Advances in Chemical PhysicsAdvances in Chemical PhysicsФизиология растений0015-33033034-624XThe Russian Academy of Sciences26947810.31857/S0015330324050091MMAQSHЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleЭффект неполного нокаутирования гена пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1 на метаболизм углеводов и каротиноидов в листьях Nicotiana tabacum L.Эффект неполного нокаутирования гена пластидной крахмалфосфорилазы NtPHO1-L1 на метаболизм углеводов и каротиноидов в листьях Nicotiana tabacum L.НеждановаА. В.
Russian Federation
kulakova_97@mail.ruКулаковаА. В.
Russian Federation
kulakova_97@mail.ruСлугинаМ. А.
Russian Federation
kulakova_97@mail.ruКамионскаяА. М.
Russian Federation
kulakova_97@mail.ruКочиеваЕ. З.
Russian Federation
kulakova_97@mail.ruЩенниковаА. В.
Russian Federation
kulakova_97@mail.ruИнститут биоинженерии им. К.Г. Скрябина Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук15092024715Генетическая инженерия растений – достижения и перспективы6046191111202411112024Copyright ©; 2024, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2024, Российская академия наук2024Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.rcsi.science/0015-3303/article/view/269478

Метаболизм крахмала регулируется сложной каталитической сетью, одним из ключевых ферментов которой является пластидная крахмалфосфорилаза PHO1. В нашем исследовании с использованием системы CRISPR-Cas9 были получены растения табака (Nicotiana tabacum L.) с неполным нокаутом гена NtPHO1-L1 за счет делеционных вариантов каталитического домена белка NtPHO1-L1, приводящих к формированию нефункциональных форм фермента. Редактированные линии отличались от растений дикого типа повышенным накоплением крахмала и пониженным содержанием сахаров, хлорофиллов и каротиноидов в ткани листа. Показано, что в сравнении с контролем редактированные растения характеризовались дифференциальной экспрессией генов метаболизма крахмала (NtPHO1-L1, NtGWD, NtBAM1, NtBAM9, NtAI) и каротиноидов (NtPSY2, NtPDS, NtZDS, NtCRTISO, NtVDE), а также генов, кодирующих MADS-доменные транскрипционные факторы (NtFUL1, NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3), которые предположительно участвуют в регуляции транскрипции исследуемых генов метаболизма. Предположено, что неполный нокаут NtPHO1-L1 приводит к изменению функциональной активности крахмалфосфорилазы табака. Это, в свою очередь, может влиять на скоординированную работу ферментов катаболизма крахмала, а также синтеза хлорофиллов и каротиноидов, возможно, за счет дифференциальной экспрессии MADS-box генов. Наши результаты подчеркивают критическую регуляторную роль пластидной крахмалфосфорилазы в метаболизме транзиторного крахмала, а также в стимулирующем влиянии на фотосинтез растения.

Метаболизм крахмала регулируется сложной каталитической сетью, одним из ключевых ферментов которой является пластидная крахмалфосфорилаза PHO1. В нашем исследовании с использованием системы CRISPR-Cas9 были получены растения табака (Nicotiana tabacum L.) с неполным нокаутом гена NtPHO1-L1 за счет делеционных вариантов каталитического домена белка NtPHO1-L1, приводящих к формированию нефункциональных форм фермента. Редактированные линии отличались от растений дикого типа повышенным накоплением крахмала и пониженным содержанием сахаров, хлорофиллов и каротиноидов в ткани листа. Показано, что в сравнении с контролем редактированные растения характеризовались дифференциальной экспрессией генов метаболизма крахмала (NtPHO1-L1, NtGWD, NtBAM1, NtBAM9, NtAI) и каротиноидов (NtPSY2, NtPDS, NtZDS, NtCRTISO, NtVDE), а также генов, кодирующих MADS-доменные транскрипционные факторы (NtFUL1, NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3), которые предположительно участвуют в регуляции транскрипции исследуемых генов метаболизма. Предположено, что неполный нокаут NtPHO1-L1 приводит к изменению функциональной активности крахмалфосфорилазы табака. Это, в свою очередь, может влиять на скоординированную работу ферментов катаболизма крахмала, а также синтеза хлорофиллов и каротиноидов, возможно, за счет дифференциальной экспрессии MADS-box генов. Наши результаты подчеркивают критическую регуляторную роль пластидной крахмалфосфорилазы в метаболизме транзиторного крахмала, а также в стимулирующем влиянии на фотосинтез растения.

Nicotiana tabacumCRISPR-Cas9крахмалфосфорилазаметаболизм крахмалаэкспрессия геновМинистерство науки и высшего образования Российской ФедерацииMinistry of Science and Higher Education of the Russian FederationZeeman S.C., Smith S.M., Smith A.M. The diurnal metabolism of leaf starch // Biochem. J. 2007. V. 401. P. 13. https:doi.org/10.1042/BJ20061393Lloyd J.R., Kossmann J. Starch trek: the search for yield // Front. Plant Sci. 2019. V. 9: 1930. https:doi.org/10.3389/fpls.2018.01930Thalmann M., Santelia D. Starch as a determinant of plant fitness under abiotic stress // New Phytol. 2017. V. 214. P. 943. https:doi.org/10.1111/nph.14491Shoaib N., Liu L., Ali A., Mughal N., Yu G., Huang Y. Molecular functions and pathways of plastidial starch phosphorylase (PHO1) in starch metabolism: current and future perspectives // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22: 10450. https:doi.org/10.3390/ijms221910450Lütken H., Lloyd J.R., Glaring M.A., Baunsgaard L., Laursen K.H., Haldrup A., Kossmann J., Blennow A. Repression of both isoforms of disproportionating enzyme leads to higher malto-oligosaccharide content and reduced growth in potato // Planta. 2010. V. 232. P. 1127. https:doi.org/10.1007/s00425-010-1245-3Rathore R.S., Garg N., Garg S., Kumar A. Starch phosphorylase: role in starch metabolism and biotechnological applications // Crit. Rev. Biotechnol. 2009. V. 29. P. 214. https:doi.org/10.1080/07388550902926063Cuesta-Seijo J.A., Ruzanski C., Krucewicz K., Meier S., Hägglund P., Svensson B., Palcic M.M. Functional and structural characterization of plastidic starch phosphorylase during barley endosperm development // PLoS One. 2017. V. 12: e0175488. https:doi.org/10.1371/journal.pone.0175488Flores-Castellanos J., Fettke J. The plastidial glucan phosphorylase affects the maltooligosaccharide metabolism in parenchyma cells of potato (Solanum tuberosum L.) tuber discs // Plant Cell Physiol. 2023. V. 64. P. 422. https:doi.org/10.1093/pcp/pcac174Sonnewald U., Basner A., Greve B., Steup M. A second L-type isozyme of potato glucan phosphorylase: cloning, antisense inhibition and expression analysis // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 567. https:doi.org/10.1007/BF00019322Chen H.M., Chang S.C., Wu C.C., Cuo T.S., Wu J.S., Juang R.H. Regulation of the catalytic behaviour of L-form starch phosphorylase from sweet potato roots by proteolysis // Physiol. Plant. 2002. V. 114. P. 506. https:doi.org/10.1034/j.1399-3054.2002.1140402.xCamirand A., St-Pierre B., Marineau C., Brisson N. Occurrence of a copia-like transposable element in one of the introns of the potato starch phosphorylase gene // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 33. https:doi.org/10.1007/BF00259448Fettke J., Poeste S., Eckermann N., Tiessen A., Pauly M., Geigenberger P., Steup M. Analysis of cytosolic heteroglycans from leaves of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants that under- or overexpress the Pho 2 phosphorylase isozyme // Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 1987. https:doi.org/10.1093/pcp/pci214Schopper S., Mühlenbock P., Sörensson C., Hellborg L., Lenman M., Widell S., Fettke J., Andreasson E. Arabidopsis cytosolic alpha-glycan phosphorylase, PHS2, is important during carbohydrate imbalanced conditions // Plant Biol.. 2015. V. 17. P. 74. https:doi.org/10.1111/plb.12190Zeeman S.C., Thorneycroft D., Schupp N., Chapple A., Weck M., Dunstan H., Haldimann P., Bechtold N., Smith A.M., Smith S.M. The role of plastidial α-glucan phosphorylase in starch degradation and tolerance of abiotic stress in Arabidopsis leaves // Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 849. https:doi.org/10.1104/pp.103.032631Satoh H., Shibahara K., Tokunaga T., Nishi A., Tasaki M., Hwang S.-K., Okita T., Kaneko N., Fujita N., Yoshida M., Hosaka Y., Sato A., Utsumi Y., Ohdan T., Nakamura Y. Mutation of the plastidial α-glucan phosphorylase gene in rice affects the synthesis and structure of starch in the endosperm // Plant Cell. 2008. V. 20. P. 1833. https:doi.org/10.1105/tpc.107.054007Yu Y., Mu H.H., Wasserman B.P., Carman G.M. Identification of the maize amyloplast stromal 112-kd protein as a plastidic starch phosphorylase // Plant Physiol. 2001. V. 125. P. 351. https:doi.org/10.1104/pp.125.1.351Mizuno S., Kamiyoshihara Y., Shiba H., Shinmachi F., Watanabe K., Tateishi A. Plastidial starch phosphorylase is highly associated with starch accumulation process in developing squash (Cucurbita sp.) fruit // Physiol. Plant. 2019. V. 167. P. 264. https:doi.org/10.1111/ppl.12886Hwang S.K., Singh S., Cakir B., Satoh H., Okita T.W. The plastidial starch phosphorylase from rice endosperm: catalytic properties at low temperature // Planta. 2016. V. 243. P. 999. https:doi.org/10.1007/s00425-015-2461-7Fettke J., Leifels L., Brust H., Herbst K., Steup M. Two carbon fluxes to reserve starch in potato (Solanum tuberosum L.) tuber cells are closely interconnected but differently modulated by temperature // J. Exp. Bot. 2012. V. 63. P. 3011. https:doi.org/10.1093/jxb/ers014Orawetz T., Malinova I., Orzechowski S., Fettke J. Reduction of the plastidial phosphorylase in potato (Solanum tuberosum L.) reveals impact on storage starch structure during growth at low temperature // Plant Physiol. Biochem. 2016. V. 100. P. 141. https:doi.org/10.1016/j.plaphy.2016.01.013Higgins J.E., Kosar‐Hashemi B., Li Z., Howitt C.A., Larroque O., Flanagan B., Morell M.K., Rahman S. Characterization of starch phosphorylases in barley grains // J. Sci. Food Agric. 2013. V. 93. P. 2137. https:doi.org/10.1002/jsfa.6019Schreiber L., Nader-Nieto A.C., Schönhals E.M., Walkemeier B., Gebhardt C. SNPs in genes functional in starch-sugar interconversion associate with natural variation of tuber starch and sugar content of potato (Solanum tuberosum L.) // G3: Genes, Genomes, Genetics. 2014. V. 4. P. 1797. https:doi.org/10.1534/g3.114.012377Albrecht T., Koch A., Lode A., Greve B., Schneider-Mergener J., Steup M. Plastidic (Pho1-type) phosphorylase isoforms in potato (Solanum tuberosum L.) plants: expression analysis and immunochemical characterization // Planta. 2001. V. 213. P. 602. https:doi.org/10.1007/s004250100525Slugina M.A., Shchennikova A.V., Kochieva E.Z. The expression pattern of the Pho1a genes encoding plastidic starch phosphorylase correlates with the degradation of starch during fruit ripening in green-fruited and red-fruited tomato species // Funct. Plant Biol. 2019. V. 46. P. 1146. https:doi.org/10.1071/FP18317Slugina M.A., Meleshin A.A., Kochieva E.Z., Shchennikova A.V. The opposite effect of low temperature on the Pho1a starch phosphorylase gene expression in Solanum tuberosum L. tubers and Petota species leaves // Am. J. Potato Res. 2020. V. 97. P. 78. https:doi.org/10.1007/s12230-019-09758-zNezhdanova A.V., Efremov G.I., Slugina M.A., Kamionskaya A.M., Kochieva E.Z., Shchennikova A.V. Effect of a radical mutation in plastidic starch phosphorylase PHO1a on potato growth and cold stress response // Horticulturae. 2022. V. 8: 730. https:doi.org/10.3390/horticulturae8080730Sharma S., Friberg M., Vogel P., Turesson H., Olsson N., Andersson M., Hofvander P. Pho1a (plastid starch phosphorylase) is duplicated and essential for normal starch granule phenotype in tubers of Solanum tuberosum L. // Front. Plant Sci. 2023. V. 14: 1220973. https:doi.org/10.3389/fpls.2023.1220973Jacobs T.B., LaFayette P.R., Schmitz R.J., Parrott W.A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9 // BMC Biotechnol. 2015. V. 15: 16. https:doi.org/10.1186/s12896-015-0131-2Nezhdanova A.V., Slugina M.A., Kulakova A.V., Kamionskaya A.M., Kochieva E.Z., Shchennikova A.V. Effect of mosaic knockout of phytoene desaturase gene NtPDS on biosynthesis of carotenoids in Nicotiana tabacum L.// Russ. J. Plant Physiol. 2023. V. 70: 116. https:doi.org/10.1134/S1021443723601271Slugina M.A. Transcription factor RIPENING INHIBITOR and its homologs in regulation of fleshy fruit ripening of various plant species // Russ. J. Plant Physiol. 2021. V. 68: 783. https:doi.org/10.1134/S1021443721050186Parenicová L., de Folter S., Kieffer M., Horner D.S., Favalli C., Busscher J., Cook H.E., Ingram R.M., Kater M.M., Davies B., Angenent G.C., Colombo L. Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family in Arabidopsis: new openings to the MADS world // Plant Cell. 2003. V. 15. P. 1538. https:doi.org/10.1105/tpc.011544AbdElgawad H., Avramova V., Baggerman G., Van Raemdonck G., Valkenborg D., Van Ostade X., Guisez Y., Prinsen E., Asard H., Van den Ende W., Beemster G.T.S. Starch biosynthesis contributes to the maintenance of photosynthesis and leaf growth under drought stress in maize // Plant Cell Environ. 2020. V. 43. P. 2254. https:doi.org/10.1111/pce.13813Hou J., Zhang H., Liu J., Reid S., Liu T., Xu S., Tian Z., Sonnewald U., Song B., Xie C. Amylases StAmy23, StBAM1 and StBAM9 regulate cold-induced sweetening of potato tubers in distinct ways // J. Exp. Bot. 2017. V. 68. P. 2317. https:doi.org/10.1093/jxb/erx076Zhang H., Liu J., Hou J., Yao Y., Lin Y., Ou Y., Song B., Xie C. The potato amylase inhibitor gene SbAI regulates cold-induced sweetening in potato tubers by modulating amylase activity // Plant Biotech. J. 2014. V. 12. P. 984. https:doi.org/10.1111/pbi.12221Rosas-Saavedra C., Stange C. Biosynthesis of carotenoids in plants: enzymes and color // Subcell. Biochem. 2016. V. 79. P. 35. https:doi.org/10.1007/978-3-319-39126-7_2Cordenunsi-Lysenko B.R., Nascimento J.R.O., Castro-Alves V.C., Purgatto E., Fabi J.P., Peroni-Okyta F.H.G. The starch is (not) just another brick in the wall: the primary metabolism of sugars during banana ripening // Front. Plant Sci. 2019. V. 10: 391. https:doi.org/10.3389/fpls.2019.00391