Molecular Domestication of TLEWI DNA Transposons: Evidence and Contradictions

Texto integral

За последние десятилетия были прочитаны последовательности геномной ДНК нескольких десятков тысяч видов эукариот. Мобильные генетические элементы (МГЭ) были обнаружены в каждом секвенированном геноме. МГЭ – последовательности ДНК, имеющие характерную структуру, которая может включать прямые или инвертированные повторы, кодирующие и регуляторные последовательности. Структурные особенности МГЭ позволяют им перемещаться из локуса в локус в пределах одного и того же генома (клетки) [1, 2]. В зависимости от механизма транспозиции МГЭ эукариот делят на классы – ретротранспозоны и ДНК-транспозоны, каждый класс подразделяется на подклассы, надсемейства, семейства и т.д. [2, 3]. Некоторые МГЭ (например, эндогенные ретровирусы) имеют в своей структуре последовательности, позволяющие перемещаться из клетки в клетку [2]. Кроме того, известны случаи горизонтального переноса МГЭ между организмами [4].

Способность МГЭ к перемещениям определяет ряд их биологических функций. Так, МГЭ являются одним из основных факторов эволюции, поскольку служат постоянным источником изменчивости. Они могут вызывать как небольшие нуклеотидные изменения (короткие инсерции), так и протяженные хромосомные перестройки [1, 2]. Инсерции МГЭ подвергаются естественному отбору: мутации, влекущие снижение приспособленности хозяина, будут исчезать из популяции, в то время как нейтральные могут сохраняться, а полезные мутации даже закрепляться [5–7]. Также на МГЭ влияют и другие эволюционные процессы, например, генетический дрейф, в результате которого доля инсерционных мутаций может снижаться вплоть до полного исчезновения или возрастать и закрепляться в популяции. Параллельно с вовлеченностью в эволюционные процессы, связанные с хозяином, МГЭ амплифицируются и эволюционируют также внутри генома хозяина. Существует конкуренция между МГЭ – элементы, способные производить много копий, имеют больше шансов колонизировать геном и популяцию, чем те, активность которых снижена. В результате взаимодействия МГЭ и генома возникли сложные механизмы регуляции активности элементов [8]. Кроме того, известно явление молекулярного одомашнивания, в результате которого компоненты МГЭ могут стать функциональной единицей генома [8, 9].

МГЭ, прошедшие молекулярное одомашнивание, как правило, теряют вспомогательные структуры (прямые и инвертированные повторы). Кооптированные гены присутствуют в геноме в виде единственной копии (фрагмента). Ортологи таких генов могут быть обнаружены у нескольких видов [10]. На данный момент описано достаточно много генов, которые являются производными МГЭ, хотя функции многих из них остаются неясны [11]. Например, гены Rag1 и Rag2 (потомки ДНК-транспозонов), являются ключевыми компонентами специфического иммунитета и катализируют рекомбинацию V(D)J [12, 13]. Ген SETMAR приматов кодирует химерный белок (каталитический домен заимствован у транспозазы МГЭ mariner), участвующий в механизмах репарации ДНК, включая негомологическое соединение концов и восстановление двухцепочечных разрывов [14]. Также известна конвергентная кооптация pogo-подобных транспозаз, в результате которой организмы получили специфические центромера-связывающие факторы [15].

К-транспозоны подсемейства TLEWI (входящие в группу IS630/Tc1/mariner) были выявлены у двустворчатых моллюсков [16]. Эти МГЭ имели одиночные полноразмерные копии, утеряли концевые инвертированные повторы (КИП) и содержали сплайсосомные интроны в кодирующей транспозазу последовательности. Для некоторых TLEWI-транспозонов были выявлены транскрибируемые последовательности РНК, в которых интронные области были удалены. Это может указывать на возможную функциональность гена. С учетом особенностей представителей TLEWI было высказано предположение относительно возможного их одомашнивания геномами моллюсков [16].

В настоящем исследовании мы предприняли попытку выяснить, являются ли гены TLEWI-транспозаз одомашненными. В ходе работы мы провели сравнение представителей TLEWI-транспозонов в пяти сборках геномной ДНК разных особей тихоокеанской устрицы Crassostrea (Magallana) gigas (Thunberg, 1793). Также мы провели анализ дифференциальной экспрессии генов TLEWI с целью установить возможную зависимость от стадий развития, типа тканей и внешних воздействий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поиск и анализ последовательностей TLEWI-транспозонов

Поиск ДНК-транспозонов подсемейства TLEWI осуществлялся с помощью BLAST [17]. В качестве шаблона использовались кодирующие транспозазу последовательности элементов TLEWI-1_CGi, TLEWI-2_CGi, TLEWI-3_CGi, TLEWI-4_CGi, TLEWI-5_CGi, которые были описаны ранее [16]. Сборки нуклеотидных последовательностей геномной ДНК устрицы C. gigas были взяты в коллекциях NCBI WGS (https://www.ncbi.nlm.nih.gov//). Для удобства они были обозначены CGi(I), CGi(II), CGi(III), CGI(IV) и CGI(V) (табл. 1).

 

Таблица 1. Геномные сборки тихоокеанской устрицы C. gigas, использованные в анализе

№ п/п	Идентификатор	Дата публикации	Линия	Уровень сборки / геномный охват	Размер генома / количество компонентов	Scaffold N50
CGi(I)	GCA_902806645	19.02.2020	F23_Roslin	Chromosome / 70.0x	647,9 млн п. н. / 236	1,6 млн п. н.
CGi(II)	GCA_011032805	27.02.2020	QD	Chromosome / 196.0x	586,9 млн п. н. / 10	61,0 млн п. н.
CGi(III)	GCA_025765685	20.10.2022	CH1-GI (China: Qingdao)	Chromosome / 70.0x	606,4 млн п. н. / 88	60,5 млн п. н.
CGi(IV)	GCA_005518195	16.12.2019	BHY1A (China: The Bohai Sea)	Contig / 85.6x	587,5 млн п. н. / 3676	581,9 т. п. н.
CGi(V)	GCA_000297895	08.08.2019	05x7-T-G4-1.051#20	Scaffold / 196.0x	564,8 млн п. н. / 7655	286,9 т. п. н.

 

Для определения границ полноразмерных (репрезентативных) элементов гомологии с наилучшим сходством к шаблону извлекались вместе с фланкирующими последовательность участками протяженностью 3000 п. н. КИП выявляли с помощью BLASTn [17]. Границы открытой рамки считывания (ОРС) и экзонов определялись визуально, исходя из наибольшей гомологии с шаблоном и наличием специфичных сайтов сплайсинга GT/AG Количество копий TLEWI-транспозонов определяли подсчетом выявленных в геномных сборках гомологов репрезентативной копии с использованием BLASTn [17]. При подсчете копий учитывались последовательности длиной не менее 300 п. н. Копии, соразмерные репрезентативным элементам и содержащие соответствующее шаблону число экзонов, считали полноразмерными.

Филогенетический анализ

В филогенетический анализ были включены аминокислотные последовательности всех описанных элементов TLEWI тихоокеанской устрицы (табл. 2), а также представителей семейств Tc1 и Mosquito. Множественное выравнивание было выполнено с помощью MAFFT с применением метода G-INS-I [18]. Филогенетическое дерево было создано с использованием метода максимального правдоподобия в программе IQ-TREE [19] со сверхбыстрым бутстреп-анализом (UFBoot) – 1000 повторов [20], а модель VT+F+I+G4 была выбрана с помощью ModelFinder [21].

Анализ транскрипционной активности

Оценка дифференциальной экспрессии генов, кодирующих транспозазу, была выполнена с помощью совместного использования программ Kallisto (v0.46.1) и Sleuth (v0.30.0) [22]. Реализованный в Kallisto метод псевдовыравнивания архивов коротких нуклеотидных последовательностей (SRA) и полноразмерных транскриптов позволяет подсчитывать количество содержания РНК конкретного гена в образце, которое выражается в величине TPM (транскриптов на миллион п. н.). Далее с помощью Sleuth на основе предварительных количественных оценок, полученных с помощью Kallisto, создается нормализованная на уровне генов матрица TPM. В качестве референсных транскриптов использовался набор полноразмерных транскрибированных последовательностей устрицы GIUV00000000.1 из GenBank. В качестве материала для исследования были использованы SRA транскриптомов, размещенных в свободном доступе в коллекциях NCBI. Полный список проектов, в рамках которых проводилось секвенирование транскриптомных последовательностей, представлен в дополнительных материалах (Доп. мат. 1).

Из полученных результатов извлекались данные дифференциальной экспрессии генов пяти элементов TLEWI. Кроме того, в качестве контроля транскрипционной активности в образцах в анализ были взяты гены домашнего хозяйства mdh1 (кодирует цитоплазматическую малатдегидрогеназу), hprt1 (кодирует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу), tubb (кодирует цитоскелетный белок тубулин) и gft2e1 (кодирует субъединицу общего фактора транскрипции IIE). Данные визуализировались в виде тепловых карт. SRA группировали в зависимости от факторов воздействия на образцы, стадий онтогенеза устрицы и типа тканей. По интенсивности окрашивания ячеек проводился сравнительный анализ уровня транскрипционной активности. Были введены семь визуально различимых категорий: отсутствие (нет), очень слабый (о/сл), слабый (сл), средне- слабый (ср/сл), средний (ср), средне-сильный (ср/сил) и сильный (сил). Для описания динамики экспрессии были введены следующие категории: с зависимостью от условий (СЗ – экспрессия гена присутствует практически во всех точках и наблюдается очевидная тенденция изменения уровня активности), постоянная без зависимости от условий (ПБЗ – экспрессия гена присутствует практически во всех точках, но нет очевидного изменения уровня активности) и мозаичная (М – экспрессия гена проявляется случайным образом).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Представленность транспозонов TLEWI в геноме пяти особей тихоокеанской устрицы

Для выявления ДНК-транспозонов TLEWI в сборках геномных последовательностей Crassostrea gigas в качестве образца были использованы кодирующие последовательности TLEWI-1_CGi, TLEWI-2_CGi, TLEWI-3_CGi, TLEWI-4_CGi, TLEWI-5_CGi. Было изучено пять сборок, которые на момент исследования были представлены в базе NCBI (см. табл. 1). Характеристики полноразмерных или наиболее протяженных копий транспозонов TLEWI, полученные в результате исследования, были объединены в табл. 2. Для обозначения принадлежности копии к конкретной сборке после названия элемента в скобках указывали номер сборки. Для обозначения описываемой копии внутри сборки после номера элемента через точку добавляли номер копии. Например, обозначение TLEWI-1.2_CGi(IV) означает «вторая копия элемента TLEWI-1_CGi в полногеномной сборке CGi(IV)».

В пяти исследованных сборках устрицы было выявлено от 5 до 12 копий транспозона TLEWI-1_CGi, среди которых было 11 полноразмерных (см. табл. 2). В сборках CGi(I), CGi(III), CGi(IV), CGi(V) обнаружено по две полноразмерных копии, тогда как в CGi(II) найдено три. Выявленные элементы имели длину от 2716 до 3790 п. н., кроме элемента TLEWI-1.2_CGi(IV), длина которого составила 7120 п. н. Длина TLEWI-1_CGi, описанного ранее [16], была 3749 п. н. Размер транспозазы у большинства копий варьировал от 347 до 355 а. о. Исключение составил TLEWI-1.2_CGi(IV), у которого длина транспозазы была несколько больше (391 а. о.). Увеличение протяженности TLEWI-1.2_CGi(IV) явилось результатом вставки и в один из интронов, и в кодирующую последовательность. У большинства копий TLEWI-1_CGi были выявлены сдвиги в открытой рамке считывания (ОРС). В ОРС копий TLEWI-1.2_CGi(II), TLEWI-1.3_CGi(II), TLEWI-1.1_CGi(III) в четвертом экзоне наблюдается нарушение последовательности, в результате которого в области второго маркерного остатка (аспартат, D) каталитического домена был потерян серин (DNDSKH). Копии TLEWI-1.1_CGi(I) и TLEWI-1.2_CGi(III) имеют визуально неповрежденную ОРС и могут быть функциональными. У копий TLEWI-1.1_CGi(II), TLEWI-1.2_CGi(II), TLEWI-1.3_CGi(II), TLEWI-1.1_CGi(III), TLEWI-1.2_CGi(III) был обнаружен один концевой инвертированный повтор, что было показано и для TLEWI-1_CGi, описанного ранее [16].

В результате поиска транспозона TLEWI-2_CGi было выявлено семь полноразмерных копий. В сборках CGi(I), CGi(III), CGi(IV), CGi(V) было обнаружено по одной такой копии, в CGi(II) – три копии. Длина последовательностей варьировала от 1575 до 2540 п. н. при референсном значении – 2160 п. н. [16]. Ни у одной из копий КИП обнаружены не были. Длина транспозазы была от 351 до 353 а. о. У трех копий (TLEWI-2.1_CGi(I), TLEWI-2.1_CGi(IV), TLEWI-2.1_CGi(V)) кодирующая последовательность имела повреждения (стоп-кодоны, сдвиги и разрывы). У остальных копий транспозаза визуально интактная и, возможно, функциональная. (см. табл. 2). Копия TLEWI-2.1_CGi(IV) имела сдвиг рамки считывания, в результате которого количество аминокислотных остатков между вторым маркерным остатком (аспартат, D) и третьим (глутамат, E) составило 35. Общее количество копий транспозона TLEWI-2_CGi в пяти сборках варьировало от 1 до 4.

В четырех сборках было выявлено по одной полноразмерной копии транспозона TLEWI-3_CGi. Не имела полноразмерного варианта только сборка CGi(IV). Полноразмерные копии имели существенные различия по протяженности. TLEWI-3.1_CGi(III) (2476 п. н.) была значительно короче референсной последовательности TLEWI-3_CGi, описанной ранее (5498 п. н.) [16]. Копия TLEWI-3.1_CGi(I) имела длину 4047 п. н. У TLEWI-3.1_CGi(II) и TLEWI-3.1_CGi(V) длина транспозона была увеличена вследствие вставок в некодирующие части (интроны) и составила 6947 и 20759 п. н. соответственно. Размеры транспозаз составили 232–416 а. о. Только две копии (TLEWI-3.1_CGi(II), TLEWI-3.1_CGi(III)) имели визуально неповрежденную транспозазу, что предполагает сохранение функциональности. У TLEWI-3.1_CGi(III) и TLEWI-3.1_CGi(IV) было выявлено по одному концевому инвертированному повтору. Классический каталитический домен был сохранен у трех копий – TLEWI-3.1_CGi(II), TLEWI-3.1_CGi(III), TLEWI-3.1_CGi(V). У двух других – TLEWI-3.1_CGi(I) и TLEWI-3.1_CGi(IV), имелись видимые отличия, а именно – у TLEWI-3.1_CGi(I) второй аспартат (D) был замещен на аспарагин (N), а у TLEWI-3.1_CGi(IV) сохранился только первый аспартат (D), при этом области второго и третьего маркерных оснований были утрачены. Общее количество копий транспозона TLEWI-3_CGi варьировало от 1 до 3 (см. табл. 2).

 

Таблица 2. Полноразмерные и репрезентативные копии транспозонов TLEWI, описанные у тихоокеанской устрицы C. gigas

Транспозон	Копия	Длина, пн	КИП, пн	Транспозаза, а. о.	Паттерн каталитического домена	Количество копий*
TLEWI-1_CGi	TLEWI-1.1_GGi(I)	3790	–	347	D87G36E	12(2)
	TLEWI-1.2_CGi(I)	3178	–	351	D87D36E
	TLEWI-1.1_CGi(II)	3097	30	351	D87G36E	7(3)
	TLEWI-1.2_CGi(II)	2751	30	347	D87D35E
	TLEWI-1.3_CGi(II)	2716	30	347	D87D35E
	TLEWI-1.1_CGi(III)	2719	30	347	D87D35E	5(2)
	TLEWI-1.2_CGi(III)	3086	30	347	D87D36E
	TLEWI-1.1_CGi(IV)	3014	–	355	D94D36E	6(2)
	TLEWI-1.2_CGi(IV)	7120	–	391	D87D36E
	TLEWI-1.1_CGi(V)	2720	–	356	D87D36E	9(2)
	TLEWI-1.2_CGi(V)	2312	–	356	D87D36E
TLEWI-2_CGi	TLEWI-2.1_CGi(I)	2534	–	353	D87D36E	1(1)
	TLEWI-2.1_CGi(II)	1575	–	353	D87D36E	4(3)
	TLEWI-2.2_CGi(II)	1580	–	353	D87D36E
	TLEWI-2.3_CGi(II)	1580	–	353	D87D36E
	TLEWI-2.1_CGi(III)	1580	–	353	D87D36E	2(1)
	TLEWI-2.1_CGi(IV)	2540	–	351	D85D35E	2(1)
	TLEWI-2.1_CGi(V)	1579	–	352	D87D36E	1(1)
TLEWI-3_CGi	TLEWI-3.1_CGi(I)	4047	–	343	D89N36E	3(1)
	TLEWI-3.1_CGi(II)	20759	–	378	D89D36E	2(1)
	TLEWI-3.1_CGi(III)	2476	25	343	D89D36E	2(1)
	TLEWI-3.1_CGi(IV)	1610	25	232	D?	1(0)
	TLEWI-3.1_CGi(V)	6947	–	416	D89D36E	3(1)
TLEWI-4_CGi	TLEWI-4.1_CGi(I)	1825	–	275	?D36E	1(0)
	TLEWI-4.1_CGi(II)	1518	–	272	D87D?	1(0)
	TLEWI-4.1_CGi(III)	6148	–	278	S117D36E	4(0)
	TLEWI-4.1_CGi(VI)	1730	–	338	D87D36E	3(1)
	TLEWI-4.1_CGi(V)	1521	–	274	D87D?	2(0)
TLEWI-5_CGi	TLEWI-5.1_CGi(IV)	1454	–	251	D??	1(0)
	TLEWI-5.1_CGi(V)	2006	–	351	D87D36E	1(1)

Примечание. Полужирным курсивом выделены элементы, имеющие потенциально-функциональный ген транспозазы; * – в скобках указано количество полноразмерных копий.

 

При поиске копий транспозона TLEWI-4_CGi единственная полноразмерная копия была обнаружена в сборке CGi(IV) (см. табл. 2). Длина TLEWI-4_CGi по данным предыдущего исследования [16] составляла 2849 пн. Однако, у копии TLEWI-4.1_CGi(IV) протяженность была всего 1730 п. н. вследствие укороченных интронов. Длина транспозазы составляла 338 а. о. Копии в других сборках имели существенные делеции. Ни одна из копий не имела КИП. Несмотря на то, что копия TLEWI-4.1_CGi(IV) полноразмерная, она имеет разрывы кодирующей последовательности и внутренние стоп-кодоны и, по всей видимости, не функциональна. В целом в сборках элемент TLEWI-4_CGi был представлен в количестве от 1 до 4 копий (см. табл. 2).

В пяти исследованных сборках устрицы было выявлено только две копии транспозона TLEWI-5_CGi (в сборках CGi(IV) и CGi(V)), среди которых лишь один полноразмерный вариант (TLEWI-5_CGi(V)) (см. табл. 2). В сборках CGi(I), CGi(II), CGi(III) копий TLEWI-5_CGi не выявлено. Протяженность TLEWI-5_CGi(V) составляла 2006 п. н. Ни у одной копии КИП не были обнаружены. Транспозаза TLEWI-5.1_CGi(V) (длина 351 а. о.) не имела явных повреждений и, по-видимому, может быть функциональной. В каталитическом домене TLEWI-5.1_CGi(IV) был утерян фрагмент, содержащий второй (D) и третий (E) маркерный остаток.

Таким образом, мы наблюдаем очевидную вариабельность по количеству и качеству копий транспозонов TLEWI у пяти особей устрицы. Несмотря на то, что многие копии имеют делеции и нарушения кодирующей последовательности, сохраняются и визуально неповрежденные варианты. Четыре элемента, как минимум в одной из сборок, сохранили потенциально-функциональный ген транспозазы. Исключением является TLEWI-4_CGi, для которого не было выявлено ни одной потенциально-функциональной копии. На выявленные различия в представленности транспозонов TLEWI у разных особей устрицы, несомненно, влияет качество секвенирования и сборки геномной ДНК. В результате неполного секвенирования и недостаточно качественной сборки можно получить ложноотрицательные результаты. Однако каждая из пяти сборок имеет удовлетворительные характеристики. Также и полученные в ходе исследования результаты (наличие элементов, количество копий) не дают оснований предполагать, что какая-то из сборок имеет более низкое качество.

Эволюционное разнообразие транспозонов TLEWI тихоокеанской устрицы

В филогенетический анализ были включены аминокислотные последовательности, кодируемые ОРС всех копий, приведенных в табл. 2. В качестве внешней группы были взяты транспозазы элементов семейства Tc1 и Mosquito (рис. 1).

 

Рис. 1. Филогенетическое разнообразие транспозонов TLEWI тихоокеанской устрицы. Бутстреп-значения менее 50% на дендрограмме не указаны. В анализе использовались 38 аминокислотных последовательностей, протяженность выравнивания 493 а. о.

 

Все копии элементов TLEWI сформировали единую кладу с бутстреп-поддержкой 100%. Транспозоны внутри клады с высокой достоверностью (от 75 до 100%) расположились в том же порядке, как и в предыдущем исследовании [16]. Согласно полученной эволюционной модели, TLEWI-5_CGi является более рано дивергировавшим вариантом. Затем ответвляется TLEWI-3_CGi, после него – TLEWI-1_CGi, и наибольшее сходство продемонстрировали TLEWI-2_CGi и TLEWI-4_CGi (см. рис. 1). Копии транспозона TLEWI-1_CGi сформировали два кластера, в каждом из которых присутствуют копии из всех пяти исследованных особей, что может свидетельствовать о формировании двух независимых линий транспозонов, эволюция которых началась до обособления вида C. gigas.

Транскрипционная активность гена транспозазы элементов TLEWI

Оценка дифференциальной экспрессии гена транспозазы элементов TLEWI была проведена с использованием SRA – транскриптомов, полученных из различных тканей устрицы, из особей на разных стадиях развития и из особей, подвергнутых воздействию различных факторов, извлеченных из коллекций NCBI (табл. 3, Доп. мат. 1). В анализ транскрипционной активности был взят ген транспозазы всех пяти транспозонов TLEWI. В предыдущем исследовании были найдены потенциально-функциональные копии гена транспозазы и его полноразмерные транскрипты только для элементов TLEWI-1_CGi, TLEWI-2_CGi и TLEWI-3_CGi [16]. В настоящем исследовании в одной из сборок мы обнаружили копию TLEWI-5_CGi без очевидных нарушений, поэтому взяли ген этого элемента в анализ.

Несмотря на то, что не было обнаружено неповрежденных последовательностей TLEWI-4_CGi, ген транспозазы TLEWI-4_CGi также был включен в анализ, поскольку мы допустили, что у особей, материал которых был использован в анализе транскриптомов, может присутствовать потенциально-функциональный вариант. В качестве контроля качества образцов были взяты гены gtf2e1 (кодирует субъединицу общего фактора транскрипции IIE), mdh1 (кодирует фермент энергетического обмена цитоплазматическую малатдегидрогеназу), hprt1 (кодирует фермент пуринового обмена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтраснферазу) и tubb (кодирует цитоскелетный белок тубулин). В результате анализа данных не было выявлено транскрипции контрольных генов в группах PRJNA154615.1 и PRJNA154615.2 (см. табл. 3), хотя в некоторых тканях наблюдалась активность генов транспозонов. В гонадах выявлена транскрипция гена транспозазы TLEWI-1_CGi, TLEWI-3_CGi и TLEWI-4_CGi. В пищеварительной железе отмечается активность TLEWI-2_CGi, TLEWI-3_CGi и TLEWI-4_CGi, в мантии – TLEWI-2_CGi и TLEWI-4_CGi, а в мышце – TLEWI-1_CGi (см. табл. 3).

 

Таблица 3. Транскрипционная активность генов транспозазы элементов TLEWI в различных тканях в ходе онтогенеза и при воздействии стрессирующих факторов

Условия	Элементы
	TLEWI-1_CGi	TLEWI-2_CGi	TLEWI-3_CGi	TLEWI-4_CGi	TLEWI-5_CGi
Воздух и голод, жабры PRJNA146329.7	М (сл–ср)	М (оч/сл–ср)	М (сл–ср)	Нет (одно исключение– сл)	М (оч/сл–ср)
Воздух и голод, мышцы PRJNA146329.7	ПБЗ (оч/сл–ср/сил)		ЗУ (ср–ср/сл–оч/сл)	М (оч/сл–сл)
Соленость, жабры PRJNA146329.8	М (сл–ср/сил)	ЗУ (оч/сл–ср–выкл)	М (ср/сл–ср)	М (оч/сл–ср/сл)	М (оч/сл–сил)
Соленость, жабры PRJNA167099	ПБЗ (ср–ср/сил)	М (сл)	Нет	Нет	М (сл)
Температура, жабры PRJNA146329.9	ЗУ (сл–ср–выкл)	ЗУ (сл–ср–сл)	М (ср/сл–ср/сил)	ПБЗ (оч/сл–ср/сл)	Нет (1 исключение –сл)
Температура, мантия PRJNA316154	ПБЗ (сл–ср/сил)	М (ср/сл–ср)	М (оч/сл–ср/сл)	М (оч/сл–ср/сл)	Нет
Температура, жабры PRJNA407831	М (оч/сл– ср/сл)	ПБЗ (оч/сл–ср/сл) для BYQJ и LTX М (оч/сл–ср/сл) для BYQX и LTJ	ПБЗ (слср/сил)	М (оч/слср/сл)	М (оч/слср/сил)
Температура + инфекция, целый организм PRJNA593309.1, PRJNA593309.2	М (оч/сл–ср)	М (оч/сл–ср/сл)	М (оч/сл–ср/сл)	Нет (одно исключение – оч/сл)	Нет (одно исключение – оч/сл)
Температура + инфекция, целый организм PRJNA593309.3					М (оч/сл–ср)
рН + температура, целый организм PRJNA298285.1	М (сл–ср/сл)	М (оч/сл–ср/сл)	ПБЗ (сл–ср)	Нет	М (оч/сл–ср/сл)
рН + температура, целый организм PRJNA298285.2 – PRJNA298285.4				М (оч/сл–сл)
pH, целый организм PRJNA735889.1 – PRJNA735889.5	М (оч/сл–ср/сил)	М (оч/сл–ср)	М (оч/сл–ср/сил)	М оч/сл–ср/сл)	М (оч/сл–ср/сил)
Стадии, целый организм PRJNA146329.10	ЗУ (ср/сл–ср–выкл)	М (оч/сл–ср/сл)	М (оч/сл–ср)	ЗУ (оч/сл–ср/сл–выкл)	М (оч/сл–сл)
Стадии* PRJNA154615.1	М (ср–сил)	М (оч/сл–ср)	М (ср/сл)	Нет	Нет
Гемолимфа* PRJNA154615.2	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет
Жабры* PRJNA154615.2	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет
Губные щупы* PRJNA154615.2	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет
Мантия* PRJNA154615.2	Нет	ср/сл	Нет	сл	Нет
Приводящая мышца* PRJNA154615.2	ср/сил	Нет	Нет	сл	Нет
Пищеварительная железа* PRJNA154615.2	Нет	ср	ср/сил	Нет	Нет
Гонады (женские)* PRJNA154615.2	ср	Нет	сил	сил	Нет
Остатки* PRJNA154615.2	Нет	Нет	Нет	Нет	Нет

Примечание. * – отсутствовала экспрессия контрольных генов. М – мозаичная; ПБЗ – постоянная без зависимости; ЗУ – зависимая от условий, в скобках указаны диапазоны уровня транскрипционной активности. Уровни транскрипции: очень слабый (оч/сл), слабый (сл), средне-слабый (ср/сл), средний (ср), средне-сильный (ср/сил) и сильная (сил).

 

В ходе исследования была выявлена зависимость уровня транскрипционной активности гена транспозазы TLEWI-1_CGi от стадий онтогенеза устрицы (см. табл. 3, рис. 2). Выявлена динамика экспрессии от средне-слабого уровня на стадии яйца с повышением до среднего уровня (со стадии двухклеточного эмбриона до поздней умбо-1) и последующим ослаблением до полного выключения на стадии педивелигер 2.

 

Рис. 2. Транскрипционная активность гена транспозазы элементов TLEWI тихоокеанской устрицы в процессе развития организма от яйца до ювенильной устрицы.

 

Единичный случай отсутствия транскрипции на стадии ранней морулы мы рассматриваем как артефакт. Также наблюдается зависимость экспрессии в жабрах от температуры: при 5°С слабый уровень, к 15°С нарастает до среднего, затем снижается, и при 25 °С транскрипция уже не выявляется (см. табл. 3, рис. 3).

 

Рис. 3. Транскрипционная активность гена транспозазы элементов TLEWI в жабрах тихоокеанской устрицы после пребывания моллюсков в течение семи дней при различных температурных режимах.

 

Кроме того, выявлена транскрипционная активность различной интенсивности (без очевидной зависимости) при изменении условий содержания (изменение солености воды и сочетанное воздействие голода и обезвоживания), а также при механическом воздействии (повреждение раковины). В остальных случаях экспрессия мозаичная.

Ген транспозазы элемента TLEWI-2_CGi также продемонстрировал зависимость уровня транскрипции от температуры (см. табл. 3, рис. 3). Наблюдается повышение от средне-слабого (5°С) к среднему уровню (10 и 15°С) и последующее снижение к средне-слабому и слабому при 20 и 25°С соответственно. Кроме того, выявлена динамика экспрессии при изменении солености воды (см. табл. 3, рис. 4).

 

Рис. 4. Транскрипционная активность гена транспозазы элементов TLEWI в жабрах тихоокеанской устрицы после 12-часовой экспозиции моллюсков при различной солености.

 

При 5‰ уровень транскрипции слабый. После повышения содержания соли до 10‰ происходит повышения уровня транскрипции до среднего. При дальнейшем повышении концентрации соли уровень снижается до средне-слабого и затем практически исчезает. В условиях высокой температуры в двух из четырех линиях устрицы в жабрах показана транскрипционная активность различной интенсивности (от очень слабой до средне-слабой), но без очевидной зависимости (см. табл. 3). В других экспериментах ген элемента TLEWI-2_CGi транскрибировался мозаично.

Наблюдается зависимость экспрессии гена элемента TLEWI-3_CGi при сочетанном воздействии голода и обезвоживания. До начала воздействия (контроль) и в первые сутки уровень транскрипции средний, затем начинает снижаться до средне-слабого и на 9–11-й день экспрессия практически прекращается (см. табл. 3, рис. 5). Экспрессия без очевидной зависимости от условий наблюдается при анализе ответа гена транспозазы на изменение температуры и комбинированное воздействие температуры и pH (см. табл. 3).

 

Рис. 5. Транскрипционная активность гена транспозазы элементов TLEWI в жабрах и мышцах тихоокеанской устрицы в процессе длительного пребывания без воды и пищи.

 

Ген транспозазы элемента TLEWI-4_CGi так же, как и TLEWI-1_CGi, показал динамику транскрипционной активности в ходе онтогенеза. От очень слабого уровня (яйцо) с постепенным повышением до средне-слабого (умбо 2 – поздняя умбо 1) и последующим понижением до полного отсутствия экспрессии (спат, ювенильная) (см. табл. 3, рис. 2). Также наблюдается постоянная экспрессия различий интенсивности в жабрах, но без очевидной зависимости (см. табл. 3, рис. 3). В остальных экспериментах транскрипционная активность мозаичная или отсутствует. У гена транспозазы элемента TLEWI-5_CGi в большинстве случаев экспрессия мозаичная или отсутствует (см. табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Термин «молекулярное одомашнивание» подразумевает кооптацию последовательности МГЭ, которая становится необходимой для функционирования генома хозяина. Некоторые исследователи предполагают, что молекулярное одомашнивание является итогом коэволюции МГЭ и генома [8, 9]. В результате МГЭ становится эволюционно «бессмертным», в отличие от его деградации и элиминации, которыми, как правило, обычно завершается их жизненный цикл [23, 24]. Известны случаи одомашнивания и среди транспозонов группы IS630/Tc1/mariner (к которым относятся TLEWI). Так, ген приматов SETMAR кодирует химерный белок, который обладает N-концевым доменом гистон-лизин-N-метилтрансферазы и C-концевым доменом морской транспозазы. Белок, кодируемый этим геном, участвует в восстановлении двухцепочечных разрывов [14]. pogo-подобные транспозазы у многоклеточных организмов по меньшей мере трижды были независимо одомашнены в белки, участвующие в создании прицентромерного комплекса [15]. В связи с тем, что TLEWI обладают признаками одомашнивания, а также структурой, сходной с генами эукариот (наличие сплайсосомных интронов), высказывалась гипотеза, что TLEWI двустворчатых моллюсков были одомашнены [25]. Однако потенциально- функциональные гены были обнаружены только у двух видов, поэтому также рассматривался сценарий, в котором ген TLEWI был кооптирован, но затем его функция потеряла актуальность и стала необязательной (нейтральной) для хозяина. В ходе последующей эволюции функциональные аллели сохранились лишь у некоторых представителей группы Pteriomorphia, тогда как нефункциональные ортологи остаются в виде псевдогенов у каждого второго представителя таксона [25].

Исследование пяти особей (сборок) тихоокеанской устрицы показало достаточно широкую вариабельность в представленности транспозонов TLEWI (см. табл. 2). Различия в количестве копий могут быть результатом как внутривидовой вариабельности, так и секвенирования. Тот факт, что потенциально-функциональные гены ни одного из транспозонов TLEWI не обнаруживаются у каждой особи, свидетельствует не в пользу гипотезы молекулярного одомашнивания. Тем не менее три транспозона имеют потенциально-функциональные гены в двух из пяти сборок. Наибольшее количество таких генов выявлено в сборке CGi(III) (см. табл. 2). Транспозон TLEWI-5_CGi был обнаружен только в двух сборках, что согласуется с филогенетическим анализом, согласно которому этот элемент является более древним (см. рис 1). Таким образом, представители тихоокеанской устрицы демонстрируют внутривидовую гетерогенность по количеству и качеству транспозонов TLEWI (см. табл. 2), что может свидетельствовать об активных эволюционных процессах.

Анализ транскрипционной активности также не дал однозначного результата. TLEWI-5_CGi оказался единственным элементом, который во всех экспериментах показал случайную экспрессию (см. табл. 3). Наиболее «активным» оказался транспозон TLEWI-1_CGi. Четыре из пяти транспозонов TLEWI в отдельных случаях демонстрировали экспрессию, зависимую от условий, а также устойчивую экспрессию без очевидной динамики. При этом в ходе анализа экспрессии в процессе онтогенеза было изучено около 40 контрольных точек, и два гена TLEWI продемонстрировали стадий-зависимую динамику уровня транскрипции (см. рис 3). Мы считаем, что эти данные достаточно достоверно отображают поведение TLEWI-1_CGi и TLEWI-4_CGi в ходе развития устриц от яйца до взрослого организма. Также активность гена транспозазы TLEWI может меняться при изменении температуры и солености и в ходе регенеративных процессов. В то же время для одного и того же элемента (например, TLEWI-1_CGi) наблюдается при сравнительно идентичных условиях/тканях как стабильная экспрессия, так и ее отсутствие (мозаичная).

Мы считаем, что в результатах анализа дифференциальной экспрессии столкнулись с тем же явлением, которое наблюдали при исследовании представленности элементов в пяти сборках. Очевидно, что внутривидовая гетерогенность тихоокеанских устриц является причиной противоречивых результатов и в оценке транскрипционной активности.

Известно, что индукцию транспозиционной активности МГЭ могут вызывать достаточно широкий спектр воздействий, как внутриклеточных, так и внешних. Среди них: высокие и низкие температуры, уровень pH, ультрафиолетовое излучение, магнитные поля, гамма-радиация, различные химические соединения, аутбридинг, инбридинг, инфекции, голодание и др. [26–28]. Предполагается, что активация транскрипции и транспозиции МГЭ может быть основной реакцией геномов на генетические и экологические стрессы, представляя собой, таким образом, мощный адаптивный ответ [28]. Некоторые МГЭ могут экспрессироваться на высоком уровне в эмбриональных стволовых клетках, но подавляются в ходе дифференцировки клеток [29]. Также экспрессия МГЭ неоднократно была выявлена в связи с различными патологиями, включая нейродегенеративные и возрастные заболевания, а также рак [30, 31]. В связи с этим наличие транскрипционной активности само по себе не может быть признаком молекулярного одомашнивания. Однако характер экспрессии может позволить сделать такие предположения. Если бы во всех случаях наблюдалась мозаичная (случайная) экспрессия генов транспозаз TLEWI, мы бы могли утверждать, что транспозоны подсемейства TLEWI не были одомашнены. Однако продолжительная транскрипционная активность в ходе онтогенеза (дифференцировки клеток), на наш взгляд, может свидетельствовать об обратном. Поскольку тихоокеанская устрица является экономически значимым объектом, несомненно, что количество данных будет неуклонно расти. Анализ более широкого числа особей и прямые эксперименты позволят разрешить выявленные противоречия.

 

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №23-26-00154, https://rscf.ru/project/23-26-00154/. Название проекта: «ДНК-транспозоны IS630/Tc1/mariner тихоокеанских устриц Crassostrea gigas: вклад в генетическую нестабильность и влияние на генетическое разнообразие».

Исследование одобрено Этическим комитетом Федерального исследовательского центра «Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского», (05.02.2024 г., протокол № 1).

Все применимые международные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Дополнительный материал

Sobre autores

M. Puzakov

Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas, Russian Akademy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: puzakov.mikh@yandex.ru
Rússia, Sevastopol, 299011

L. Puzakova

Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas, Russian Akademy of Sciences

Email: puzakov.mikh@yandex.ru
Rússia, Sevastopol, 299011

Y. Ulupova

Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas, Russian Akademy of Sciences

Email: puzakov.mikh@yandex.ru
Rússia, Sevastopol, 299011

Bibliografia

Arquivos suplementares