабдомерным опсинам беспозвоночных (R-опсинам), после выцветания или отбеливания способен к восстановлению. В результате фотостимуляции синим светом меланопсин переходит в транс-форму — метамеланопсин, но в отличие от метародопсина сохраняет свой хромофор и регенерирует в 11-цис-форму. Благодаря способности конвертировать хромофор между 11-цис- и транс-формой и возвращаться в темновое состояние после поглощения кванта света меланопсин называют бистабильным пигментом. В клетках млекопитающих меланопсин регулирует различные процессы (синхронизация циркадных ритмов со светом: регуляция размера зрачка, модуляция сна, подавление мелатонина шишковидной железой), активируется синим, деактивируется желтым светом. Меланопсин и другие рабдомерные опсины артропод и моллюсков активируют в клетках Gαq/11-сигнализацию (Terakita, 2005; Bailes, Lucas, 2013). В гетерологических системах меланопсин человека активирует также и Gi/o пути, а куриный меланопсин и Gs-активность. Меланопсин способен обеспечить клетке достаточно высокую чувствительность к свету (в 3 раза больше, чем опсины 1-го типа), для фотобиологического ответа клеткам требуется 1012 фотонов/(см2×с) (Baker, Flannery, 2018).

Возможный кандидат для оптопротезирования — колбочковый опсин, который также обеспечивает достаточную высокую чувствительность клетке. Продемонстрировано (Berry et al., 2019), что опсин зеленых колбочек человека, экспрессированный в ганглиозных клетках сетчатки и в модельных клеточных системах (HEK293) имеет значительно более быстрый ответ на световую стимуляцию, чем родопсин (почти в 10 раз быстрее).

Один из факторов, влияющих на ответ клетки на свет, — специфичность связывания с G-белком. Показано, что опсины способны взаимодействовать более чем с одним G-белком (Bailes, Lucas, 2013; Masuho et al., 2015; Ballister et al., 2018). Например, родопсин и опсин длинноволновых колбочек связываются с Gt и с Go, которые принадлежат семейству Gi/o. Человеческий меланопсин способен взаимодействовать не только с Gq, но и с Gi/o (Bailes, Lucas, 2013). Исследована (Ballister et al., 2018) активность натуральных и химерных опсинов и способность связывания их с различными G-белками в модельных клетках. Наибольшая неселективная активность обнаружена у родопсина по отношению к Gi/o/t, в частности бычий родопсин способен связываться с Gi и в меньшей степени с Go (Leemann, Kleinlogel, 2023). Как показало тестирование в гетерологических системах, опсин длинноволновых колбочек и химерный опсин (AmphiOp1), созданный на основе родопсина человека и ланцетника Branchiostoma belcheri, характеризуется высокой селективностью к Gi и Go. Опсины некоторых беспозвоночных (Jellyfish) показывают сродство к Gs, сигнальный путь приводит к увеличению цАМФ в клетке.

Понимание специфичности клеточных сигнальных путей, опосредованных G-белками, — важнейший шаг для разработки новых оптогенетических инструментов на основе опсинов 2-го типа.

ХИМЕРНЫЕ СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ GPCRs

Химеры на основе каналородопсинов (C1V1, ChEF и ChIEF) характеризуются низкой чувствительностью (один квант света открывает один ионный канал). Альтернативным решением стало создание химерных конструкций на основе GPCRs (opto-GPCRs). Такие белки состоят из светочувствительного домена и измененного С-конца, активирующего G-белок. Первые химеры (opto-β2AR) были созданы на основе родопсина и β2-адренорецепотора (β2AR), при этом были сохранены внеклеточные домены родопсина, а внутриклеточные домены были заменены на β2AR (Kim et al., 2005). Позднее появились химерные белки (opto-α1AR), созданные на основе α1-адренорецепора (α1AR) (Airan et al., 2009). Химерный опсин opto-α1AR, трансдуцированный в гетерологическую систему, при световой стимуляции активировал Gq, что привело к повышению Ca2+, а в результате фотостимуляции химерного белка opto-β2AR через Gs-сигнализацию увеличилась концентрация цАМФ в клетке. Модифицированные белки на основе родопсина изменили свою специфичность связывания с Gt на Gq и Gs, полученные ответы на световую стимуляцию сопоставимы с ответами адренорецепторов дикого типа (Airan et al., 2009).

Еще один светочувствительный химерный белок создан на основе родопсина с заменой С-конца на CT-домен метаботропного серотонинового рецептора (5-HT1A). Такая химера (Rh-CT5-HT1A) активировала Gi/o-сигнализацию (Oh et al., 2010).

Обсуждаемые выше химерные конструкции были созданы на основе GPCRs класса А. Однако идея придания светочувствительности ON-биполярным клеткам сетчатки, сигнальный каскад в которых запускается метаботропными глутаматными рецепторами, привела к созданию химеры opto-mGluR6, сочетающей в себе внутриклеточный домен от метаботропного глутаматного рецептора mGluR6 (GPCR класс С) и внеклеточный домен от меланопсина (GPCR класс А) (Wyk et al., 2015; Kleinlogel, 2016). Выбор меланопсина в качестве светочувствительного белка обусловлен его особенностями — устойчивостью к обесцвечиванию и связанностью хромофора с белковой частью опсина после фотоизомеризации. Внутриклеточные домены меланопсина, а именно: вторая и третья внутриклеточные петли (IL-2 и IL-3) заменены на соответствующие петли mGluR6. Таким образом, меланопсиновая часть рецептора выполняет светочувствительную функцию, а внутриклеточный домен mGluR6 (IL-2, IL-3 и С-конец белковой молекулы) активирует сигнальные пути клетки (Wyk et al., 2015; Kleinlogel, 2016; Leemann, Kleinlogel, 2023). В химере bRhod-b2AR последовательно заменили IL-2, IL-3 и С-конец родопсина гомологичными доменами β2AR. Замена IL-3 привела к изменению селективности G-белка по пути Gs-активности (Leemann, Kleinlogel, 2023). А в химере Mela(trunc)-mGluR6(IL-3+CT) стимулировали Gi-сигнализацию. Показано также, что mGluR6 может не только активировать Go и Gi, но и Gt (Tian, Kammermeier, 2006; Leemann, Kleinlogel, 2023). Продемонстрировано (Ballister et al., 2018), что в тестовых клеточных системах родопсин человека является Gi/o/t-связанным опсином. Опсин длинноволновых колбочек оказался активен в отношении Gi и Go. Это и объясняет эффективность применения родопсина и опсина средневолновых колбочек сетчатки в ON-биполярных клетках для восстановления зрения (Gaub et al., 2014; Cehajic-Kapetanovic et al., 2015).

ТЕСТИРОВАНИЕ ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИНСТРУМЕНТОВ В ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМАХ

В настоящее время достаточно широко используют гетерологические экспрессионные системы для воссоздания различных сигнальных путей в клетке. Использование управляемой стимуляции внутриклеточных молекулярных механизмов в модельной клетке позволяет протестировать активность белков, каналов, рецепторов еще до внедрения генетических конструктов в организм животного. Для подобных исследований часто используют различные клеточные линии, например HEK293 (human embryonic kidney 293), COS (фибробластоподобные клетки, полученные из ткани почек обезьяны), CHO (эпителиальные клетки, производные клеток яичника китайского хомячка), BHK (линия клеток, полученная из почек детенышей хомячка). Клеточная линия HEK293 получена путем трансформации эмбриональных клеток почек человека с помощью редуцированного аденовируса человека 5-го типа (Graham et al., 1977), позднее появились ее подтипы и производные HEK293-T и HEK293-F. Преимущества таких клеточных линий — простота культивирования, высокая трансфективность, использование легкодоступных реагентов трансфекции — фосфата кальция или полиэтиленимина (PEI), быстрая скорость роста и способность расти в среде без сыворотки. Клетки одной линии однородны по составу, размеру, форме, им свойственна высокая эффективность экспрессии и низкие эндогенные токи (Thomas, Smart, 2005). Для тестирования в качестве гетерологической экспрессионной системы часто выбирают клетки линии HEK293-T (Карпушев, Чилигина 2023; Masseck et al., 2014; Wyk et al., 2015; Spoida, 2016; Ballister et al., 2018; Kralik et al., 2022). В такую модельную систему путем трансфекции (трансдукции) встраивается генетический конструкт (вектор), содержащий гены светочувствительного белка, а также, если это необходимо, гены ионных каналов, обеспечивающих реализацию сигнальных путей внутри клетки. Активация светочувствительного белка будет отражаться в изменении канальных ионных токов, регистрируемых электрофизиологическими методиками, в частности методом patch-clamp. В случае опсинов 1-го типа исследуются катионные или анионные токи, проходящие непосредственно через сам светочувствительный белок-канал (Boyden et al., 2005; Tomita et al., 2014; Govorunova et al., 2015). При исследовании активности опсинов 2-го типа проводят совместную трансфекцию векторов, содержащих гены светочувствительных белков и ионных каналов, управляемых G-белками, или используют клеточные линии HEK293, стабильно экспрессирующие ионные каналы, например G-белок-связанные калиевые каналы внутреннего выпрямления GIRKs (G-protein-gated inwardly rectifying potassium channels) или Kir3. При тестировании опсинов 2-го типа в гетерологических системах возникает ряд вопросов. Во-первых, обеспечена ли клетка необходимым количеством эндогенных G-белков для реализации сигнальных путей? Показано, что некоторые G-белки, например Gi, действительно присутствуют в клетках HEK293-T, однако белок Go не был обнаружен (Law et al., 1993; Thomas, Smart, 2005). Во-вторых, как добиться регенерации опсинов после стимуляции светом? Это особенно важно при использовании режима многократной повторной световой стимуляции. Выбор GIRKs при тестировании активности опсинов определяется их функциональной регуляцией. Считается, что внутреннее выпрямление, наблюдаемое во всех GIRKs, возникает в результате внутренней блокады канала внутриклеточными катионами, которые блокируют внешний калиевый ток за счет прикрепления к трансмембранным и цитоплазматическим доменам канала, образуя внутренний шлюз. Каналы семейства GIRKs представляют собой гомомерные или гетеромерные комплексы субъединиц (GIRK1 (Kir3.1/Kcnj3), GIRK2 (Kir3.2/Kcnj6), GIRK3 (Kir3.3/Kcnj9) и GIRK4 (Kir3.4/Kcnj5), каждый имеет два трансмембранных домена и внутриклеточные N- и C-концевые домены. GIRKs сопряжены с G-белками, при этом Gi/o активируют, а Gq ингибируют каналы (Lei et al., 2000; Bünemann et al., 2001). В результате активации GPCR происходит диссоциация тримерного G-белка на содержащую ГТФ α-субъединицу и димер из βγ-субъединиц (Gβγ), происходит активация калиевого канала внутреннего выпрямления, что приводит к открытию канала и гиперполяризации клетки. Таким образом, фотоактивация опсинов 2-го типа как рецепторов, сопряженных с G-белками, встроенных в результате экзогенной экспрессии в модельную клетку, будет изменять ток калиевых каналов внутреннего выпрямления. Исследование активности GIRKs в функциональной тестовой клеточной системе позволит смоделировать сигнальные пути передачи светового сигнала внутри ON-биполяров. Работа GIRKs зависит от концентрации βγ-димеров G-белков (Hommers et al., 2003; Skylar, Bruchas, 2017). Известно, что TRPM1-канал ON-биполярных клеток закрывается комплексом Gβγ при участии GαoГДФ. Однако эффекты взаимодействия субъединиц G-белка с GIRK и TRPM1 противоположны: комплекс Gβγ открывает GIRK, но закрывает TRPM1, Gαi/oГДФ снижает базовый ток GIRK, GαoГДФ, по-видимому, увеличивает ток TRPM1. Тем не менее тестирование различных опсинов в гетерологических клеточных системах, содержащих GIRKs, будет отражать и особенности взаимодействия субъединиц G-белков в TRPM1-каналах. В модельных клетках исследуют активность натуральных светочувствительных белков: родопсина позвоночных vRh (Masseck et al., 2014), опсина коротковолновых колбочек vSWO (Masseck et al., 2014), опсина средневолновых колбочек OPN1MW (Berry et al., 2019; Kralik et al., 2022), опсина длинноволновых колбочек vLWO, меланопсина мыши mOpn4L, меланопсина человека hOpn4L (Spoida, 2016; Kralik et al., 2022), опсина медузы JellyOp (Wyk, Kleinlogel, 2023), сравнивая белки дикого типа с различными химерными конструкциями: opto-mGluR6, Mela(CT+IL-3mGluR6), Mela(CTmGluR6), OPN1MW(CTmGluR6) (Wyk et al., 2015; Kralik et al., 2022). Активность опсинов при световой стимуляции оценивают на основе амплитуды канальных токов и кинетики GIRKs, используя постоянную времени на включение (τ ON) и выключение (τ OFF) светового стимула (табл. 1).

 

Таблица 1. Характеристики сигнального пути, реализуемого в ответ на световую стимуляцию натуральных и химерных опсинов в гетерологической экспрессионной системе (HEK293)

Светочувствительный белок

Характеристика световой стимуляции

Путь G-белка

τ ON, с

τ OFF, с

Источник

vRh

475

Gi/o

3.4

33

Masseck et al., 2014

vSWO

450

Gi/o

1.2

12

Masseck et al., 2014

vLWO

590

Gi/o

1.1

11

Masseck et al., 2014

Rh

485

Gi/o

9–10

43–53

Oh et al., 2010

5-HT1A

485

Gi/o

1–2

35–48

Oh et al., 2010

Rh-CT5-HT1A

485

Gi/o

9–10

48–55

Oh et al., 2010

JellyOp-Gas

490

Gs

0.03 ± 0.001

15.3 ± 0.1

Wyk, Kleinlogel, 2023

hOpn4L

479 — активация

560 — деактивация

Gq, Gi/o

2.0–2.4

10–12

Spoida, 2016

mOpn4L

479 — активация

560 — деактивация

Gq, Gi/o

1.4–1.7

9–10

Spoida, 2016

Melanopsin WT

470

Gq, Gi

1.6 ± 0.3

17.6 ± 4.8

Kralik et al., 2022

OPN1MW

470

Gi

0.9 ± 1.2

8.1 ± 4.3

Kralik et al., 2022

Mela(CT+IL-3mGluR6)

470

Go

1.6 ± 0.3

12.8 ± 1.7

Kralik et al., 2022

Mela(CTmGluR6)

470

Go

0.7 ± 0.2

12.1 ± 2.3

Kralik et al., 2022

OPN1MW(CTmGluR6)

470

Go

0.8 ± 0.2

9.8 ± 2.2

Kralik et al., 2022

Примечание: τ ON (с) — постоянная времени активации калиевого канала внутреннего выпрямления (GIRK) на включение светового стимула, τ OFF (c) — постоянная времени деактивации GIRK на выключение светового стимула; vSWO — коротковолновой опсин колбочек мыши, vLWO — длинноволновой опсин человека, vRh — родопсин позвоночных, Rh — родопсин, 5-HT1A — подтип серотонинового рецептора, Rh-CT5-HT1A — химерный белок с заменой С-терминального домена на домен 5-HT1A, JellyOp-Gas — химерный опсин кубомедузы с усиленной селективностью к Gs, hOpn4L — меланопсин человека, mOpn4L — меланопсин мыши, Melanopsin WT — меланопсин дикого типа, OPN1MW — средневолновой опсин колбочек, Mela(CT+IL-3mGluR6) — химерный белок на основе меланопсина и метаботропного глутаматного рецептора mGluR6, в котором третья внутриклеточная петля IL-3 была заменена на такую же mGluR6, Mela(CTmGluR6) — химерный белок на основе меланопсина и метаботропого глутаматного рецептора mGluR6, OPN1MW(CTmGluR6) — химерный белок, на основе средневолнового опсина и метаботропного глутаматного рецептора mGluR6.

 

Параметры световой стимуляции, а именно: длительность, интенсивность, частота, а также индивидуальный диапазон спектров поглощения опсинов будут влиять на токи GIRK в гетерологической системе (Oh et al., 2010; Masseck et al., 2014; Wyk et al., 2015; Spoida, 2016; Kralik et al., 2022; Wyk, Kleinlogel, 2023). Показано (Masseck et al., 2014), что длительность световой стимуляции опсинов влияет на амплитуду тока GIRK. Авторы сравнили между собой различные опсины: родопсин позвоночных (vRh), коротковолновые опсины колбочек мыши (vSWO) и длинноволновые опсины колбочек человека (vLWO). Для достижения 50% канального тока GIRK достаточно 50 мс световой стимуляции в случае vRh, 200 мс — для vLWO, а 500 мс — для vSWO. Многократная ритмическая фотостимуляция vLWO и vSWO в течение 1 с не повлияла на амплитуду канального тока GIRK, но при повторной световой стимуляции vRh амплитуда ответа снизилась до 20% (Masseck et al., 2014). Интенсивность светового потока также отражается на величине канальных токов, при ее снижении до 0.002 мВт/мм2 амплитуда ответа уменьшилась до 70% для vRh, до 30% — для vLWO и до 20% — для vSWO от исходного уровня. Максимальный ток GIRK был получен при 2 мВт/мм2. Для каждого опсина (vRh, vSWO, vLWO) подобраны соответствующие индивидуальным пикам максимальной спектральной чувствительности параметры фотостимуляции (475, 360, 550–560 нм соответственно). Например, при стимуляции vSWO в диапазоне от 380 до 400 нм наблюдали наибольшую активацию канальных токов GIRK, а уже при 510 нм токи были не более 10% от максимальных. В тестовых системах родопсин проявил себя как наиболее чувствительный к интенсивности светового потока, но вместе с тем и наиболее уязвимый к выцветанию пигмент, по кинетике уступающий колбочковым опсинам. Интересно, что ответы на световую стимуляцию меланопсина отличались в зависимости от воздействующего стимула. При фотостимуляции мышиного и человеческого меланопсина (mOpn4L и hOpn4L) синим светом (470 нм 1.8 мВ/мм2 ) на 10 с обнаружены значительные токи GIRK. В то же время в ответ на включение желтого света (560 нм 1.2 мВ/мм2) на 50 с регистрировали деактивацию канальных токов, которая для hOpn4L начиналась с 560 нм и продолжалась до 620 нм для mOpn4L. Максимум поглощения меланопсина находится в диапазоне от 460 до 490 нм. Возможно, светоиндуцированное фосфорилирование на С-конце вызвало деактивацию меланопсина (Blasic et al., 2012). Повторная ритмическая стимуляция в режиме 20 вспышек с частотой 1/30 с и со спектральным максимумом 470 и 560 нм соответственно для каждого меланопсина привела к снижению амплитуды канальных токов на 50%. Минимальная длительность световой стимуляции для получения 90% активации канала составила 100 мс в случае mOpn4L и более 500 мс для hOpn4L, при этом мышиный меланопсин давал более быстрый ответ на включение и на выключение стимула (Spoida, 2016). Для меланопсина характерен определенный диапазон наибольшей чувствительности от 410 до 470 нм, в котором для получения максимального тока GIRK достаточно 10 с стимуляции (0.03 мВт/мм2, 470 нм). Основной путь, реализуемый в ответ на световую сигнализацию опсинов, — это внутриклеточная сигнализация, опосредованная Gi/o-белками, вызывающая токи GIRKs (Masseck et al., 2014). Однако на примере человеческого меланопсина (hOpn4L) доказана (Spoida, 2016) возможность активации Gq-внутриклеточного пути в гетерологической системе. В тестовых системах меланопсин обладает достаточно высокой чувствительностью, быстрой кинетикой и, по сравнению с родопсином, является устойчивым к выцветанию (табл. 1). При разработке химерных конструкций ставили задачу ускорить кинетику активации при сохранении высокой светочувствительности химерного белка. В одной из последних работ (Wyk, Kleinlogel, 2023) описан новый оптогенетический инструмент, исследованный в тестовых клеточных системах, — это химерный опсин кубомедузы с усиленной селективностью к Gs — JellyOp-Gas. Химерный JellyOp-Gas продемонстрировал высокую скорость внутриклеточной сигнализации, работая в 30 раз быстрее, чем любой опсин сопряженный с Gi/o. Полученные канальные токи GIRK значительно превышали токи, вызываемые JellyOp дикого типа. Такая активность химерного белка обусловлена, по мнению авторов, конститутивным связыванием JellyOp-Gas с Gs, что обеспечило большую диссоциацию комплекса Gβγ, что и способствовало увеличению канальных токов GIRK (Wyk, Kleinlogel, 2023).

В последнее время при разработке химерных рецепторов на основе opto-GPCRs все большее внимание уделяют изменению внутриклеточной сигнализации, опосредованной G-белками (Gi/o/t или Gq) (Masseck et al., 2014; Wyk et al., 2015; Kleinlogel, 2016; Spoida, 2016; Kralik et al., 2022; Wyk, Kleinlogel, 2023). Особенный интерес для генной терапии вызывают химерные конструкции светочувствительных белков, разработанные на основе метаботропного глутаматного рецептора opto-mGluR6, с заменой внутриклеточной петли (IL-3) от mGluR6 и светочувствительного домена от меланопсина или средневолнового опсина колбочек (OPN1MW). Модификации внутриклеточных петель и проксимального С-конца химерных белков позволяют увеличить кинетику и амплитуду светоуправляемых ответов за счет изменения тропизма G-белков. Химера opto-mGluR6, где светочувствительным доменом является меланопсин, меняет тропизм Gαq на Gαo, свойственный ON-биполярным клеткам. В тестовых системах показано, что канальные токи, вызванные фотостимуляцией химерных белков Mela(CT+IL-3mGluR6) (44.0 ± 3.7 pA/pF), Mela(CTmGluR6) (98.0 ± ± 9.7 pA/pF), OPN1MW(CTmGluR6) (78.0 ± ± 9.6 pA/pF), значительно выше, по сравнению с токами, инициируемыми меланопсином дикого типа (22 ± 5.7 pA/pF) и OPN1MW (46.1 ± 7.8 pA/pF) (Kralik et al., 2022). Химеры также характеризовались улучшенной кинетикой и на включение, и на выключение световой стимуляции (табл. 1).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимым этапом в исследовании светочувствительных белков как оптогенетических инструментов для терапевтического восстановления зрительных функций при тяжелых формах наследственных дегенеративных заболеваний является тестирование натуральных и химерных белков в экспрессионных гетерологических системах. Сопоставление параметров световой стимуляции (спектральный диапазон, интенсивность, длительность, частота) с характеристиками ответа (амплитуда канальных токов, кинетика активации и деактивации каналов) позволяет комплексно оценить активность опсинов в тестовых системах. Опсины 2-го типа как рецепторы, сопряженные с G-белками, способные активировать внутриклеточные каскадные сигнальные механизмы, обеспечивают бо́льшую чувствительность клеток к свету и становятся наиболее перспективными оптогенетическими инструментами для генной терапии. Реконструкция сигнальных путей в гетерологических экспрессионных системах нацелена на моделирование механизмов передачи светового сигнала в специализированных клетках сетчатки. Для воспроизведения каскада ON-биполярных клеток в экспрессионных гетерологических системах применяют химерные конструкции на основе метаботропного глутаматного рецептора (opto-mGluR6). Модификация внутриклеточных доменов и С-конца химерных белков дает возможность влиять на тропизм G-белков регулировкой светоуправляемого ответа. Активация сигнального пути посредством световой стимуляции белка и возникающий ответ каналов внутреннего выпрямления GIRKs позволяют проводить отбор оптогенетических инструментов в клетке, которая становится функциональной тестовой системой. Химерный светочувствительный белок должен сочетать в себе высокую чувствительность, улучшенные кинетические свойства, обеспечивая ON- и OFF-пути передачи светового сигнала, приближенные к таковым в здоровой сетчатке. В дальнейшем использование тестовых систем позволит повысить эффективность оптогенетического протезирования сетчатки.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю свою благодарность и признательность Михаилу Леонидовичу Фирсову за ценные замечания и редактирование текста рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа поддержана Минобрнауки России, соглашение № 075-15-2022-296, на создание и развитие научного центра мирового уровня Павловский центр “Интегративная физиология — медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям стрессоустойчивости”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо собственных исследований с участием людей или животных в качестве объектов изучения.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Как автор данной работы я заявляю, что у меня нет конфликта интересов.

×

Sobre autores

Y. Chiligina

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: julchil@mail.ru
Rússia, St. Petersburg

Bibliografia

  1. Долгих Д.А., Малышев А.Ю., Саложин С.В. Анионный канальный родопсин, экспрессированный в культуре нейронов и in vivo в мозге мыши: светоиндуцированное подавление генерации потенциалов действия // ДАН. 2015. Т. 465 (6). С. 737–740.
  2. Карпушев А.В., Чилигина Ю.А. Электрофизиологическое тестирование активации G-белок-зависимого сигнального каскада светочувствительными химерными рецепторами // Мат. III Всерос. науч. конф. с междунар. уч. “Оптогенетика+ 2023” (СПб., 6–8 апреля 2023 г.). СПб.: ИЭФБ, 2023. С. 48–49.
  3. Кирпичников М.П., Островский М.А. Оптогенетика и зрение // Вестн. РАН. 2019. Т. 89 (2). С. 125–30.
  4. Колесов Д.В., Соколинская Е.Л., Лукьянов К.А., Богданов А.М. Молекулярные инструменты направленного контроля электрической активности нервных клеток. Ч. I // Acta Naturae. 2021. Т. 13 (3). С. 52–64.
  5. Островский М.А. Молекулярная физиология зрительного пигмента родопсина: актуальные направления // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2020. Т. 106 (4). С. 401–420.
  6. Петровская Л.Е., Рощин М.В., Смирнова Г.Р. и др. Бицистронная генетическая конструкция для оптогенетического протезирования рецептивного поля ганглиозной клетки дегенеративной сетчатки // ДАН. 2019. Т. 486. С. 258–261.
  7. Airan R.D., Thompson K.R., Fenno L.E. et al. Temporally precise in vivo control of intracellular signaling // Lett. Nat. 2009. V. 458. P. 1025–1029.
  8. Arshavsky V., Burns M. Current understanding of signal amplification in phototransduction // Cell. Logist. 2014. V. 4 (2). P. e28680. https://doi.org/10.4161/cl.29390
  9. Bailes H., Lucas R. Human melanopsin forms a pigment maximally sensitive to blue light (λmax ≈ 479 nm) supporting activation of Gq/11 and Gi/o signalling cascades // Proc. Biol. Sci. 2013. V. 280. P. 20122987. http://doi.org/10.1098/rspb.2012.2987
  10. Baker C., Flannery J. Innovative optogenetic strategies for vision restoration // Front. Cell. Neurosci. 2018. V. 12. P. 316. https://doi.org/10.3389/fncel.2018.00316
  11. Ballister E.R., Rodgers J., Martial F., Lucas R.J. A live cell assay of GPCR coupling allows identification of optogenetic tools for controlling Go and Gi signaling // BMC Biol. 2018. V. 16. P. 10. https://doi.org/10.1186/s12915-017-0475-2
  12. Berry M.H., Holt A., Salari A. et al. Restoration of high-sensitivity and adapting vision with a cone opsin // Nat. Com. 2019. V. 10. P. 1221. https://doi.org/10.1038/s41467-019-09124-x
  13. Bi A., Cui J., Ma Yu-P. et al. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration // Neuron. 2006. V. 50. P. 23–33. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2006.02.026
  14. Bird A.C. Clinical investigation of retinitis pigmentosa // Aust. N. Z. J. Ophthalmol. 1988. V. 16. P. 189–198.
  15. Blasic J.R.Jr., Brown L.R., Robinson Ph.R. Light-dependent phosphorylation of the carboxy tail of mouse melanopsin // Cell. Mol. Life Sci. 2012. V. 69 (9). P. 1551–1562. https://doi.org/10.1007/s00018-011-0891-3
  16. Boyden E., Zhang F., Bamberg E. et al. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity // Nat. Neurosci. 2005. V. 8. P. 1263–1268. http://dx.doi.org/10.1038/nn1525
  17. Bünemann M., Bucheler M.M., Philipp M. et al. Activation and deactivation kinetics of alpha 2A- and alpha 2C-adrenergic receptor-activated G protein-activated inwardly rectifying K+ channel currents // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 47512–47517. https://doi.org/10.1074/jbc.m108652200
  18. Cehajic-Kapetanovic J., Eleftheriou C., Allen A.E. et al. Restoration of vision with ectopic expression of human rod opsin // Curr. Biol. 2015. V. 25. P. 2111–2122. https://doi.org/10.1016%2Fj.cub.2015.07.029
  19. Covington H.E., Lobo M.K., Maze I. et al. Antidepressant effect of optogenetic stimulation of the medial prefrontal cortex // J. Neurosci. 2010. V. 30 (48). P. 16082–16090. https://doi.org/10.1523%2FJNEUROSCI.1731-10.2010
  20. Deisseroth K., Feng G., Majewska A. et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits // J. Neurosci. 2006. V. 26 (41). P. 10380–10386. https://doi.org/10.1523/jneurosci.3863-06.2006
  21. Deisseroth K. Optogenetics // Nat. Methods. 2011. V. 8 (1). P. 26–29. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.324
  22. Deisseroth K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience // Nat. Neurosci. 2015. V. 8 (9). P. 1213–1225. https://doi.org/10.1038/nn.4091
  23. Dhingra A., Vardi N. “mGlu receptors in the retina” — WIREs membrane transport and signaling // Wiley Interdiscip. Rev. Membr. Transp. Signal. 2012. V. 1 (5). P. 641–653. https://doi.org/10.1002/wmts.43
  24. Doroudchi M., Greenberg K., Liu J. et al. Virally delivered channelrhodopsin-2 safely and effectively restores visual function in multiple mouse models of blindness // Mol. Ther. 2011. V. 19. P. 1220–1229. https://doi.org/10.1038/mt.2011.69
  25. Firsov M.L. Perspective for the optogenetic prosthetization of the retina // Neurosci. Behav. Physi. 2019. V. 49. P. 192–198. https://doi.org/10.1007/s11055-019-00714-2
  26. Flock T., Hauser A., Lund N. et al. Selectivity determinants of GPCR-G-protein binding // Nature. 2017. V. 545 (7654). P. 317–322. https://doi.org/10.1038/nature22070
  27. Ganjawala T.H., Lu Q., Fenner M.D. et al. Improved CoChR variants restore visual acuity and contrast sensitivity in a mouse model of blindness under ambient light conditions // Mol. Ther. 2019. V. 27 (6). P. 1195–1205. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2019.04.002
  28. Gaub B.M., Berry M.H., Holt A.E. et al. Restoration of visual function by expression of a light-gated mammalian ion channel in retinal ganglion cells or ON-bipolar cells // PNAS USA. 2014. V. 111 (51). P. E5574–83.
  29. Govorunova E.G., Sineshchekov O.A., Janz R. et al. Natural light-gated anion channels: a family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics // Science. 2015. V. 349 (6248). P. 647–650. https://doi.org/10.1126/science.aaa7484
  30. Graham F.L., Russell W.C., Smiley J. et al. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5 // J. Gen. Virol. 1977. V. 36. P. 59–72. https://doi.org/10.1099/0022-1317-36-1-59
  31. Guido M.E., Marchese N.A., Rios M.N. et al. Non-visual opsins and novel photo-detectors in the vertebrate inner retina mediate light responses within the blue spectrum region // Cell. Mol. Neurobiol. 2022. V. 42 (1). P. 59–83. https://doi.org/10.1007/s10571-020-00997-x
  32. Hofmann K.P., Lamb T.D. Rhodopsin, light-sensor of vision // Prog. Retin. Eye Res. 2022. V. 93. P. 101116. http://dx.doi.org/10.1016/j.preteyeres.2022.101116
  33. Hommers L.G., Lohse M.J., Bünemann M. Regulation of the inward rectifying properties of G-protein-activated inwardly rectifying K+ (GIRK) channels by Gβγ subunits // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (2). P. 1037–1043. https://doi.org/10.1074/jbc.m205325200
  34. Kato M., Sugiyama T., Sakai K. et al. Two opsin 3-related proteins in the chicken retina and brain: a TMT-type opsin 3 is a blue-light sensor in retinal horizontal cells, hypothalamus, and cerebellum // PLoS One. 2016. V. 11 (11). P. e0163925. https://doi.org/10.1371%2Fjournal.pone.0163925
  35. Kim J.-M., Hwa J., Garriga P. Light-driven activation of beta 2-adrenergic receptor signaling by a chimeric rhodopsin containing the beta 2-adrenergic receptor cytoplasmic loops // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 2284–2292. https://doi.org/10.1021/bi048328i
  36. Kim C.K., Adhikari A., Deisseroth K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience // Nat. Rev. Neurosci. 2017. V. 18 (4). P. 222–235. https://doi.org/10.1038/nrn.2017.15
  37. Kleinlogel S. Optogenetic user’s guide to opto-GPCRs // Front. Biosci. 2016. V. 21. P. 794–805. https://doi.org/10.2741/4421
  38. Koyanagi M., Terakita A. Diversity of animal opsin-based pigments and their optogenetic potential // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1837. P. 710–716. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbabio.2013.09.003
  39. Kralik J., Wyk M., Stocker N., Kleinlogel S. Bipolar cell targeted optogenetic gene therapy restores parallel retinal signaling and high-level vision in the degenerated retina // Comm. Biol. 2022. V. 5. P. 1116. https://doi.org/10.1038/s42003-022-04016-1
  40. Lagali P., Balya D., Awatramani G. et al. Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration // Nat. Neurosci. 2008. V. 11. P. 667–675. https://doi.org/10.1038/nn.2117
  41. Lamb T.D. Photoreceptor physiology and evolution: cellular and molecular basis of rod and cone phototransduction // J. Physiol. 2022. V. 600 (21). P. 4585–4601.
  42. Law S., Yasuda K., Bell G., Reisine T. Gi alpha 3 and G(o) alpha selectively associate with the cloned somatostatin receptor subtype SSTR2 // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 10721–10727.
  43. Lei Q., Jones M.B., Talley E.M. et al. Activation and inhibition of G protein coupled inwardly rectifying potassium (Kir3) channels by G protein βγ subunits // PNAS USA. 2000. V. 97. P. 9771—9776. https://doi.org/10.1073%2Fpnas.97.17.9771
  44. Leemann S., Kleinlogel S. Functional optimization of light-activatable opto-GPCRs: illuminating the importance of the proximal C-terminus in G-protein specificity // Front. Cell Dev. Biol. 2023. V. 11. P. 1053022. https://doi.org/10.3389/fcell.2023.1053022
  45. Levitz J., Pantoja C., Gaub B. et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors // Nat. Neurosci. 2013. V. 16. P. 507–516. https://doi.org/10.1038/nn.3346
  46. Lin J.Y., Lin M.Z., Steinbach P., Tsien R.Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics // Biophys. J. 2009. V. 96 (5). P. 1803–1814. https://doi.org/10.1016%2Fj.bpj.2008.11.034
  47. Lin J.Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments // Exp. Physiol. 2011. V. 96. P. 19–25. https://doi.org/10.1113%2Fexpphysiol.2009.051961
  48. Mathes T. Natural resources for optogenetic tools // Optogenetics / Ed. A. Kianianmomeni. N.Y.: Springer, 2016. P. 19–36.
  49. Masseck O., Spoida K. Dalkara D. et al. Vertebrate cone opsins enable sustained and highly sensitive rapid control of Gi/o signaling in anxiety circuitry // Neuron. 2014. V. 81. P. 1263–1273. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2014.01.041
  50. Masuho I., Ostrovskaya O., Kramer G. Distinct profiles of functional discrimination among G proteins determine the actions of G protein-coupled receptors // Sci. Signal. 2015. V. 8 (405). P. ra123. https://doi.org/10.1126/scisignal.aab4068
  51. Milligan G., Kostenis E. Heterotrimeric G-proteins: a short history // Br. J. Pharmacol. 2006. V. 147 (1). P. S46–S55. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706405
  52. Nagata T., Koyanagi M., Lucas R., Terakita A. An all-trans-retinal-binding opsin peropsin as a potential dark-active and light-inactivated G protein-coupled receptor // Sci. Rep. 2018. V. 8 (3535). P. 1–7. https://doi.org/10.1038/s41598-018-21946-1
  53. Nagel G., Mockel B., Buldt G., Bamberg E. Functional expression of bacteriorhodopsin in oocytes allows direct measurement of voltage dependence of light induced H+ pumping // FEBS Lett. 1995. V. 377. P. 263–266. https://doi.org/10.1016/0014-5793(95)01356-3
  54. Nagel G., Ollig D., Fuhrmann M. et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae // Science. 2002. V. 296 (5577). P. 2395–2398. https://doi.org/10.1126/science.1072068
  55. Nagel G., Szellas T., Huhn W. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // PNAS USA. 2003. V. 100 (24). P. 940–945. https://doi.org/10.1073/pnas.1936192100
  56. Neves S.R., Ram P.T., Iyengar R. G-protein pathways // Science. 2002. V. 296 (5573). P. 1636–1639. https://doi.org/10.1126/science.1071550
  57. Oh E., Maejima T., Liu C. et al. Substitution of 5-HT1A receptor signaling by a light-activated G protein-coupled receptor // J. Biol. Chem. 2010. V. 285 (40). P. 30825–30836. https://doi.org/10.1074/jbc.m110.147298
  58. Pugh E.N., Lamb T.D. Phototransduction in vertebrate rods and cones: molecular mechanisms of amplification, recovery and light adaptation. Ch. 5 // Handbook of biological physics / Eds D.G. Stavenga, W.J. DeGrip, E.N. Pugh Jr. North-Holland, 2000. V. 3. P. 183–255.
  59. Riggsbee C.W., Deiters A. Recent advances in the photochemical control of protein function // Trends Biotechnol. 2010. V. 28 (9). P. 468–475. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2010.06.001
  60. Rosenbaum D.M., Rasmussen S.G., Kobilka B.K. The structure and function of G-protein-coupled receptors // Nature. 2009. V. 459 (7245). P. 356–363. https://doi.org/10.1038/nature08144
  61. Rost B.R., Schneider-Warme F., Schmitz D., Hegemann P. Optogenetic tools for subcellular applications in neuroscience // Neuron. 2017. V. 96 (3). P. 572–603. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.09.047
  62. Sahel J.-A., Boulanger-Scemama E., Pagot Ch. et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy // Nat. Med. 2021. V. 27. P. 1223–1229. https://doi.org/10.1038/s41591-021-01351-4
  63. Skylar M.S., Bruchas M.R. Optogenetic approaches for dissecting neuromodulation and GPCR signaling in neural circuits // Curr. Opin. Pharmacol. 2017. V. 32. P. 56–70. https://doi.org/10.1016/j.coph.2016.11.001
  64. Spoida K. Melanopsin variants as intrinsic optogenetic on and off switches for transient versus sustained activation of G protein pathways // Curr. Biol. 2016. V. 26. P. 1206–1212. https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.03.007
  65. Stenkamp R.E., Filipek S., Driessen C.A. et al. Crystal structure of rhodopsin: a template for cone visual pigments and other G protein-coupled receptors // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1565 (2). P. 168–182. https://doi.org/10.1016/S0005-2736(02)00567-9
  66. Terakita A. The opsins // Genome Biol. 2005. V. 6 (3). P. 213. https://doi.org/10.1186/gb-2005-6-3-213
  67. Tian L., Kammermeier P.J. G protein coupling profile of mGluR6 and expression of G alpha proteins in retinal ON bipolar cells // Vis. Neurosci. 2006. V. 23 (6). P. 909–916. https://doi.org/10.1017/s0952523806230268
  68. Thomas P., Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins // J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 2005. V. 51. P. 187—200. http://dx.doi.org/10.1016/j.vascn.2004.08.014
  69. Tomita H., Sugano E., Murayama N. et al. Restoration of the majority of the visual spectrum by using modified Volvox channelrhodopsin-1 // Mol. Ther. 2014. V. 22. P. 1434–1440. https://doi.org/10.1038/mt.2014.81
  70. Tye K.M., Deisseroth K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models // Nat. Rev. Neurosci. 2012. V. 13 (4). P. 251–266. https://doi.org/10.1038/nrn3171
  71. Watanabe Y., Sugano E., Tabata К. et al. Development of an optogenetic gene sensitive to daylight and its implications in vision restoration // Regen. Med. 2021. V. 6 (1). P. 64. https://doi.org/10.1038/s41536-021-00177-5
  72. Wert K., Lin J.H., Tsang S.H. General pathophysiology in retinal degeneration // Dev. Ophtalmol. 2014. V. 53. P. 33–43. https://doi.org/10.1159%2F000357294
  73. Wu K., Kulbay M., Toameh D et al. Retinitis pigmentosa: novel therapeutic targets and drug development // Pharmaceutics. 2023. V. 15 (2). P. 685. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15020685
  74. Wyk M., Kleinlogel S.A. A visual opsin from jellyfish enables precise temporal control of G protein signaling // Nat. Comm. 2023. V. 14 (1). P. 2450. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1723578/v1
  75. Wyk M., Pielecka-Fortuna J., Löwel S., Kleinlogel S. Restoring the on switch in blind retinas: opto-mGluR6, a next-generation, cell tailored optogenetic tool // PLoS Biol. 2015. V. 13 (5). P. e1002143. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002143
  76. Xu Y., Orlandi C., Cao Y. et al. The TRPM1 channel in ON-bipolar cells is gated by both the α and the βγ subunits of the G-protein Go // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 20940.
  77. Yizhar O., Fenno L.E., Prigge M. et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction // Nature. 2011. V. 477. P. 172–178. https://doi.org/10.1038/nature10360

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares
Ação
1. JATS XML
Baixar
2. Fig. 1. Scheme of the phototransduction cascade in the rod. (a) receptor activation in the light. As a result of photon absorption, receptor activation and signal transmission from the activated receptor (rhodopsin) to transducin occur; as a result of a cascade of reactions, non-selective cationic cGMP-dependent channels are closed. (b) receptor deactivation. Rhodopsin returns to the dark state as a result of sequential interactions: recoverin–rhodopsin kinase, rhodopsin kinase–activated receptor, arrestin–phosphorylated metarhodopsin, receptor blocking. (c) phosphodiesterase shutdown. RGS9-1 protein binds to the Gt*–PDE-6 complex, resulting in dissociation of the complex. R — rhodopsin, R* — activated rhodopsin, Gt — transducin, Gt* — activated transducin, GDP — guanosine diphosphate, GTP — guanosine triphosphate, PDE-6 — phosphodiesterase-6, cGMP — cyclic guanosine monophosphate, GMP — guanosine monophosphate, GC — guanylate cyclase, REC — recoverin, RK — rhodopsin kinase, Ap — arrestin, R*-P — phosphorylated metarhodopsin.

Baixar (532KB)
Metadados
3. Fig. 2. Scheme of TRPM1 channel activation in ON-bipolar cells. Designations: Glu — glutamate, mGluR6 — metabotropic receptor mGluR6 of ON-bipolar cells, TRPM1 — channel of transient receptor potential of subfamily M, GDP — guanosine diphosphate, GTP — guanosine triphosphate, NT — N-terminus, CT — C-terminus.

Baixar (224KB)
Metadados

Declaração de direitos autorais © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».