Advances in Chemical PhysicsAdvances in Chemical PhysicsФизиология растений0015-33033034-624XThe Russian Academy of Sciences26945710.31857/S0015330324050023MNDXFMОБЗОРЫReview ArticleТранзиентная экспрессия генов в растениях ‒ эффективная экспериментальная платформа для функциональной геномикиТранзиентная экспрессия генов в растениях ‒ эффективная экспериментальная платформа для функциональной геномикиГолденкова-ПавловаИ. В.
Russian Federation
irengold58@gmail.comПавленкоО. С.
Russian Federation
irengold58@gmail.comДемьянчукИ. С.
Russian Federation
irengold58@gmail.comФридманВ. А.
Russian Federation
irengold58@gmail.comТюринА. А.
Russian Federation
irengold58@gmail.comФедеральное государственное бюджетное научное учреждение Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук15092024715Генетическая инженерия растений – достижения и перспективы5025191111202411112024Copyright ©; 2024, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2024, Российская академия наук2024Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.rcsi.science/0015-3303/article/view/269457

Большой массив данных об экспрессии генов растений, накопленный благодаря сравнительным исследованиям, направляет усилия исследователей для изучения тонких механизмов влияния целевых генов и, как следствие, на разработку относительно простых и одновременно эффективных подходов, позволяющих понять физиологическую роль белковых продуктов гена. Многочисленные исследования убедительно продемонстрировали эффективность стратегии транзиентной экспрессии для характеристики функций генов растений. Цели обзора: (i) рассмотреть преимущества и ограничения различных растительных систем и методов временной экспрессии, используемых для выяснения роли генных продуктов; (ii) обобщить текущие данные об использовании подходов к временной экспрессии для понимания тонких механизмов, лежащих в основе функции генов; (iii) описать достижения в области эффективной временной экспрессии генов растений. В обзоре обсуждаются основные и критические этапы каждого из методов транзиентной экспрессии генов у растений, области их применения, а также основные результаты, полученные с использованием растительных объектов и их вклад в наши знания о тонких механизмах функций генов, лежащих в основе роста и развития растений, включая выяснение механизмов, регулирующих сложные метаболические пути.

Большой массив данных об экспрессии генов растений, накопленный благодаря сравнительным исследованиям, направляет усилия исследователей для изучения тонких механизмов влияния целевых генов и, как следствие, на разработку относительно простых и одновременно эффективных подходов, позволяющих понять физиологическую роль белковых продуктов гена. Многочисленные исследования убедительно продемонстрировали эффективность стратегии транзиентной экспрессии для характеристики функций генов растений. Цели обзора: (i) рассмотреть преимущества и ограничения различных растительных систем и методов временной экспрессии, используемых для выяснения роли генных продуктов; (ii) обобщить текущие данные об использовании подходов к временной экспрессии для понимания тонких механизмов, лежащих в основе функции генов; (iii) описать достижения в области эффективной временной экспрессии генов растений. В обзоре обсуждаются основные и критические этапы каждого из методов транзиентной экспрессии генов у растений, области их применения, а также основные результаты, полученные с использованием растительных объектов и их вклад в наши знания о тонких механизмах функций генов, лежащих в основе роста и развития растений, включая выяснение механизмов, регулирующих сложные метаболические пути.

белок-белковые взаимодействиягеномное редактированиелокализация белковрастительные системытранзиентная экспрессияфункции геновМинистерство науки и высшего образования Российской ФедерацииMinistry of Science and Higher Education of the Russian Federation122042700043-9Viacheslavova A.O., Berdichevets I.N., Tiurin A.A., Shimshilashvili K.R., Mustafaev O., Goldenkova-Pavlova I. V. Expression of heterologous genes in plant systems: new possibilities. // Genetika. 2012. V. 48. P. 1245. https://doi.org/10.1134/S1022795412110130Hwang H.-H., Yu M., Lai E.-M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications // Arabidopsis Book. 2017. V. 15. P. e0186. https://doi.org/10.1199/tab.0186Wu H.Y., Liu K.H., Wang Y.C., Wu J.F., Chiu W.L., Chen C.Y., Wu S.H., Sheen J., Lai E.M. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings // Plant Methods. 2014. V. 10. P. 1. https://doi.org/10.1186/1746-4811-10-19/FIGURES/10Tsuda K., Qi Y., Nguyen L. V., Bethke G., Tsuda Y., Glazebrook J., Katagiri F. An efficient Agrobacterium-mediated transient transformation of Arabidopsis // Plant J. 2012. V. 69. P. 713. https://doi.org/10.1111/J.1365-313X.2011.04819.XJones H.D., Doherty A., Sparks C.A. Transient transformation of plants // Methods Mol. Biol. 2009. V. 513. P. 131. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-427-8_8Kaur M., Manchanda P., Kalia A., Ahmed F.K., Nepovimova E., Kuca K., Abd-Elsalam K.A. Agroinfiltration mediated scalable transient gene expression in genome edited crop plants // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 10882. https://doi.org/10.3390/IJMS221910882Zagorskaya A.A., Deineko E. V. Suspension-cultured plant cells as a platform for obtaining recombinant proteins // Russ. J. Plant Physiol. 2017. V. 64. P. 795. https://doi.org/10.1134/S102144371705017X/METRICSRivero L., Scholl R., Holomuzki N., Crist D., Grotewold E., Brkljacic J. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses // Methods Mol. Biol. 2014. V. 1062. P. 3. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-580-4_1Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. Magnifection ‒ a new platform for expressing recombinant vaccines in plants // Vaccine. 2005. V. 23. P. 2042. https://doi.org/10.1016/J.VACCINE.2005.01.006Heenatigala P.P.M., Yang J., Bishopp A., Sun Z., Li G., Kumar S., Hu S., Wu Z., Lin W., Yao L., Duan P., Hou H. Development of efficient protocols for stable and transient gene transformation for Wolffia globosa using Agrobacterium // Front. Chem. 2018. V. 6. P. 356676. https://doi.org/10.3389/FCHEM.2018.00227/BIBTEXKrenek P., Samajova O., Luptovciak I., Doskocilova A., Komis G., Samaj J. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: principles, methods and applications // Biotechnol. Adv. 2015. V. 33. P. 1024. https://doi.org/10.1016/J.BIOTECHADV.2015.03.012Zhang Y., Chen M., Siemiatkowska B., Toleco M.R., Jing Y., Strotmann V., Zhang J., Stahl Y., Fernie A.R. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species // Plant Commun. 2020. V. 1. P. 100028. https://doi.org/10.1016/J.XPLC.2020.100028Chen Q., Lai H. Gene delivery into plant cells for recombinant protein production // Biomed Res. Int. 2015. V. 2015. P. 32161. https://doi.org/10.1155/2015/932161Jelly N.S., Valat L., Walter B., Maillot P. Transient expression assays in grapevine: a step towards genetic improvement // Plant Biotechnol. J. 2014. V. 12. P. 1231. https://doi.org/10.1111/PBI.12294Guidarelli M., Baraldi E. Transient transformation meets gene function discovery: the strawberry fruit case // Front. Plant Sci. 2015. V. 6. P. 139872. https://doi.org/10.3389/FPLS.2015.00444/BIBTEXCao J., Yao D., Lin F., Jiang M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize // Acta Physiol. Plant. 2014. V. 36. P. 1271. https://doi.org/10.1007/S11738-014-1508-X/FIGURES/6Tan B., Xu M., Chen Y., Huang M. Transient expression for functional gene analysis using Populus protoplasts // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2013. V. 114. P. 11. https://doi.org/10.1007/S11240-013-0299-X/FIGURES/4Burris K.P., Dlugosz E.M., Collins A.G., Stewart C.N., Lenaghan S.C. Development of a rapid, low-cost protoplast transfection system for switchgrass (Panicum virgatum L.) // Plant Cell Rep. 2016. V. 35. P. 693. https://doi.org/10.1007/S00299-015-1913-7Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature. 1987. V. 327. P. 70. https://doi.org/10.1038/327070a0Schmidt M.A., Herman E.M. Characterization and functional biology of the soybean aleurone layer // BMC Plant Biol. 2018. V. 18. P. 1. https://doi.org/10.1186/S12870-018-1579-8/FIGURES/4Fischer R., Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 279. https://doi.org/10.1023/A:1008975123362Donini M., Marusic C. Current state-of-the-art in plant-based antibody production systems // Biotechnol. Lett. 2019. V. 41. P. 335. https://doi.org/10.1007/S10529-019-02651-ZWang H., Wang W., Zhan J., Huang W., Xu H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes // Sci. Hortic. 2015. V. 191. P. 82. https://doi.org/10.1016/J.SCIENTA.2015.04.039Vaghchhipawala Z., Rojas C.M., Senthil-Kumar M., Mysore K.S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses // Methods Mol. Biol. 2011. V. 678. P. 65. https://doi.org/10.1007/978-1-60761-682-5_6Wang Y.C., Yu M., Shih P.Y., Wu H.Y., Lai E.M. Stable pH suppresses defense signaling and is the key to enhance Agrobacterium-mediated transient expression in Arabidopsis seedlings // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 1. https://doi.org/10.1038/s41598-018-34949-9Shoukat S., Amir Zia M., Ali S. Functional characterization of a novel synthetic herbicide resistance gene in a model plant // Sains Malays. 2023. V. 52. P. 1133. https://doi.org/10.17576/jsm-2023-5204-08Tyurin A.A., Mustafaev O., Suhorukova A. V., Pavlenko O.S., Fridman V.A., Demyanchuk I.S., Goldenkova-Pavlova I. V. Modulation of the translation efficiency of heterologous mRNA and target protein stability in a plant system: the case study of interferon-αA // Plants. 2022. V. 11. P. 2450. https://doi.org/10.3390/PLANTS11192450/S1Hidvégi N., Gulyás A., Teixeira da Silva J.A., Wicaksono A., Kiss E. Promoter analysis of the SPATULA (FvSPT) and SPIRAL (FvSPR) genes in the woodland diploid strawberry (Fragaria vesca L.) // Biol. Futur. 2021. V. 72. P. 373. https://doi.org/10.1007/S42977-021-00089-XSheshukova E.V., Ershova N.M., Lipskerov F.A., Komarova T.V. Enhanced synthesis of foreign nuclear protein stimulates viral reproduction via the induction of γ-thionin expression // Plants. 2022. V. 11. P. 11121530. https://doi.org/10.3390/PLANTS11121530Doan P.P.T., Kim J.H., Kim J. Rapid investigation of functional roles of genes in regulation of leaf senescence using Arabidopsis protoplasts // Front. Plant Sci. 2022. V. 13. P. 818239. https://doi.org/10.3389/FPLS.2022.818239/BIBTEXBerestovoy M., Pavlenko O.S., Tyurin A.A., Gorshkova E.N., Goldenkova-Pavlova I.V. Altered fatty acid composition of Nicotiana benthamiana and Nicotiana excelsior leaves under transient overexpression of the cyanobacterial desC gene // Biol. Plant. 2020. V. 64. P. 167. https://doi.org/10.32615/bp.2019.144Xiao X., Meng F., Satheesh V., Xi Y., Lei M. An Agrobacterium-mediated transient expression method contributes to functional analysis of a transcription factor and potential application of gene editing in Chenopodium quinoa // Plant Cell Rep. 2022. V. 41. P. 1975. https://doi.org/10.1007/S00299-022-02902-WYao X., Qu F., Lewis M.L., Xia I.Y. Assessing herbicide tolerance potential of the rice HIS1 protein in Nicotiana benthamiana and soybean // MS thesis. Ohio State. 2021.Bertazzon N., Raiola A., Castiglioni C., Gardiman M., Angelini E., Borgo M., Ferrari S. Transient silencing of the grapevine gene VvPGIP1 by agroinfiltration with a construct for RNA interference // Plant Cell Rep. 2012. V. 31. P. 133. https://doi.org/10.1007/S00299-011-1147-2Li Q., Ji K., Sun Y., Luo H., Wang H., Leng P. The role of FaBG3 in fruit ripening and B. cinerea fungal infection of strawberry // Plant J. 2013. V. 76. P. 24. https://doi.org/10.1111/TPJ.12272Hua-Ying M., Wen-Ju W., Wei-Hua S., Ya-Chun S., Feng L., Cong-Na L., Ling W., Xu Z., Li-Ping X., You-Xiong Q. Genome-wide identification, phylogeny, and expression analysis of Sec14-like PITP gene family in sugarcane // Plant Cell Rep. 2019. V. 38. P. 637. https://doi.org/10.1007/S00299-019-02394-1Olmedo P., Moreno A.A., Sanhueza D., Balic I., Silva-Sanzana C., Zepeda B., Verdonk J.C., Arriagada C., Meneses C., Campos-Vargas R. A catechol oxidase AcPPO from cherimoya (Annona cherimola Mill.) is localized to the Golgi apparatus // Plant Sci. 2018. V. 266. P. 46. https://doi.org/10.1016/J.PLANTSCI.2017.10.012Zhang X.S., Ni R., Wang P.Y., Zhu T.T., Sun C.J., Lou H.X., Cheng A.X. Isolation and functional characterization of two Caffeoyl Coenzyme A 3-O-methyltransferases from the fern species Polypodiodes amoena // Plant Physiol. Biochem. 2019. V. 136. P. 169. https://doi.org/10.1016/J.PLAPHY.2019.01.021Sun X., Yu G., Li J., Liu J., Wang X., Zhu G., Zhang X., Pan H. AcERF2, an ethylene-responsive factor of Atriplex canescens, positively modulates osmotic and disease resistance in Arabidopsis thaliana // Plant Sci. 2018. V. 274. P. 32. https://doi.org/10.1016/J.PLANTSCI.2018.05.004Hou Y., Lu Q., Su J., Jin X., Jia C., An L., Tian Y., Song Y. Genome-wide analysis of the HDAC gene family and its functional characterization at low temperatures in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 7622. https://doi.org/10.3390/IJMS23147622Tyurin A.A., Kabardaeva K.V., Berestovoy M.A., Sidorchuk Y.V., Fomenkov A.A., Nosov A.V., Goldenkova-Pavlova I.V. Simple and reliable system for transient gene expression for the characteristic signal sequences and the estimation of the localization of target protein in plant cell // Russ. J. Plant Physiol. 2017. V. 64. P. 672. https://doi.org/10.1134/S1021443717040173/METRICSCheng J., Wen S., Xiao S., Lu B., Ma M., Bie Z. Overexpression of the tonoplast sugar transporter CmTST2 in melon fruit increases sugar accumulation // J. Exp. Bot. 2018. V. 69. P. 511. https://doi.org/10.1093/JXB/ERX440Wang B., Wang G., Shen F., Zhu S. A glycine-rich RNA-binding protein, CsGR-RBP3, is involved in defense responses against cold stress in harvested cucumber (Cucumis sativus L.) fruit // Front. Plant Sci. 2018. V. 9. P. 362717. https://doi.org/10.3389/FPLS.2018.00540/BIBTEXWu B., Cao X., Liu H., Zhu C., Klee H., Zhang B., Chen K. UDP-glucosyltransferase PpUGT85A2 controls volatile glycosylation in peach // J. Exp. Bot. 2019. V. 70. P. 925. https://doi.org/10.1093/JXB/ERY419Sasaki N., Takashima E., Nyunoya H. Altered subcellular localization of a tobacco membrane raft-associated remorin protein by tobamovirus infection and transient expression of viral replication and movement proteins // Front. Plant Sci. 2018. V. 9. P. 302384. https://doi.org/10.3389/FPLS.2018.00619Shoji T. Analysis of the intracellular localization of transiently expressed and fluorescently labeled copper-containing amine oxidases, diamine oxidase and N-methylputrescine oxidase in tobacco, using an agrobacterium infiltration protocol // Methods Mol. Biol. 2018. V. 1694. P. 215. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7398-9_20Harris N.N., Luczo J.M., Robinson S.P., Walker A.R. Transcriptional regulation of the three grapevine chalcone synthase genes and their role in flavonoid synthesis in Shiraz // Aust. J. Grape Wine Res. 2013. V. 19. P. 221. https://doi.org/10.1111/AJGW.12026Walker A.R., Lee E., Bogs J., McDavid D.A.J., Thomas M.R., Robinson S.P. White grapes arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes // Plant J. 2007. V. 49. P. 772. https://doi.org/10.1111/J.1365-313X.2006.02997.XCzemmel S., Stracke R., Weisshaar B., Cordon N., Harris N.N., Walker A.R., Robinson S.P., Bogs J. The grapevine R2R3-MYB transcription factor VvMYBF1 regulates flavonol synthesis in developing grape berries // Plant Physiol. 2009. V. 151. P. 1513. https://doi.org/10.1104/PP.109.142059Zhai R., Zhao Y., Wu M., Yang J., Li X., Liu H., Wu T., Liang F., Yang C., Wang Z., Ma F., Xu L. The MYB transcription factor PbMYB12b positively regulates flavonol biosynthesis in pear fruit // BMC Plant Biol. 2019. V. 19. P. 1. https://doi.org/10.1186/S12870-019-1687-0/FIGURES/8Ji X.J., Mao X., Hao Q.T., Liu B.L., Xue J.A., Li R.Z. Splice variants of the castor WRI1 gene upregulate fatty acid and oil biosynthesis when expressed in tobacco leaves // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19. P. 146. https://doi.org/10.3390/IJMS19010146Nogueira M., Enfissi E.M.A., Welsch R., Beyer P., Zurbriggen M.D., Fraser P.D. Construction of a fusion enzyme for astaxanthin formation and its characterisation in microbial and plant hosts: a new tool for engineering ketocarotenoids // Metab. Eng. 2019. V. 52. P. 243. https://doi.org/10.1016/J.YMBEN.2018.12.006Vasav A.P., Godbole R.C., Darshetkar A.M., Pable A.A., Barvkar V.T. Functional genomics-enabled characterization of CYP81B140 and CYP81B141 from Plumbago zeylanica L. substantiates their involvement in plumbagin biosynthesis // Planta. 2022. V. 256. P. 101. https://doi.org/10.1007/S00425-022-04014-XLiu T.Y., Chou W.C., Chen W.Y., Chu C.Y., Dai C.Y., Wu P.Y. Detection of membrane protein-protein interaction in planta based on dual-intein-coupled tripartite split-GFP association // Plant J. 2018. V. 94. P. 426. https://doi.org/10.1111/TPJ.13874Kudla J., Bock R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses // Plant Cell. 2016. V. 28. P. 1002. https://doi.org/10.1105/TPC.16.00043Kerppola T.K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells // Annu. Rev. Biophys. 2008. V. 37. P. 465. https://doi.org/10.1146/ANNUREV.BIOPHYS.37.032807.125842Nam J.C., Bhatt P.S., Kim S.I, Kang H.G. Co-immunoprecipitation for assessing protein-protein interactions in agrobacterium-mediated transient expression system in Nicotiana benthamiana // Methods Mol. Biol. 2023. V. 2690. P. 101. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3327-4_9Zhang Z., Mao Y., Ha S., Liu W., Botella J.R., Zhu J.K. A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis // Plant Cell Rep. 2016. V. 35. P. 1519. https://doi.org/10.1007/S00299-015-1900-ZKościańska E., Kalantidis K., Wypijewski K., Sadowski J., Tabler M. Analysis of RNA silencing in agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum // Plant Mol. Biol. 2005. V. 59. P. 647. https://doi.org/10.1007/S11103-005-0668-XNorkunas K., Harding R., Dale J., Dugdale B. Improving agroinfiltration-based transient gene expression in Nicotiana benthamiana // Plant Methods. 2018. V. 14. P. 1. https://doi.org/10.1186/S13007-018-0343-2/FIGURES/7Yamamoto T., Hoshikawa K., Ezura K., Okazawa R., Fujita S., Takaoka M., Mason H.S., Ezura H., Miura K. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 1. https://doi.org/10.1038/s41598-018-23024-yZheng L., Liu G., Meng X., Li Y., Wang Y. A versatile Agrobacterium-mediated transient gene expression system for herbaceous plants and trees // Biochem Genet. 2012. V. 50. P. 761. https://doi.org/10.1007/S10528-012-9518-0Li J.F., Norville J.E., Aach J., McCormack M., Zhang D., Bush J., Church G.M., Sheen J. Multiplex and homologous recombination–mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9 // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. P. 688. https://doi.org/10.1038/nbt.2654Osakabe Y., Osakabe K. Genome editing to improve abiotic stress responses in plants // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2017. V. 149. P. 99. https://doi.org/10.1016/BS.PMBTS.2017.03.007Huang X., Jia H., Xu J., Wang Y., Wen J., Wang N. Efficient transgene-free genome editing in plants in the T0 generation based on a co-editing strategy // bioRxiv. 2023. P. 2023. https://doi.org/10.1101/2023.03.02.530790Vyacheslavova A.O., Mustafaev O.N., Tyrin A.A., Shimshilashvili K.R., Berdichevets I.N., Shayakhmetova D.M., Goldenkov M.A., Fadeev V.S., Sheludko Y.V., Goldenkova-Pavlova I.V. Set of module vectors for stable or transient expression of heterologous genes in plants // Russ. J. Genet. 2012. V. 48. P. 892. https://doi.org/10.1134/S1022795412090098Matsuo K., Fukuzawa N., Matsumura T. A simple agroinfiltration method for transient gene expression in plant leaf discs // J. Biosci. Bioeng. 2016. V. 122. P. 351. https://doi.org/10.1016/J.JBIOSC.2016.02.001Naji-Talakar S. Plant-derived biopharmaceuticals: overview and success of agroinfiltration // Trends Capstone. 2017. V. 2. P. 1.Juranić M., Nagahatenna D.S.K., Salinas-Gamboa R., Hand M.L., Sánchez-León N., Leong W.H., How T., Bazanova N., Spriggs A., Vielle-Calzada J.P., Koltunow A.M.G., Koltunow A.M.G. A detached leaf assay for testing transient gene expression and gene editing in cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp.) // Plant Methods. 2020. V. 16. P. 1. https://doi.org/10.1186/S13007-020-00630-4/FIGURES/5Vargas-Guevara C., Vargas-Segura C., Villalta-Villalobos J., Pereira L.F.P., Gatica-Arias A. A simple and efficient agroinfiltration method in coffee leaves (Coffea arabica L.): assessment of factors affecting transgene expression // 3 Biotech. 2018. V. 8. P. 471. https://doi.org/10.1007/S13205-018-1495-5Wang W., Vinocur B., Shoseyov O., Altman A. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response // Trends Plant Sci. 2004. V. 9. P. 244. https://doi.org/10.1016/J.TPLANTS.2004.03.006