Targeted Sequencing of the LEP Gene in Various Ethnic Groups of Obese Adolescents

Texto integral

Урбанизация и изменение образа жизни внесли вклад в стремительный рост числа случаев детского ожирения и избыточной массы тела [1]. Это может быть связано с несколькими факторами, включая неоптимальные методы вскармливания детей первого года жизни, растущую доступность ультраобработанных пищевых продуктов в мировых продовольственных запасах и изменения в рационе детей [2, 3]. Ожирение – сложное многофакторное заболевание, связанное с генетическими факторами и факторами окружающей среды. Кроме этого, реакция организма на диету и физическую активность при лечении ожирения также генетически детерминированы [4]. Развитие методов полногеномного поиска ассоциаций (GWAS) и секвенирования следующего поколения (NGS) способствовало открытию генетических полиморфизмов, ассоциированных с ожирением. Формирование моногенного ожирения связывают по меньшей мере с пятью генами: лептина (LEP), рецептора лептина (LEPR), рецептора меланокортина 4 (MC4R), прогормонконвертазы 1 (PCSK1) и проопиомеланокортина (POMC) [5].

Наиболее изученным из этих генов является ген LEP, его часто называют геном фактора ожирения, так как лептин играет важную роль в регуляции энергетического гомеостаза, в росте плода, провоспалительных иммунных реакциях, ангиогенезе и липолизе, также регулирует потребление пищи, массу тела и репродуктивную функцию [6]. Лептин секретируется белыми адипоцитами в кровоток, связывается с рецептором лептина в головном мозге, который активирует нижестоящие сигнальные пути, подавляя чувство голода и способствуя расходованию энергии. Ген LEP локализован на длинном плече хромосомы 7 (7q32.1), состоит из трех экзонов и двух интронов, кодируемый геном LEP белок имеет массу 16кДа и состоит из 167 аминокислот [7].

Для гена LEP в базе Национального центра биотехнологической информации США NCBI зарегистрировано 700 SNP [8]. В ClinVar – базе данных о клинической значимости генетических маркеров, ассоциация полиморфизмов гена LEP с клиническими фенотипами (заболеваниями) показана для 139 полиморфизмов, из которых 29 определены как патогенные, еще 2 – как вероятно патогенные [9]. По данным ClinVar, ассоциация с ожирением из-за врожденного дефицита лептина показана для пяти полиморфизмов, с дисфункцией лептина для одного полиморфизма.

Исследования по поиску ассоциаций полиморфных вариантов генов энергетического обмена с ожирением и метаболическим синдромом, как правило, проводятся у взрослых [10–12]. В исследованиях у подростков было показано, что полиморфизм гена рецептора лептина LEPR и гена рецептора меланокортина 4 MC4R связаны с риском развития метаболических нарушений у подростков-европеоидов с избыточной массой тела и ожирением, в то время как у подростков азиатского происхождения с этой патологией ассоциирован полиморфизм гена FTO [13]. В другой работе было установлено, что локус rs2167270 гена LEP ассоциирован с пищевым поведением у подростков, статистически значимые различия были установлены при анализе показателей пищевого поведения по шкале «Когнитивная сдержанность» опросника TFEQ [14]. Эти результаты согласуются с более ранним исследованием, в котором также была показана ассоциация полиморфных вариантов гена LEP с пищевым поведением у чилийских детей по шкалам «Эмоциональное питание» и «Неконтролируемое питание» опросника TFEQ [15].

Таким образом, в исследованиях у подростков была показана ассоциация гена LEP с пищевым поведением, в то время как вклад этого гена в развитие детского и подросткового ожирения не установлен. Цель настоящего исследования – провести поиск полиморфных вариантов гена LEP в группах подростков с избыточной массой тела и/или ожирением в этнических выборках русских и бурят.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», на территории Республики Бурятия и Иркутской области. Набор пациентов в группы исследования проводился в Клинике ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ (г. Иркутск) и Детской республиканской клинической больнице (г. Улан-Удэ). Из группы 354 подростков, набранной в ходе диспансерного осмотра, описанной нами ранее [16], для данного исследования случайным образом были отобраны 48 подростков от 11 до 17 лет (средний возраст 14,27 ± 2,09 лет) с разным статусом веса, из них 21 русский и 27 бурят. Основная группа данного исследования включала 29 подростков с избыточной массой тела и/или ожирением (SDS ИМТ > 1), из них 14 русских и 15 бурят; контрольная группа включала 19 подростков с нормальной массой тела (SDS ИМТ < 1), из них 7 русских и 12 бурят. Сравниваемые группы сопоставимы по полу (χ² = 1.3067, d.f. = 1, p = 0.253) и возрасту (W = 335, p = 0.2078) и имеют статистически значимые отличия по антропометрическим показателям: весу (W = 45.5, р ˂ 0.001), индексу массы тела (ИМТ) (W = 0, р ˂ 0.001), SDS ИМТ (W = 0, р ˂ 0.001).

Принадлежность к этнической группе устанавливали на основе опроса обследуемых об этнической принадлежности родственников I–III степени родства. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (протокол заседания № 6 от 02.12.2015 г.) и соответствует этическим принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (Бразилия, 2013 г). В работе с подростками руководствовались ст. 24 «Права несовершеннолетних» «Основ законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» от 22.07.1993 № 5487-1 (с изменениями от 20.12.1999).

Антропометрическое обследование подростков включало измерение роста и веса. Рост и вес оценивались по перцентильным таблицам для данного пола и возраста с последующим расчетом индекса массы тела (ИМТ) как отношения массы тела в килограммах к квадрату роста человека, выраженному в метрах, и коэффициента стандартного отклонения (SDS ИМТ) с помощью компьютерной программы Auxology 1.0 b17 (Pfizer, США). Масса тела классифицировалась как избыточная в случаях значения SDS ИМТ от 1 до 2, ожирение диагностировали при SDS ИМТ > 2.

Молекулярно-генетическое исследование полиморфных локусов гена LEP проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей электрофоретической детекцией и секвенирования по методу Сэнгера. Экстракцию геномной ДНК проводили из цельной венозной крови, забранной в вакуумную пробирку объемом 4.0 мл с К3 ЭДТА с использованием коммерческих наборов «ДНК Сорб-Б» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

С использованием программы Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) были подобраны 36 олигонуклеотидов (18 пар), которые полностью перекрывают последовательность гена LEP. В настоящем исследовании представлены результаты работы с четырьмя парами праймеров. Олигонуклеотиды были синтезированы в ЗАО «Евроген», их характеристика приведена в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристика олигонуклеотидов

Название	Структура	Длина (абсолютное кол-во нуклеотидов)	Молекулярный  вес (Mw) г/моль
s14_L867	CCAGACACTGGCAGTCTACC	20	6028
s14_R867	AAACTGCACTCCAGGGAGAC	20	6101
s15_L880	GGAAAAGCTGACTGGGAGGG	20	6277
s15_R880	TGGATAAGGGGTGTCCATGC	20	6194
s17_L857	CGATTAGCTGAGCCACATGC	20	6083
s17_R857	GGGCTCCCGTGATATTGTGT	20	6136
s18_L910	TGGGTGAGTAGCATAATCGCT	21	6481
s18_R910	GGAATCTCAGCAGGCAGAGG	20	6197

 

Для каждой пары праймеров проводили подбор оптимальных условий амплификации: температуру отжига праймеров, количественное соотношение компонентов реакционной смеси для амплификации, программу амплификации (варьирование температурных полок, времени инкубации и количества циклов). Для подбора температуры отжига праймеров использовали следующую формулу: T = 2(AT) + 4(GC) (инструкция к набору реагентов ScreenMix), где Т – температура отжига праймеров; АТ – количество нуклеотидов аденин и тимин; GC – количество нуклеотидов гуанин и цитозин, входящих в праймер. Также для подбора температуры отжига праймеров использовали онлайн-калькулятор на сайте компании Thermo Fisher (https://www.thermofisher.com.). Для каждой пары праймеров ставили не менее трех экспериментальных постановок ПЦР, варьируя температуру отжига.

 

Таблица 2. Последовательность внесения и объемы компонентов ПЦР-смеси

Компонент	Кол-во, мкл на один образец ДНК
Стерильная вода	5.2
Screen Mix	2.0
ПЦР-праймер 1 (L-левый)	0.4
ПЦР-праймер 2 (R-правый)	0.4
ДНК-матрица	2.0
Общий объем ПЦР-смеси	10.0

 

Амплификацию фрагментов гена LEP проводили на амплификаторе нуклеиновых кислот «ДТ-Прайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с использованием готовой смеси для ПЦР Screen Mix (ЗАО «Евроген»). Компоненты ПЦР смешивали в последовательности и объемах, приведенных в табл. 2 , амплификацию проводили по программе, приведенной в табл. 3, согласно протоколу производителя набора реагентов.

 

Таблица 3. Программа амплификации

Стадия		Температура, ˚C	Время инкубации	Количество циклов
1	Предварительная денатурация	95	5 мин	1
2	Денатурация:	95	30 с	40
	– отжиг праймеров	52–70	30 с
	– элонгация	72	30 с
3	Хранение	4

 

Детекцию продуктов амплификации осуществляли в 1.5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Продукты ПЦР вырезали из геля и очищали с помощью спин-колонок. Далее проводили секвенирование продуктов ПЦР на автоматическом секвенаторе «НАНОФОР 05» (ООО «Синтол», Россия) с использованием наборов реагентов BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, США), работа с которыми проводилась в соответствии с инструкцией производителя. Результаты секвенирования проходили биоинформационную обработку, которая включала оценку качества хроматограмм и выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей на референсную гена LEP NG_007450.1 RefSeqGene в программе Unipro UGENE.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы RStudio, которая находится в свободном доступе. Для описания количественных признаков использовали следующие показатели описательной статистики: для показателя «возраст» применяли среднее арифметическое (M) и стандартное отклонение (sd); для антропометрических показателей – медиану с размахом в виде первого и третьего квартилей [Me (Q1; Q3)]. При анализе различий между группами по антропометрическим признакам использовали непараметрический критерий Манна–Уитни (W). Нулевую гипотезу об отсутствии статистически значимых отличий отклоняли при уровне значимости 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведение исследования было разделено на два этапа. На первом проводился подбор условий амплификации фрагмента гена LEP. На втором этапе с образцами ДНК основной и контрольной групп последовательно проводили ПЦР, секвенирование по Сэнгеру и идентификацию SNP. Подбор оптимальных условий амплификации проводили последовательно для каждой пары праймеров с использованием пяти случайно выбранных образцов ДНК.

Подбор условий ПЦР для 14-й пары праймеров (олигонуклеотиды: s14_L867 s14_R867) был начат с температуры отжига. Согласно формуле для подбора температуры отжига праймеров (инструкция к набору реагентов ScreenMix) температура для левого праймера (s14_L867) составила 64˚С, для правого (s14_R867) – 62˚С. Температура отжига для этой пары праймеров, вычисленная с помощью онлайн-калькулятора на сайте компании Thermo Fisher, составила 64.9˚С. Для первого этапа эксперимента по подбору оптимальных условий амплификации провели три постановки ПЦР с температурой отжига праймеров: 58, 60 и 62˚С. Ожидаемый результат эксперимента – получить ампликоны размером 867 пн с минимальным количеством побочных и неспецифичных продуктов амплификации. После серии экспериментов по варьированию температуры отжига праймеров и снижению концентрации праймеров в амплификационной смеси оптимальные условия были подобраны: температура отжига 60˚С, уменьшение количества праймеров в ПЦР смеси на 20% от исходного (0,32 мкл).

Подбор условий ПЦР для 15-й пары праймеров (олигонуклеотиды: s15_L880, s15_R880), как и для 14-й пары праймеров, был начат с температуры отжига. Согласно формуле для подбора температуры отжига праймеров температура для левого праймера (s15_L880) составила 64˚С, для правого (s15_R880) – 62˚С. Температура отжига для этой пары праймеров, вычисленная с помощью онлайн-калькулятора на сайте компании Thermo Fisher составила 64.9˚С. Для первого этапа эксперимента по подбору оптимальных условий амплификации осуществили три постановки ПЦР-реакции с температурой отжига праймеров: 58, 60 и 62˚С. Ожидаемый результат эксперимента – получить ампликоны размером 880 пн с минимальным количеством димеров праймеров и продуктов неспецифичной амплификации. После серии экспериментов по варьированию температуры отжига праймеров, снижению концентрации праймеров и ДНК-матрицы в амплификационной смеси, изменения времени элонгации в программе амплификации оптимальные условия были подобраны: температура отжига 63˚С, уменьшение количества праймеров в ПЦР смеси на 20% (0,32 мкл), увеличение количества ДНК в ПЦР смеси на 50% (3 мкл), увеличение времени элонгации в ПЦР программе в 3 раза (90 с).

Подбор условий ПЦР для 17-й пары праймеров (олигонуклеотиды: s17_L857, s17_R857) традиционно был начат с температуры отжига. Согласно формуле для подбора температуры отжига праймеров температура для левого праймера (s17_L857) составила 62˚С, для правого (s17_R857) также 62˚С. Температура отжига для этой пары праймеров, вычисленная с помощью онлайн-калькулятора на сайте компании Thermo Fisher, составила 64.3˚С. Для первого этапа эксперимента по подбору оптимальных условий амплификации поставили три ПЦР с температурой отжига праймеров: 56, 58 и 60˚С. Ожидаемый результат эксперимента – получить ампликоны размером 857 пн с минимальным количеством димеров праймеров и продуктов неспецифичной амплификации. После серии экспериментов по варьированию температуры отжига праймеров, снижению концентрации праймеров в амплификационной смеси, изменению времени элонгации в программе амплификации оптимальные условия были подобраны: температура отжига 64˚С, уменьшение количества праймеров в ПЦР смеси на 10% от исходного (0,36 мкл), время элонгации 1 с, стандартное количество циклов 45, время первичной денатурации ДНК 3 мин.

Подбор условий ПЦР для 18-й пары праймеров (олигонуклеотиды: s18_L910, s18_R910), как и для других праймеров, был начат с температуры отжига. Согласно формуле для подбора температуры отжига праймеров температура для левого праймера (s18_L910) составила 62˚С, для правого (s18_R910) – 64˚С. Онлайн-калькулятор на сайте Thermo Fisher вычислил температуру отжига для этой пары праймеров – 64.2˚С. Для первого этапа эксперимента по подбору оптимальных условий амплификации поставили три ПЦР с температурой отжига праймеров: 57, 59 и 61˚С. Ожидаемый результат эксперимента – получить ампликоны размером 910 п. н. с минимальным количеством димеров праймеров и продуктов неспецифичной амплификации. После серии экспериментов по варьированию температуры отжига праймеров, снижению концентрации праймеров в амплификационной смеси, изменению времени элонгации и количества циклов в программе амплификации оптимальные условия были подобраны: температура отжига 64˚С, уменьшение количества праймеров в ПЦР смеси на 10% от исходного (0,36 мкл), время элонгации 1 с, количество циклов ПЦР – 40, время первичной денатурации ДНК 3 мин.

Краткое описание подобранных условий ПЦР для пяти праймеров гена LEP представлено в табл. 4 .

 

Таблица 4. Оптимальные условия ПЦР пяти фрагментов гена LEP

Варьируемые условия	Название и длина фрагмента
	S14, 867 пн	S15, 880 пн	S16, 891 пн*	S17, 857 пн	S18, 910 пн
Количество праймеров	–20% 0.32 мкл	Стандартно 0.4 мкл	–10% 0.36 мкл	Стандартно 0.4 мкл	–10% 0.36 мкл
Количество ДНК-матрицы	Стандартно 2 мкл	Увеличено 3 мкл	Стандартно 2 мкл	Стандартно 2 мкл	Стандартно 2 мкл
Температура отжига праймеров, ˚С	60	63	60	64	64
Время элонгации в программе амплификации, с	Стандартно 30	Увеличено 90	Стандартно 30	Снижено 1	Снижено 1
Количство циклов ПЦР-программы	Стандартно 40	Стандартно 40	Стандартно 40	Увеличено 45	Стандартно 40

Примечание. * – подбор условий для фрагмента S16 размером 891 п. н. описан нами ранее [17].

 

На втором этапе исследования, после того как оптимальные условия для амплификации были подобраны, проведено секвенирование фрагмента гена LEP. После выравнивания полученных результатов на референсную последовательность и биоинформационной обработки полученных данных нами идентифицировано 10 однонуклеотидных замен, из них семь зарегистрированы в базе NCBI и три замены не зарегистрированы в NCBI. Характеристика выявленных SNP приведена в табл. 5 и 6.

 

Таблица 5. Характеристика идентифицированных SNP, зарегистрированных в NCBI, и частота альтернативного аллеля в группах исследования

№	Идентификатор db SNP	Изменения нуклеотидов	Частота альтернативного аллеля
			символ аллеля	основная группа		контрольная группа
				русские n = 14	буряты n = 15	русские n = 7	буряты n = 12
1	rs3828942*	g.17975G>A	A	0.5	0.77	0.7	0.89
2	rs28954118*	g.18852A>T	T	0.107	–	–	–
3	rs759854910*	g.18478G>C	C	–	0.033	–	–
4	rs7788818	g.17554A>G	G	0.961	0.964	1	1
5	rs144755411	g.17737C>T	T	–	–	–	0.182
6	rs199893150	g.18683C>T	T	–	–	–	0.05
7	rs917105894	g.17282G>T	T	–	–	–	0.056

Примечание. * – зарегистрировано в Clin.Var.

 

Таблица 6. Характеристика SNP, идентифицированных в группах исследования и не зарегистрированных в базе NCBI

№	Идентификатор	Позиция в гене	Изменения нуклеотидов
1	#18774	chr7:128255051	G > C
2	#18815	chr7:128255092	G > C
3	#18404	chr7:128254681	C > G

 

Из семи полиморфизмов, зарегистрированных в NCBI, два SNP rs7788818, получится (rs3828942; rs7788818) идентифицированы во всех группах исследования, два 3 SNP выявлено только в основной группе, из них один – в группе русских (rs28954118), один – в группе бурят (rs759854910), а также три SNP обнаружены только в контрольной группе у подростков бурят (rs144755411, rs199893150, rs917105894). Так, альтернативный A-аллель полиморфизма rs3828942 был выявлен во всех группах исследования, его частота оказалась выше частоты референсного аллеля. В основной группе частота A-аллеля rs3828942 составила 50 и 77% у русских и бурят соответственно, в группе контроля – 70 и 89% у русских и бурят соответственно. G-аллель rs7788818 также был идентифицирован во всех группах исследования, его частота оказалась выше частоты референсного аллеля. T-аллель rs28954118 идентифицирован только у русских подростков основной группы, его частота составила 10%, в то время как C-аллель rs759854910 с частотой 3% обнаружен у подростков бурят основной группы. В контрольной группе идентифицировано три SNP, которые выявлены у подростков бурят. Частота T-аллеля rs144755411 составила 18%, частоты альтернативных аллелей rs199893150 и rs917105894 совпадают и соответствуют 5%.

Три SNP, идентифицированные нами в гене LEP и не зарегистрированные в базе NCBI, обнаружены только в группе подростков с избыточной массой тела и ожирением. Каждая из замен была выявлена по одному разу, в том числе две замены в группе русских и одна в группе бурят.

ОБСУЖДЕНИЕ

В современном динамично развивающемся мире усиливается влияние процессов глобализации, миграции и урбанизации населения, которые влияют на изменение традиционного рациона [18]. Эти изменения сопровождаются метаболическими нарушениями, которые в свою очередь могут приводить к ожирению. Полиморфизм генов, вовлеченных в механизм контроля массы тела и аппетита, может повышать риск нарушений регуляции пищевого поведения, в том числе у детей, и приводить к развитию экзогенно-конституционального ожирения [19]. В связи с этим поиск полиморфных локусов генов, ассоциированных с данным патологическим состоянием, является перспективным направлением научных исследований, так как может быть использован для оптимизации подходов к ранней профилактике заболеваний и при формировании групп риска.

В рамках решения цели настоящего исследования были подобраны условия для проведения амплификации фрагмента гена LEP протяженностью 3878 п. н. и проведено секвенирование этого участка гена. В изученном фрагменте гена LEP нами было выявлено 10 SNP, из них три не зарегистрированы и семь зарегистрированы в базе NCBI, из которых для трех полиморфизмов в базе данных ClinVar показана связь с клиническими фенотипами. Наиболее изученным из этих трех полиморфизмов является rs3828942, для которого в поисковой системе PubMed на апрель 2024 г. имеется 15 публикаций [20], в пяти из которых показана связь этого полиморфизма с заболеваниями [21]. В исследованиях показана ассоциация полиморфизма rs3828942 с более высоким ИМТ у подростков с ожирением [22], формированием метаболического синдрома у пациентов с шизофренией, принимающих нейролептики [23, 24], возникновением тревожных расстройств у женщин [25] и плохим качеством сна у больных СПИД/ВИЧ [26].

Частота альтернативного A-аллеля rs3828942 в среднем в мировой популяции (n = 40646), по данным NSBI, составляет 0.41, в европейской популяции (n = 33072) – 0.44, в азиатской (n = 128) – 0.76. Данные о более высокой частоте A-аллеля rs3828942 у жителей Азии (по сравнению с европейцами) согласуется с результатами нашего исследования. Так, в группах русских подростков основной и контрольной групп его частота составила 50 и 70% соответственно, в то время как у подростков бурят основной и контрольной групп – 77 и 89% соответственно.

Два других полиморфизма (rs28954118 и rs759854910) изучены меньше, по ним отсутствуют публикации в PubMed, клиническая значимость в ClinVar оценена как неопределенная. По данным NCBI, частота альтернативного T-аллеля rs28954118 в среднем в мировой популяции (n = 21484) составляет 0.023, в европейской популяции (n = 16894) – 0.028, у азиат (n = 114) T-аллель не обнаружен. Эти данные также согласуются с результатами нашего исследования, T-аллель rs28954118 с частотой 10% обнаружен в группе русских подростков основной группы, среди подростков бурят T-аллель не идентифицирован. Частота альтернативного С-аллеля rs759854910 в среднем в мировой популяции (n = 18532) очень низкая и составляет 0.00005, в европейской популяции (n = 13348) – 0.00007, в азиатской популяции (n = 112) С-аллель не обнаружен. В нашем исследовании С-аллель rs759854910 был обнаружен только у подростков бурят основной группы с частотой 3% и не был идентифицирован у русских подростков.

Таким образом, секвенирование фрагмента гена LEP в выборке подростков с избыточной массой тела и ожирением позволило идентифицировать 10 SNP, семь из которых зарегистрированы в NSBI, а три не зарегистрированы. В настоящем исследовании впервые в мире идентифицированы полиморфные варианты гена лептина у подростков с избыточной массой тела и ожирением: у русских – chr7:128255051 (G>C), chr7:128255092 (G>C), у бурят – chr7:128254681 (C>G). Из семи SNP, идентифицированных в группах исследования и зарегистрированных в NSBI, только для одного (rs3828942) в PubMed имеются публикации, демонстрирующие связь этого полиморфизма с клиническими фенотипами. Данные о клинической значимости других SNP, идентифицированных нами, недостаточны. Поэтому поиск ассоциации выявленных нами SNP с ожирением у подростков двух этнических групп является актуальным и станет темой наших дальнейших исследований.

 

Данная работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Центр разработки прогрессивных персонализированных технологий здоровья» ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ, г. Иркутск.

Работа выполнена в рамках госбюджетной темы «Ключевые закономерности и механизмы формирования нарушений здоровья детей и подростков как основа персонализированного подхода к диагностике, лечению и профилактике в современной педиатрии» (шифр темы 0416-2021-001, (регистрационный номер в ЕГИСУ №121022500178-3).

Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» 02.12.2015 г., протокол заседания № 6.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие: в случае, если возраст обследуемого меньше 14 лет, информированное добровольное согласие получено от родителей, если возраст обследуемого 14 лет и больше – от самого обследуемого.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Sobre autores

E. Belyaeva

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Autor responsável pela correspondência
Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

T. Bairova

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

O. Ershova

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

A. Sambyalova

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

V. Sinkov

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

V. Balzhieva

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

L. Rychkova

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

L. Kolesnikova

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: belyeva_irk@mail.ru
Rússia, Irkutsk, 664003

Bibliografia

Arquivos suplementares