Advances in Chemical PhysicsAdvances in Chemical PhysicsФизиология растений0015-33033034-624XThe Russian Academy of Sciences26948210.31857/S0015330324050105MMAIBUЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleОсобенности экспрессии eGFP гена у транспластомных растений табака Nicotiana tabacum L. CV. Petit havanaОсобенности экспрессии eGFP гена у транспластомных растений табака Nicotiana tabacum L. CV. Petit havanaСидорчукЮ. В.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruБелавинП. А.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruЗагорскаяА. А.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruМаренковаТ. В.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruКузнецовВ. В.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruХайрулинаЕ. С.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruДейнекоЕ. В.
Russian Federation
sidorch@bionet.nsc.ruФедеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук15092024715Генетическая инженерия растений – достижения и перспективы6206311111202411112024Copyright ©; 2024, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2024, Российская академия наук2024Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.rcsi.science/0015-3303/article/view/269482

Методом биобаллистики получены транспластомные растения табака, экспрессирующие репортерный ген egfp и ген селективного маркера aadA в составе бицистронного оперона. Исследованы особенности экспрессии гена egfp в двух группах транспластомных растений: семенного потомства, полученного от самоопыления, и растений, полученных в результате двух последовательных циклов регенерации из листьев исходных трансформантов. Проведен сравнительный флуориметрический анализ накопления рекомбинантного белка в группах транспластомных растений и ядерных трансформантов. Установлено, что количество рекомбинантного белка eGFP, накапливаемого в листьях транспластомных растений, оказалось неожиданно низким и не превышало уровня установленного для ядерных трансформантов. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что низкий уровень накопления рекомбинантного eGFP не связан c низким уровнем экспрессии трансгена или с присутствием в хлоропластах нетрансгенных копий пластидного генома. Вероятнее всего, это связано с ограничениями, налагаемыми на уровне трансляции рекомбинантных белков в хлоропластах.

Методом биобаллистики получены транспластомные растения табака, экспрессирующие репортерный ген egfp и ген селективного маркера aadA в составе бицистронного оперона. Исследованы особенности экспрессии гена egfp в двух группах транспластомных растений: семенного потомства, полученного от самоопыления, и растений, полученных в результате двух последовательных циклов регенерации из листьев исходных трансформантов. Проведен сравнительный флуориметрический анализ накопления рекомбинантного белка в группах транспластомных растений и ядерных трансформантов. Установлено, что количество рекомбинантного белка eGFP, накапливаемого в листьях транспластомных растений, оказалось неожиданно низким и не превышало уровня установленного для ядерных трансформантов. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что низкий уровень накопления рекомбинантного eGFP не связан c низким уровнем экспрессии трансгена или с присутствием в хлоропластах нетрансгенных копий пластидного генома. Вероятнее всего, это связано с ограничениями, налагаемыми на уровне трансляции рекомбинантных белков в хлоропластах.

гомоплазмияпластидырекомбинантные белкитранспластомные растениятрансформациятранзиентная экспрессияхлоропластыРоссийский Научный ФондRussian Science Foundation23-24-00545Meyers B., Zaltsman A., Lacroix B., Kozlovsky S.V., Krichevsky A. Nuclear and plastid genetic engineering of plants: comparison of opportunities and challenges // Biotechnol. Adv. 2010. V. 28. P. 28747. https:doi:10.1016/j.biotechadv.2010.05.022Rozov S.M., Sidorchuk Yu.V., Deineko E.V. Transplastomic plants: problems of production and their solution. // Russ. J. Plant Physiol. 2022. V. 69. P. 132. https:doi.org/10.1134/S1021443722020157Oey M., Lohse M., Kreikemeyer B., Bock R. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic // Plant J. 2009. V. 57. P. 436. https:doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03702.xScotti N., Cardi T. Transgene-induced pleiotropic effects in transplastomic plants // Biotechnol Lett. 2014. V. 36. P. 229. https:doi 10.1007/s10529-013-1356-6Fuentes P., Armarego-Marriott T., Bock R. Plastid transformation and its application in metabolic engineering // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. V. 49. P. 10. https:doi.org/10.1016/j.copbio.2017.07.004Jensen P.E., Scharff L.B. Engineering of plastids to optimize the production of high-value metabolites and proteins // Curr. Opin. Biotechnol. 2019. V. 59. P. 8. https:doi.org/10.1016/j.copbio.2019.01.009Bock R. Transplastomic approaches for metabolic engineering // Curr. Opin. Plant Biol. 2022. V. 66. Р. 102185. https:doi.org/10.1016/j.pbi.2022.102185Daniell H., Lin Ch.-S., Yu M., Chang W.-J. Chloroplast genomes: diversity, evolution, and applications in genetic engineering // Genome Biol. 2016. V. 17. Р. 134. https:doi.org/10.1186/s13059-016-1004-2Yu Y., Yu P.-C., Chang W.-J., Yu K., Lin C.-S. Plastid transformation: how does it work? Can it be applied to crops? What can it offer? // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. Р. 4854. https:doi.org/10.3390/ijms21144854Bock R. Engineering plastid genomes: methods, tools, and applications in basic research and biotechnology // Ann. Rev. Plant Biol. 2015. V. 66. P. 211. https:doi.org/10.1146/annurev-arplant-050213-040212Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473. https:doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.xHorsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Lloyd A., Hoffmann N. Inheritance of functional foreign genes in plants // Sci. 1984. V. 223. P. 496. https:doi:10.1126/science.223.4635.496Allen G., Flores-Vergara M., Krasynanski S., Kumar S., Thompson W.F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethylammonium bromide // Nat. Protoc. 2006. V. 1. P. 2320. https:doi.org/10.1038/nprot.2006.384Drescher A., Ruf S., Calsa T.Jr., Carrer H., Bock R. The two largest chloroplast genome-encoded open reading frames of higher plants are essential genes. // Plant J. 2000. V. 22. P. 97. https:doi.org/10.1046/j.1365-313x.2000.00722.xShen H., Qian B., L Yang., Liang W., Chen W., Liu Z., Zhang D. Estimation of the homoplasmy degree for transplastomic tobacco using quantitative real-time PCR // Eur. Food Res. Technol. 2010. V. 231. P. 143. https:doi 10.1007/s00217-010-1265-zYu Q., LaManna L.M., Kelly M.E., Lutz K.A., Maliga P. New tools for engineering the arabidopsis plastid genome // Plant Physiol. 2019. V. 181. P. 394. https:doi.org/10.1104/pp.19.00761Yu Q., Tungsuchat-Huang T., Verma K., Radler M.R., Maliga P. Independent translation of ORFs in dicistronic operons, synthetic building blocks for polycistronic chloroplast gene expression // Plant J. 2020. V. 103. P. 2318. https:doi.org/10.1111/tpj.14864Herz S., Füßl M., Steiger S. Koop H.-U. Development of novel types of plastid transformation vectors and evaluation of factors controlling expression // Transgenic Res. 2005. V. 14. P. 969. https:doi.org/10.1007/s11248-005-2542-7Tangphatsornruang S., Birch-Machin I., Newell C.A., Gray J.C. The effect of different 3′ untranslated regions on the accumulation and stability of transcripts of a gfp transgene in chloroplasts of transplastomic tobacco // Plant Mol. Biol. 2011. V. 76. P. 385. https:doi.org/10.1007/s11103-010-9689-1Dhingra A., Daniell H. Chloroplast genetic engineering via organogenesis or somatic embryogenesis // Meth. Mol. Biol. 2006. V. 323. P. 245. https:doi:10.1385/1-59745-003-0:245.Ruhlman T., Verma D., Samson N., Daniell H. The role of heterologous chloroplast sequence elements in transgene integration and expression // Plant Physiol. 2010. V. 152. P. 2088. https:doi.org/10.1104/pp.109.152017Lacroix B., Citovsky V. Biolistic approach for transient gene expression studies in plants // Meth. Mol. Biol. 2020. V. 2124. P. 125. https:doi.org/10.1007/978-1-0716-0356-7_6Hibberd J.M., Linley Ph.J., Khan M.S., Gray J.C. Transient expression of green fluorescent protein in various plastid types following microprojectile bombardment // Plant J. 1998. V. 16. P. 627. https:doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00328.xKwak S.Y., Lew T.T.S., Sweeney C.J., Koman V.B., Wong M.H., Bohmert-Tatarev K., Snell K.D., Seo J.S., Chua N.H., Strano M.S. Chloroplast-selective gene delivery and expression in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers // Nat. Nanotech. 2019. V. 14. P. 447. https:doi.org/10.1038/s41565-019-0375-4Daniell H., Ruiz G., Denes B., Sandberg L., Langridge W. Optimization of codon composition and regulatory elements for expression of human insulin like growth factor-1 in transgenic chloroplasts and evaluation of structural identity and function // BMC Biotech. 2009. V. 9. Р. 33. https:doi.org/10.1186/1472-6750-9-33Khakhlova O., Bock R. Elimination of deleterious mutations in plastid genomes by gene conversion. // Plant J. 2006. V. 46. P. 85. https:doi.org/10.1111/j.1365-313X.2006.02673.xGerasymenko I.M., Sheludko Y.V., Klebanovych A.A., Rudas V.A., Shakhovsky A.M., Klein T.M., Kuchuk N.V. Comparison of effectiveness of 5′-regulatory sequences in transplastomic tobacco chloroplasts // Transgenic Res. 2017. V. 26. P. 65. https:doi.org/10.1007/s11248-016-9980-2Sheludko Y.V., Gerasymenko I.M., Herrmann F.J., Warzecha H. Evaluation of biotransformation capacity of transplastomic plants and hairy roots of Nicotiana tabacum expressing human cytochrome P450 2D6 // Transgenic Res. 2022. V. 31. P. 351. https:doi.org/10.1007/s11248-022-00305-xWang Y., Wei Zh., Fan J., Song X., Xing Sh. Hyper-expression of GFP-fused active hFGF21 in tobacco chloroplasts // Protein Expr. Purif. 2023. V. 208. Р. 106271. https:doi.org/10.1016/j.pep.2023.106271.Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., Borchers A.-M.I., Maloney A.P., Kavanagh T.A., Gray J.C., Bock R. High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes // Plant Biotech. J. 2008. V. 6. P. 897. https:doi.org/10.1111/j.1467-7652.2008.00356.xKwon K.-C., Chan H.-T., Leon I.R., Williams-Carrier R., Barkan A., Daniell H. Codon optimization to enhance expression yields insights into chloroplast translation // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 62. https:doi.org/10.1104/pp.16.00981